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FLUORESCENCIA APLICADA A PROTEÍNAS por JoséAntonio Poveda
¿Por qué es tan importante estudiar las proteínas?
En el ámbito de las ciencias de la vida, conforme se ha desarrollado la instrumentación
científica, se ha estudiado desde lo grande o macroscópico hasta lo más pequeño o
microscópico; desde los organismos o estructuras pluricelulares como los órganos o
tejidos, pasando por las células y los orgánulos subcelulares, hasta llegar a las
macromoléculas que los componen, como las proteínas y los ácidos nucleicos (figura 1).
El estudio de estas macromoléculas es un gran desafío científico, puesto que su tamaño
es de pocos nanometros (nm, mil millonésima parte de un metro) y además se
encuentran en entornos muy complejos con multitud de elementos interconectados
como son las células.
La comprensión de la estructura y función de las proteínas es uno de los grandes retos de
la biología después de haber descifrado el genoma humano, puesto que estas
macromoléculas son las que van a ejecutar a nivel molecular la información codificada en
el genoma. Alcanzar este hito, además de permitirnos comprender a nivel molecular
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el genoma. Alcanzar este hito, además de permitirnos comprender a nivel molecular
cómo funcionan las células, es fundamental para descubrir nuevas dianas de interés
farmacológico, es decir, sitios a los que se unirán los fármacos para ejercer su función.
La fluorescencia y las proteínas.
Dentro de este campo de investigación, el uso de la fluorescencia se ha incrementado y
diversificado enormemente en las últimas décadas. Antes de entrar de lleno en las
aplicaciones, conviene entender lo que es la fluorescencia. Ciertas moléculas, llamadas
fluoróforos (como ejemplo ver figura 3), son capaces de absorber fotones de una cierta
longitud de onda, es decir, de un cierto color. Esta absorción, provoca que un electrón de
la molécula que está en su estado fundamental (S0), pase a un estado excitado de mayor
energía. Cuando dicho electrón vuelve al estado fundamental, esa pérdida de energía se
traduce en la emisión de un fotón de cierta longitud de onda (color), característico de
dicho fluoróforo (figura 2).
Si la fluorescencia es simplemente luz emitida por una molécula, ¿por qué es tan
útil para el estudio de las proteínas?
La fluorescencia es un proceso que ocurre en pocos nanosegundos (ns, mil millonésima
de segundo), rango de tiempo en el que ocurren muchos procesos a nivel molecular, y
por ello es sensible a los mismos. De esta manera, la fluorescencia aporta información
muy valiosa sobre estructura y dinámica a escala molecular del sistema que estemos
estudiando. Además de esto, el simple hecho de que una molécula emita luz de una
determinada longitud de onda, sólo si hacemos incidir sobre ella luz de otra determinada
longitud de onda, hace que sea una técnica que sirva para detectar, localizar e incluso
seguir la trayectoria de aquellas moléculas que presenten fluorescencia, con una alta
resolución espacial y temporal, incluso en entornos complejos como puede ser una célula.
El aminoácido triptófano
En el caso de las proteínas, estas macromoléculas están formadas por la unión en cadena
de muchos aminoácidos, que serían como los eslabones a partir de las que se construyen.
Esta cadena es capaz de plegarse en una estructura tridimensional o estado nativo,
fundamental para poder ejercer su función biológica. Algunos de estos aminoácidos son
en si mismos fluoróforos, como es el caso del triptófano, tirosina y fenilalanina. La
fluorescencia de las proteínas está generalmente dominada por la del triptófano (figura
3), que absorbe luz cerca de 280 nm y que emite luz cerca de los 340 nm, en la región del
ultravioleta. También hay algunas proteínas naturales que contienen otros fluoróforos
que no son aminoácidos. La más conocida es la “green fluorescent protein” o GFP
procedente de la medusa Aequorea victoria y que ha sido ampliamente utilizada para
unirla a otras proteínas y así conferirles fluorescencia en el rango del color verde. De esta
manera se ha podido estudiar su localización e interacciones a nivel celular. Otra
alternativa es modificar químicamente la proteína de interés con un fluoróforo sintético,
lo que nos permite elegir el sitio de la proteína donde ubicarlo y la longitud de onda que
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usaremos para detectarlo. Eso es fundamental
cuando se trata de microscopía de fluorescencia,
sistemas no preparados para trabajar en la región del
ultravioleta, que es la región donde se ha de trabajar
con el triptófano. Como contrapartida, hemos de
comprobar que dicho fluoróforo, o la unión a GFP, no
modifique sustancialmente la estructura y función de
la proteína de interés.
En el caso de la fluorescencia del triptófano, se ha aprovechado su alta sensibilidad al
“ambiente químico” a su alrededor, para desarrollar multitud de metodologías con las
que obtener información sobre la estructura y dinámica de las proteínas que lo contienen.
¿Qué información se puede obtener de la fluorescencia de los triptófanos de las
proteínas?
Ciertas características fisicoquímicas del “ambiente” alrededor del triptófano condicionan
el espectro de emisión del mismo, entendiéndose por espectro el rango de longitudes de
onda donde la molécula emite fluorescencia. De esta forma, mediante la toma de este
espectro se puede tener una idea de la localización del triptófano y de cualquier cambio
en la estructura de la proteína que afecte a la zona donde se encuentra. Así, si un
triptófano se encuentra en la superficie de la proteína, expuesto a una disolución acuosa,
su espectro estará desplazado hacia mayores longitudes de onda. Sin embargo, en el caso
de que el triptófano esté en un entorno más resguardado del agua, su espectro estará
desplazado hacia menores longitudes de onda (figura 4). Esta es una propiedad que se ha
utilizado frecuentemente para el estudio del plegamiento y desplegamiento de proteínas,
puesto que la estructura de la proteína alrededor de los triptófanos cambia generalmente
mucho desde el estado plegado o nativo, donde este residuo suele tener un entorno más
resguardado en el interior de la proteína, al desplegado, donde suele estar totalmente
expuesto al entorno acuoso.
También se puede obtener información sobre la estructura proteica alrededor del
triptófano utilizando el “quenching” o apagamiento de fluorescencia, fenómeno por el
que un fluoróforo pierde fluorescencia por su interacción con pequeñas moléculas como
el oxígeno o la acrilamida, o iones pesados como el ioduro (I -). Evidentemente, si un
triptófano se encuentra en la superficie de una proteína, su fluorescencia será apagada
más fácilmente si le añadimos uno de estos compuestos, que si se encuentra en el interior
de la proteína.
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Otra propiedad que puede usarse a la hora de obtener información a nivel molecular de
proteínas, es la anisotropía de fluorescencia del triptófano. Este fenómeno depende de la
capacidad de rotación del fluoróforo durante el tiempo que está en el estado excitado.
Este parámetro nos da información, por un lado sobre el tamaño global de la proteína, y
por otro lado sobre la dinámica (capacidad para moverse) de la región de la proteína
donde se encuentra el triptófano. Estos datos son muy importantes y complementa a los
obtenidos por técnicas como la cristalografía de rayos X, que dan información de muy
alta resolución pero estática sobre la estructura de las proteínas. Además, también se
puede usar para cuantificar la interacción de la proteína de interés con otras proteínas o
macromoléculas, siempre y cuando el tamaño del complejo formado sea suficientemente
más grande que la proteína de interés (figura 5).
FRET, o “fluorescence resonance energy transfer” (transferencia de energía por
resonancia de fluorescencia), es otra propiedad de los fluoróforos que nos permite medir
distancias en el rango de los 150-600 nm, tamaño en el orden de magnitud del diámetro
de muchas proteínas. Por ello, se dice que el FRET es como una regla de medir a nivel
molecular. Para hacer uso de esta técnica, hace falta tener dos sondas fluorescentes, una
que hace de donador de fluorescencia y otra de aceptor. Básicamente, lo que ocurre es
que el donador de fluorescencia absorbe luz de una determinada longitud de onda y,
dependiendo de la distancia que tenga con el aceptor, en vez de emitir luz, le transfiere
esa energía al aceptor, que es el que en realidad emite luz a una longitud de onda
diferente al donador (figura 6). Si medimos esta luz emitida por el aceptor, tras una serie
de cálculos, podemos obtener la distancia entre ambos fluoróforos. Normalmente para
aplicar esta técnica se suele modificar las proteínas de interés con fluoróforos sintéticos
en aquellas posiciones de la proteína de las que queramos obtener la distancia que las
separa. Esto se puede hacer en distintas partes de una misma proteína, o bien, en
proteínas diferentes. Con esta técnica se han obtenido datos estructurales de proteínas y
también se ha podido cuantificar la asociación o co-localización de ciertas proteínas en
distintos compartimentos celulares.
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Por tanto, mediante el uso aislado de alguna de estas técnicas fluorescentes, o varias de
ellas, se pueden obtener datos muy valiosos sobre el tamaño de las proteínas, su
estructura terciaria y cuaternaria, cambios en la estructura de la proteína frente a
diferentes compuestos: agonistas, antagonistas, inhibidores, activadores, etc. También se
pueden obtener datos sobre la unión entre proteínas, unión de proteínas a membrana o a
ligandos, inhibidores, etc. Todos estos datos son muy valiosos a nivel de investigación
básica a la hora de comprender cuál es la estructura y dinámica de las proteínas, cómo
interaccionan entre ellas o con otros componentes celulares, y cómo es el proceso de
plegamiento de las mismas. La comprensión a nivel molecular de todos estos fenómenos
es esencial para el diseño racional de nuevas proteínas de interés médico o
biotecnológico, como por ejemplo proteínas con una estabilidad incrementada a fin de
ser usadas en bioreactores industriales a altas temperaturas. Esta información también es
imprescindible para encontrar nuevas dianas farmacológicas, a partir de las que diseñar
de manera racional nuevas drogas con las que combatir numerosas enfermedades
todavía hoy no tratables o para sustituir fármacos con efectos secundarios indeseados.
JOSE ANTONIO POVEDA LARROSA. Licenciado en Química por
la Universidad de Alicante, España, en 1995. Doctorado en
Ciencias, Instituto de Neurociencias, Universidad Miguel
Hernández, España, 2002. Desde 2008, Profesor Contratado
Doctor en el área de Química-Física del Departamento de
Agroquímica y Medio Ambiente de la Universidad Miguel
Hernández. Investigador del Instituto de Biología Molecular y
Celular desde 2001. Actividad científica principal: estudio de la
relación estructura-función en canales iónicos; efecto de los lípidos y otros moduladores.
Técnicas o especialidades: espectroscopía de fluorescencia en estado estacionario y
resuelta en el tiempo, incluyendo FRET, "quenching", anisotropía, etc.; microscopía
confocal de fluorescencia; purificación y reconstitución de proteínas de membrana;
producción de sistemas artificiales de membrana: bicapas planas en distintos soportes y
liposomas de todo tipo: GUVs, SUVs, LUVs, MLVs; electrofisiología: "patch-clamp".
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