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INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE CIENCIAS MARINAS

BIOLOGÍA REPRODUCTIVA (CALIDAD ESPERMÁTICA Y REGENERACIÓN DEL

ESPERMATÓFORO) DEL LANGOSTINO DE RÍO Macrobrachium americanum ALIMENTADO

CON DIFERENTES DIETAS

TESIS

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRÍA EN CIENCIAS EN MANEJO DE RECURSOS MARINOS

PRESENTA:

BIOL. JUAN CARLOS PÉREZ RODRÍGUEZ

LA PAZ, B.C.S., MÉXICO, DICIEMBRE, 2017

4

AGRADECIMIENTOS

Extiendo mi agradecimiento al Centro Interdisciplinario de Ciencias Marinas del

Instituto Politécnico Nacional (CICIMAR-IPN) por permitirme realizar el programa de

Maestría en Ciencias en Manejo de Recursos Marinos y realizar la investigación del

presente trabajo en sus instalaciones y análisis en sus laboratorios.

A mis directores de tesis Dr. Edilmar Cortés Jacinto (CIBNOR) y Dr. Jaime Gómez

Gutiérrez por su incondicional apoyo para la realización de la presente investigación

experimental, así como a los miembros del Comité Tutorial por su orientacion e ideas

aportadas: Dr. Victor Manuel Gómez Muñoz, Dr. Marcial Arellano Martínez y Dra.

Laura Susana López Greco (Universidad de Buenos Aires, Argentina). Estoy

profundamente agradecido por el total apoyo y permiso de la Dra. Silvie Dumas para

la realización del trabajo experimental en la Unidad Piloto de Maricultivos (UPIMA)

del CICIMAR-IPN así como al M. en C. Mauricio Contreras Olguín por su inestimable

ayuda, consejos e ideas para la realización del experimento.

Agradezco al Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, S.C. (CIBNOR) por

permitirme realizar análisis de muestras en distintos laboratorios. A la Dra. María del

Carmen Rodríguez Jaramillo y a María Eulalia Meza Chávez (Laboratorio de

Histología e Histoquímica) por su apoyo en el análisis de muestras histológicas de la

gónada masculina de langostinos de río; al M. en C. Roberto Hernández Herrera

(Laboratorio de Bioquímica Fisiológica) por los análisis bromatológicos del alimento

usado en los experimentos y al Biol. Mar. Ariel Arturo Cruz Villacorta (Laboratorio de

Microscopia Electrónica) por su ayuda y disposición para los análisis de espermas de

langostino de río de la presente tesis. A los Proyectos SIP-IPN titulados “Estudio

comparativo de parásitos helmintos tróficamente transmitidos de ballena azul y

ballena de aleta en áreas de alimentación invernal (SIP-IPN 20150113, 20160495)” y

“Detección de periodos de desove de peces mediante métodos moleculares y

estructura de la comunidad de zooplancton en el Parque Nacional Cabo Pulmo SIP-

IPN 20171275” otorgaron apoyo financiero complementario para la realización y

análisis de muestras biológicas de la presente investigación. Agradezco al Consejo

Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) por el apoyo financiero a través de los

5

proyectos: CONACyT CB2010/156252, de Infraestructura 2014/ 227565, y proyecto

bi-nacional AMEXCID CTC/06038/14 a cargo de los Drs. Laura Susana López Greco

y Edilmar Cortés Jacinto. Estoy agradecido por la beca de CONACyT para maestría

otorgada al Biólogo Juan Carlos Pérez Rodríguez (740720/596715).

La presente investigación no podría haber sido realizada sin el apoyo del señor

Guadalupe Talamantes y su familia que habitan en San Pedro de la Presa, Baja

California Sur por la colecta de los langostinos de río utilizados en la presente

investigación. A los doctores Dr. Stig Yamasaki Granados, Dr. Yuniel Méndez

Martínez, la Biol. Maritza L. Soberanes Yepiz y al Ing. Rafael Ernesto Caneva Silva

por su apoyo para la captura, alimentación, mantenimiento y toma de muestra de los

especímenes experimentales.

6

ÍNDICE GENERAL

GLOSARIO.........................................................................................................................................7ÍNDICE DE FIGURAS......................................................................................................................9ÍNDICE DE TABLAS.....................................................................................................................12RESUMEN........................................................................................................................................13INTRODUCCIÓN............................................................................................................................15

Antecedentes............................................................................................................................................18Justificación..............................................................................................................................................21Objetivos....................................................................................................................................................22

General........................................................................................................................................................................22Específicos................................................................................................................................................................22

METODOLOGÍA.............................................................................................................................23Trabajo de campo..................................................................................................................................................23Dietas experimentales.........................................................................................................................................26Extracción de espermatóforos y conteo espermático.........................................................................27Producción de espermatóforos.......................................................................................................................29Crecimiento...............................................................................................................................................................30Histología de langostinos macho...................................................................................................................30Microscopía electrónica de barrido...............................................................................................................31Análisis estadísticos.............................................................................................................................................31

RESULTADOS................................................................................................................................32Aspectos generales de reproducción............................................................................................32

Producción de espermatóforos.......................................................................................................................32Composición bioquímica (proteínas, lípidos y carbohidratos) del espermatóforo...............36Efecto de método de extracción de espermatóforo.............................................................................37Calidad espermática.............................................................................................................................................39

Efecto de las dietas................................................................................................................................43Síntesis del análisis de la calidad espermática......................................................................................44Crecimiento...............................................................................................................................................................45Histología del tracto reproductivo en machos.........................................................................................47Morfología fina del espermatóforo y del espermatozoide.................................................................50

DISCUSIÓN.....................................................................................................................................53Biología reproductiva de M. americanum.....................................................................................53

Producción de espermatóforos.......................................................................................................................53Composición bioquímica (proteínas, lípidos y carbohidratos) del espermatóforo...............57Calidad espermática.............................................................................................................................................57Histología del tracto reproductivo en machos y morfología de alta resolución del espermatóforo y espermatozoides................................................................................................................60

Efecto de dietas.......................................................................................................................................61Calidad espermática.............................................................................................................................................61Crecimiento...............................................................................................................................................................62

REFERENCIAS..............................................................................................................................65ANEXOS...........................................................................................................................................70

7

GLOSARIO

Abdomen: Parte posterior del cuerpo a continuación del cefalotórax de los

crustáceos decápodos.

Atarraya: Red con forma redonda para pescar en aguas poco profundas.

Caridea: Infraorden de los crustáceos decápodos conocidos comúnmente

como camarones.

Cefalotórax: Parte del cuerpo de los crustáceos formada por la fusión de la cabeza y

el tórax.

Células de Sertoli: Células ubicadas en los túbulos seminíferos de los testículos,

que brindan soporte estructural y metabólico a las células durante

la espermatogénesis.

Cromatina: Forma en la que se presenta el ADN en el núcleo celular. Es la sustancia

de base de los cromosomas, que corresponde a la asociación de ADN, ARN y

proteínas que se encuentran en el núcleo interfásico de las células y que constituye

el genoma.

Eucromatina: Forma de la cromatina ligeramente compactada (menos que la

heterocromatina) con una gran concentración de genes y a menudo (aunque no

siempre) se encuentra en transcripción activa.

Gonoporo: abertura genital.

Hembra ovígera: Hembra que porta los huevos adheridos a los pleópodos.

8

Hepatopáncreas: Glándula digestiva que realiza funciones semejantes al páncreas e

hígado de los mamíferos.

Heterocromatina: Forma inactiva condensada de la cromatina localizada sobre todo

en la periferia del núcleo que se tiñen fuertemente con coloraciones para ADN.

Larva: Fase de desarrollo posterior a la eclosión del embrión de los animales que

experimentan desarrollo indirecto (con metamorfosis) y que tienen morfología,

anatomía, fisiología y ecología diferente a la del adulto.

Pellet: Nombre genérico para referirse a una mezcla previamente acondicionada

(humedad y temperatura) a través de un molde o matriz con orificios que da forma

cilíndrica a un alimento comprimido.

Pleópodos: Apéndices abdominales de los crustáceos.

Postlarva: Fase ontogenética posterior a la larva y previo a la metamorfosis a

juvenil.

Télico: Modificación de la parte ventral del cefalotórax de la hembra de decápodos

localizado entre el 3° al 5° par de pereiópodos, encontrándose las coxas de estos

dos últimos pares de apéndices más separadas que el resto; en esta estructura es

donde el macho deposita su espermatóforo.

Telson: Segmento ubicado en la parte terminal posterior del abdomen de la mayoría

de los artrópodos.

9

ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. A. Espermatóforo de M. americanum. B. Hembra con espermatóforo

adherido al télico. Tomado de Hernández-Valencia (2010). ............................... 19

Figura 2. San Pedro de la Presa (24º 50’ 53” n, -110º 59’ 38” w; triangulo negro),

municipio de La Paz, Baja California Sur. ........................................................... 24

Figura 3. Dendrograma de clasificación de los 29 langostinos recolectados con corte

a nivel de tres grupos: pequeños (15-45 g) grupo central, medianos (46-80 g)

grupo de la izquierda y grandes (81-130 g) grupo de la derecha. ....................... 25

Figura 4. A. Tanque circular de 600 l de agua dulce donde fueron cultivados 29

langostinos de río machos de M. americanum. B. Tubos de pvc como refugio

para cada individuo. ............................................................................................ 26

Figura 5. Extracción de espermatóforo mediante técnica de electro estimulación. .... 27

Figura 6. Criterios para la clasificación de espermatozoides normales y anormales. 29

Figura 7. Distribución de frecuencia de pesos de 29 machos de Macrobrachium

americanum capturados en el oasis de San Pedro de la Presa, B.C.S., México

utilizados para el experimento de biología reproductiva masculina. ................... 32

Figura 8. Distribución de frecuencia del periodo de formación del espermatóforo por

individuo de M. americanum durante el tiempo experimental de 244 días. ........ 33

Figura 9. A. Porcentaje de producción de espermatóforos y supervivencia de M.

americanum a lo largo del tiempo experimental. B. Valores mínimo, máximo y

promedio del peso de los espermatóforos obtenidos del medio natural (control) y

a lo largo del experimento de 244 días de cultivo. C. Distribución de frecuencia

del peso del espermatóforo de todos los especímenes experimentales. ............ 35

10

Figura 10. Distribución de frecuencia de la proporción del peso del espermatóforo

con respecto al peso total del macho de M. americanum. .................................. 36

Figura 11. Variación de la composición bioquímica promedio del espermatóforo de

macrobrachium americanum en términos de porcentaje de proteínas, lípidos y

carbohidratos totales estimados a lo largo del periodo experimental (combinando

todos los especímenes de cada tratamiento por fecha de extracción). .............. 37

Figura 12. Melanización del espermatóforo. A. Espermatóforo normal. B.

Espermatóforo melanizado. C. Perforación (p) del caparazón en la región de la

cámara branquial de M. americanum. ................................................................. 38

Figura 13. A. Distribución de frecuencia del número de espermatozoides estimado

por cada espermatóforo de M. americanum durante el experimento. B.

Comparación del número de espermatozoides por espermatóforo de M.

americanum registrados en el experimento con respecto al observado en

especímenes recién recolectados en la naturaleza (grupo control). ................... 40

Figura 14. A. Distribución de frecuencia del porcentaje de espermatozoides

anormales observados en el espermatóforo de M. americanum. B. Valores

máximos, mínimos y comparación del porcentaje promedio de espermatozoides

anormales, registrados durante el experimento, con el de langostinos recién

colectados de su medio natural (control), no hubo diferencias significativas entre

promedios. ........................................................................................................... 41

Figura 15. A. Distribución de frecuencia del porcentaje de espermatozoides muertos

observados en el espermatóforo de M. americanum. B. Comparación del

porcentaje de espermatozoides muertos en los espermatóforos de los

langostinos alimentados durante el experimento con los de langostinos recién

colectados del campo (control). ........................................................................... 43

11

Figura 16. Ajuste del modelo potencial de peso-longitud (W=a*Lb) de langostinos

macho de M. americanum. .................................................................................. 47

Figura 17. A. Fotografía de microscopio óptico de testículo de M. americanum teñido

con hematoxilina y eosina mostrando los túbulos seminíferos que lo componen.

B. Túbulos seminíferos, algunos con espermatogonias (Sg) en la periferia. C.

Túbulo seminífero con espermatocitos (Sc) en diversas fases de división celular.

D. Túbulos seminíferos en la parte próxima al conducto deferente (cd) con

espermátidas (St) y los primeros espermatozoides en testículo (Sz). E.

Espermatozoides en testículo (material genético teñido de azul) en forma

semicircular. F. Sección del conducto deferente con espermatozoides maduros

(Sz) de base “aplanada” y rodeados de una secreción protectora (Sp), el epitelio

(Ep) y la capa muscular externa (Mu). H. Conducto deferente con epitelio

columnar (Ec). I. Ámpula terminal y sus dos capas gruesas de músculo liso: una

transversal (Mt) y otra longitudinal (Ml) en el centro epitelio (Ep). ...................... 50

Figura 18. A. Imagen de microscopía electrónica de barrido (MEB) que muestra la

sección ventral y sección dorsal del espermatóforo. B. Sección ventral del

espermatóforo mostrando placas cuadradas. C. Envoltura degradada del

espermatóforo que muestra las fibras transversales que la constituyen. D. Corte

transversal del espermatóforo que muestra el grosor de la envoltura (Ev) que

protege a la masa espermática (Me). E. Vista de masa espermática compuesta

de espermatozoides (Sz). F. Espermatozoide con morfología normal, base (Ba),

espina (Es) y radios (ra). ..................................................................................... 52

12

ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Composición proximal de las dietas ofrecidas diariamente al langostino de

río M. americanum durante el periodo experimental. .......................................... 43

Tabla 2. Valores promedio y error estándar de las variables de calidad espermática

del langostino de río M. americanum alimentado con tres diferentes dietas.

Valores dentro de las columnas con superíndices iguales no son

significativamente diferentes (p >0.05). ............................................................... 44


de los tres intervalos de peso de langostino de río M. americanum utilizados en

este experimento, pequeños (15-45 g), medianos (46-80 g) y grandes (81-130

g). Valores dentro de las columnas con superíndices iguales no son


Tabla 4. Valores promedio y error estándar del incremento de peso en porcentaje y

tasa de crecimiento y el valor final de supervivencia observadas en langostinos

de M. americanum alimentados con cada tipo de dieta experimental. Valores

dentro de las columnas con superíndices iguales no son significativamente

diferentes (p >0.05). ............................................................................................ 46


tasa de crecimiento obtenidos por cada intervalo de peso de adultos (chicos 15-

45 g, medianos 46-80 g y grandes 81-130 g), también se muestra el valor final

de supervivencia de los machos de M. americanum utilizados en este

experimento. Valores dentro de las columnas con superíndices iguales no son


13

RESUMEN Macrobrachium americanum es un langostino de agua dulce, actualmente consumida

y valorada en mercados locales de varios estados de México, sin embargo, el cultivo

experimental y comercial aún no ha podido ser implementado debido a la falta de

conocimientos sobre su biología reproductiva y sobre los requerimientos nutricionales

de los reproductores de M. americanum. Se investigó el efecto de tres dietas (100%

alimento comercial pelletizado Camaronina 35 Purina®; 50:50% de alimento

pelletizado-alimento fresco sardina y calamar y 100% alimento fresco) en la

formación y producción del espermatóforo, así como en la calidad espermática de 29

langostinos macho (15–130 g) recolectados en el oasis de San Pedro de la Presa,

Baja California Sur. Los especímenes fueron cultivados durante 244 días bajo

condiciones controladas de laboratorio, alimentándolos diariamente. La calidad

espermática fue evaluada en promedio cada 24 días mediante el peso del

espermatóforo, la cantidad de espermatozoides; y el porcentaje de espermatozoides

vivos:muertos y con morfología normal:anormal. La calidad espermática de 17

langostinos recién capturados (julio 2017) fue comparada con la obtenida de los

especímenes del presente experimento. No existieron diferencias significativas entre

los promedios de las variables de calidad espermática de las tres dietas. Se

evidenció un agotamiento reproductivo a lo largo del experimento (disminución del

peso del espermatóforo, del porcentaje de espermatóforos producidos y del aumento

del promedio de espermatozoides muertos). Los promedios de las variables de

calidad espermática fueron significativamente más altos en especímenes silvestres

que en los especímenes del experimento. Debido a que no se observaron diferencias

significativas de la calidad espermática entre los tres tipos de dietas, y que el pellet

es menos costoso y más fácil de administrar, se recomienda el uso de alimento

pelletizado para el mantenimiento de machos reproductores de M. americanum.

14

ABSRACT Macrobrachium americanum is a freshwater prawn currently consumed and valued in

several states of Mexico. However, experimental and commercial aquaculture of M.

americanum has not yet been successfully achieved because reproductive biology

and nutritional requirements of broodstock males of M. americanum have been little

studied. The present study investigated the effect of three diets (100% commercial

pellet Camaronina 35 Purina®; 50: 50% pellet-sardine and squid muscle (fresh food)

and 100% fresh food) on the formation and production of spermatophore of 29 prawn

individuals (15-130 g). M. americanum sperm quality was measured from specimens

caught on the oasis San Pedro de la Presa, Baja California Sur (September 2016)

and cultured for 244 days under controlled laboratory conditions. Specimens were fed

daily and sperm quality was measured on average every 24 d by the production of

spermatophores, weight, sperm count and percentage of live/dead spermatozoa and

normal/abnormal morphology. The average sperm quality of 17 recently caught prawn

(control, July 2017) was compared to those obtained from the specimens fed with

three feeding treatments. There were no significant differences of means of the sperm

quality variables among the three diets. Only the spermatophore weight had

significant differences between control individuals and prawns fed with fresh food.

Reproductive depletion was evidenced throughout the experiment (decreasing the

spermatophore weight, percentage of spermatophores produced and increase in the

proportion of dead sperms). Average sperm quality was higher in wild specimens than

in specimens fed under experimental diets. Because no significant differences were

observed in reproductive variables among diets and because pellet is cheaper and

easier to use, it is highly recommended the use of pelletized camaronina for the

maintenance of M. americanum broodstock males.

15

INTRODUCCIÓN En México se han registrado doce especies nativas de langostinos del género

Macrobrachium (Spence Bate, 1868) más una especie introducida desde el Indo-

Pacífico, Macrobrachium rosenbergii (de Man, 1879). Cinco de estas especies

habitan en cuerpos de agua dulce de cuencas cercanas a las costas del Océano

Pacífico: M. americanum, M. tenellum (Smith, 1871), M. digueti (Bouvier, 1895), M.

occidentale Holthuis, 1950, y M. hobbsi (Villalobos Hiriart & Nates Rodríguez, 1990)

(Álvarez, 1997). Las otras seis especies que habitan las costas del Golfo de México y

Océano Atlántico son: Macrobrachium carcinus (Linnaeus, 1758), M. acanthurus

(Wiegmann, 1836), M. heterochirus (Wiegmann, 1836), M. olfersii (Wiegmann,

1836), M. villalobosi H.H. Jr. Hobbs, 1973 y M. acherontium Holthuis, 1977 (Álvarez,

1997).

El langostino de río M. americanum es actualmente consumido de manera

regional y valorado en mercados locales de varios estados de México. Esta especie

es capturada con trampas, atarrayas y de forma manual por los pobladores ribereños

para consumo personal, para venta local en fresco o congelado (Pérez et al., 2006).

M. americanum es también comúnmente incluida en platillos gastronómicos servidos

en restaurantes y hoteles, incluso existen registros de su venta en mercados de

Guatemala y El Salvador (Díaz-Monge, 2011).

El valor comercial y gastronómico atribuido a M. americanum se debe a que es

una de las especies del género Macrobrachium que alcanza mayor talla (<290 mm

del rostro al telson) llegando a pesar hasta 0.5 kg (Arana-Magallón & Ortega-Salas,

2004). M. americanum es una especie ampliamente distribuida a lo largo de la costa

del Pacífico de América, desde el norte de México hasta el norte de Perú (Arana-

Magallón & Ortega-Salas, 2004). Esta especie tiene alta producción de huevos

(900,000 huevos por año en promedio) (Cabrera-Jiménez et al., 1979). Los machos

poseen quelas grandes y robustas haciéndolos más apetecibles y valorados por los

comensales. El abdomen de M. americanum de ambos sexos es proporcionalmente

más grande en relación con el cefalotórax de otras especies del género

Macrobrachium, los cuales usualmente tienen un abdomen menor a un tercio de su

longitud total (De la Cruz, 1968).

16

El cultivo experimental y comercial de M. americanum aún no ha sido

implementado con éxito debido al desconocimiento de varios aspectos básicos de su

biología, ecología y fisiología. Los esfuerzos realizados para su cultivo bajo

condiciones controladas han resultado, hasta ahora, en deficientes tasas de

supervivencia larval (García-Guerrero et al., 2013; Yamasaki-Granados et al., 2013).

De la Cruz (1968) indicó que uno de los principales impedimentos para realizar

cultivo experimental y comercial de M. americanum era el escaso suministro de

postlarvas. Los primeros intentos por resolver este problema aún dependen de la

obtención de larvas a partir de hembras ovígeras silvestres. Esta es una solución

impráctica debido a la lejanía de su hábitat natural y porque esta extracción puede

afectar a las poblaciones naturales. Lo cierto es que hasta ahora aún no existe

solución al problema de la alta mortalidad larval en los cultivos.

Adquirir mayor información y comprensión de la biología reproductiva y de la

condición de los reproductores posiblemente ayude a mejorar la condición y tasa de

supervivencia de las larvas. Racotta et al. (2003) concluyeron que la condición de las

larvas de camarón está estrechamente relacionada con la condición de salud y

fisiología de sus progenitores. Una alimentación balanceada y condiciones favorables

de cultivo posiblemente favorezcan la obtención de lotes más grandes y homogéneos

en tamaño de larvas con los cuales realizar adicionales investigaciones de biología

larval para posteriormente desarrollar técnicas adecuadas de cultivo para M.

americanum.

La nutrición es uno de los principales factores que influencian la condición de

los reproductores porque promueve la maduración sexual, e influye en la condición

morfológica y fisiológica de los gametos. La formación de gametos conlleva la

síntesis y movilización de nutrientes, principalmente del hepatopáncreas a la gónada.

Debido a que las hembras realizan una mayor movilización e inversión de energía y

biomasa en el desarrollo de la gónada durante la reproducción que los machos, la

oogénesis y producción de huevos ha sido el objetivo de la mayor parte de los

esfuerzos de investigación sobre el efecto de la nutrición en la oogénesis. Esta

argumentación ha pospuesto los esfuerzos de investigación sobre el efecto de la

nutrición en el desarrollo gonádico de los reproductores machos.

17

La dieta usualmente utilizada para mantenimiento de reproductores de

camarón en cautiverio incluye alimento fresco, con o sin la adición de alimento

pelletizado comercial. Existe evidencia experimental de que el uso exclusivo del

alimento pelletizado durante la maduración gonádica causa baja producción de

huevos en comparación con la maduración obtenida mediante el uso de dietas

compuestas de alimento fresco con alto contenido en proteínas y ácidos grasos

poliinsaturados (Wouters et al., 2001). Como resultado de estas experiencias, en

varias especies de camarones actualmente se proveen dietas mixtas de alimento

pelletizado y alimento fresco con las cuales se han podido obtener mejores

rendimientos de las hembras reproductoras (Harrison, 1990; Wouters et al., 2001;

New, 2002).

Hasta ahora el langostino malayo, M. rosenbergii, es la especie mejor

estudiada en relación a su mantenimiento en cultivo y biología reproductiva debido a

que ha sido cultivada comercialmente en numerosos países. A pesar de que M.

americanum está filogenéticamente próxima a M. rosenbergii, ambas especies

parecen tener comportamiento y biología reproductiva suficientemente distinta que

no permite aplicar directamente el conocimiento generado de M. rosenbergii a M.

americanum. Los machos de M. americanum parecen ser más agresivos y caníbales

que M. rosenbergii. Actualmente no existe información publicada sobre la

espermatogénesis y la calidad reproductiva de M. americanum. New (2002)

recomendó que la mitad de la ración del alimento de especímenes reproductores de

M. rosenbergii debe ser pellet comercial y la otra mitad, hígado de res o calamar

suministrado al menos dos veces por semana. Existe una equivalencia de consumo

de un kilogramo de alimento fresco y 200 g de alimento pelletizado debido al alto

porcentaje de agua en el alimento fresco. De esta forma es imprescindible obtener la

calidad reproductiva de los crustáceos hembras y machos mediante dietas

específicas, debido a que existe evidencia en camarones, que individuos de cada

sexo tienen distintos requerimientos nutricionales (Racotta et al., 2003).

Una manera indirecta de inferir los requerimientos nutricionales de los

reproductores es mediante el análisis de la composición bioquímica de órganos

implicados en la transferencia y acumulación de nutrientes asociados al proceso

18

reproductivo (Racotta et al., 2003). Por ejemplo, la composición bioquímica del

espermatóforo del macho de M. americanum. La producción del espermatóforo y la

calidad espermática (número total de espermatozoides, proporción de vivos:muertos

y con morfología normal:anormal) son indicadores cuantitativos para evaluar la

eficiencia del alimento para promover el rendimiento reproductivo de machos. Estas

variables reproductivas han sido previamente evaluadas en algunas especies de

camarones peneidos: Penaeus monodon Fabricius, 1798, Penaeus vannamei Boone,

1931, Penaeus schmitti Burkenroad, 1936 y Penaeus paulensis (Pérez-Farfante,

1967) (Ceballos-Vázquez, 2003; Coman et al., 2007; Meunpol et al., 2005; Pérez-Jar,

2005).

En el presente trabajo se investigó si la composición de tres distintas dietas

influencia o no en la formación y producción del espermatóforo, el número y la

proporción de espermatozoides deformes de M. americanum que pudieran afectar la

eficiencia reproductiva. Estos aspectos básicos de la biología reproductiva de M.

americanum permanecen, hasta ahora, prácticamente desconocidos.

Antecedentes

La morfología del sistema reproductor masculino y el proceso de

espermatogénesis de M. americanum aún no ha sido estudiado. Sin embargo, como

en la mayoría de los crustáceos, la gónada masculina se posiciona dorsalmente y

consta de testículos pares parcialmente unidos y un par de conductos genitales que

conducen a los gonoporos. Los testículos de M. rosenbergii tienen numerosos

túbulos seminíferos que contienen células similares a las células de Sertoli y células

germinales en diversas etapas de desarrollo (McLaughlin, 1983; Alfaro-Montoya,

2013). Cada conducto genital está compuesto por el túbulo colector, un conducto

deferente y un conducto eyaculador. Los túbulos seminíferos de los testículos se

fusionan para formar conductos colectores que conectan al conducto deferente, y a

su vez dan origen al conducto eyaculador. El conducto eyaculador tiene un mayor

diámetro que el conducto deferente para la formación y almacenamiento del

espermatóforo localizado justo antes de la salida al exterior del gonoporo. Esta

región es conocida generalmente como ámpula terminal (Krol et al., 1992).

19

Castille & Lawrence (1989) concluyeron que las concentraciones promedio de

los lípidos totales en conductos deferentes, ámpulas terminales y hepatopáncreas no

son significativamente diferentes entre los diferentes estadios del desarrollo gonádico

de machos del camarón Penaeus aztecus Ives, 1891. Ellos también observaron que

las proteínas son el componente predominante en los testículos y en los conductos

deferentes y ámpulas terminales de P. aztecus y P. setiferus (Linnaeus, 1767)

evidenciado por las mayores concentraciones de proteínas en machos maduros en

comparación con los machos inmaduros.

El ámpula terminal, localizada en la parte teminal del conducto deferente,

presenta una capa muscular interna con arreglo longitudinal de sus capas y otra capa

muscular externa con arreglo circular (Poljaroen et al., 2010) involucradas en la

expulsión del espermatóforo durante la transferencia. Los espermatóforos son

estructuras que permiten el empaquetamiento de los espermatozoides dentro de

componentes de protección y adherencia secretados por el epitelio del conducto

deferente, y son transferidos a la hembra durante el proceso de apareamiento. El

espermatóforo es adherido al télico de la hembra, ubicado en la región ventral del

cefalotórax (entre el cuarto y quinto par de pereiópodos) (Figura 1).

Figura 1. A Espermatóforo de M. americanum. B Hembra con espermatóforo

adherido al télico. Tomado de Hernández-Valencia (2010).

20

El desove de los huevos (oocitos fecundados) ocurre entre 6-20 h después del

apareamiento. La hembra encorva el cuerpo hacia adelante para tener mayor

contacto con la porción ventral de la región torácica. Los oocitos descienden de los

ovarios a través de los oviductos y posteriormente son fecundados por los

espermatozoides liberados del espermatóforo que esta adherido al télico con ayuda

del primer par de pereiópodos. Los huevos son adheridos a las sedas del primero al

cuarto par de pleópodos donde los embriones se desarrollan hasta la eclosión. Los

huevos adheridos a los pleópodos son ventilados constantemente por vigorosos

movimientos de los pleópodos de la hembra (Diarte-Plata et al., 2012).

En M. rosenbergii se han descrito 12 etapas de la espermatogénesis. Estas

etapas se identifican de acuerdo a la forma, tamaño y organización de la cromatina.

La espermatogénesis comienza con las espermatogonias que se dividen por mitosis

para posteriormente diferenciarse en espermatocitos primarios. Los espermatocitos

primarios se subdividen en seis fases de espermatocitos secundarios (leptoteno,

zigoteno, paquiteno, diploteno, diacinesis y metafase) y posteriormente en tres

etapas de espermátidas denominadas temprana, media y tardía. Las espermátidas

se diferencian por el grado de condensación de la cromatina previo al desarrollo de

los espermatozoides maduros.

Las células espermatogénicas y las células nodrizas son los dos principales

tipos de células del epitelio de los túbulos seminíferos. Los espermatozoides

maduros se encuentran en la luz de los túbulos seminíferos (Poljaroen et al., 2010).

Los espermatozoides maduros de M. rosenbergii son inmóviles y tienen una forma

similar a un paraguas invertido del cual emerge una larga espina anterior (12-14 µm)

compuesta principalmente de proteínas. El cuerpo principal del espermatozoide tiene

forma cóncava y contiene el núcleo, con cromatina altamente dispersa, en la parte

interna de su base. La parte externa del cuerpo presenta una superficie irregular con

14–20 radios que convergen en la base del cuerpo principal desde donde se

proyecta la espina (Leung-Trujillo & Lawrence, 1987; Poljaroen et al., 2010).

Las proteínas son el componente predominante en los testículos, conductos

deferentes y ámpulas terminales de los decápodos (Castille & Lawrence, 1989). Los

espermatozoides contienen una notable concentración de polisacáridos (Pochon-

21

Masson, 1983). Sasikala & Subramoniam (1987) caracterizaron bioquímicamente

varios mucopolísacáridos del espermatóforo de los camarones Penaeus indicus (H.

Milne Edwards, 1837 [in Milne Edwards, 1834-1840]) y Metapenaeus monoceros

(Fabricius, 1798). El sulfato de condroitina y ácido hialurónico son los principales

componentes estructurales del espermatóforo de los camarones. Durante la

oogénesis y la espermatogénesis del camarón Parapenaeopsis hardwickii (Miers,

1878) existe un notable consumo de glucógeno y lípidos del hepatopáncreas, y un

incremento de éstos en los ovarios y testículos evidenciando una movilización de

nutrientes para la reproducción (Nagabhushanam & Kulkarni, 1981).

Justificación

Actualmente se desconoce el efecto que el alimento ejerce en el rendimiento

reproductivo de los machos de M. americanum. En el presente estudio se investigó el

efecto de tres dietas (alimento pelletizado, fresco y 50:50% de ambas dietas) en la

calidad espermática y la condición celular del sistema reproductor de M. americanum

bajo condiciones de cautiverio para obtener información biológica que contribuya a

diseñar técnicas de cultivos eficientes y económicamente rentables para el cultivo

comercial que beneficie la conservación de M. americanum.

Hipótesis Debido a que las proteínas, carbohidratos y lípidos influencian en la calidad

reproductiva en el cultivo de M. rosembergii, se propone la hipótesis de que los

machos de M. americanum alimentados con una dieta combinada (alimento

pelletizado camaronina y fresco) tendrán una mejor condición, cantidad y calidad

espermática bajo condiciones de cultivo, que las dos dietas (pelletizado y fresco) por

separado.

22

Objetivos

General

Investigar la biología reproductiva de machos de langostino de río

Macrobrachium americanum mediante evaluación de la calidad espermática,

regeneración de espermatóforo; y condición celular del ámpula terminal, conductos

deferentes y testículos de especímenes alimentados con tres dietas diferentes y

comparados con especímenes silvestres recién colectados.

Específicos 1) Comparar la calidad espermática de los espermatóforos de M. americanum

extraídos de especímenes silvestres (grupo control) con la de especímenes

alimentados con tres dietas diferentes, cultivados bajo condiciones

experimentales.

2) Comparar la calidad espermática de los espermatóforos extraídos a lo largo del

experimento para evaluar si existe agotamiento reproductivo bajo condiciones

experimentales.

3) Comparar la composición bioquímica (proteínas, lípidos y carbohidratos) de las

tres dietas utilizadas contra la composición bioquímica de los espermatóforos

extraídos de los especímenes alimentados con cada tipo de dieta.

4) Determinar mediante técnicas histológicas las características y la condición celular

de los testículos, conductos deferentes y del espermatóforo de langostinos

silvestres y langostinos al final de la experimentación con cada una de las tres

dietas experimentales para evaluar si existen diferencias morfológicas asociadas

con el tipo de dieta.

23

METODOLOGÍA

Trabajo de campo Veintinueve langostinos machos de M. americanum fueron recolectados en el

oasis de San Pedro de la Presa en septiembre 2016 mediante trampas para

langosta, cebadas con hígado de pollo, y con una red de mano (Figura 2). A Cada

espécimen se le midió la longitud total y se estimó su peso corporal con una balanza

analítica (Metler Toledo ME, precisión 0,001 g).

Los langostinos fueron transportados a la Unidad Piloto de Maricultura

(UPIMA) del Centro Interdisciplinario de Ciencias Marinas del Instituto Politécnico

Nacional (CICIMAR-IPN) localizada en La Paz, Baja California Sur, México. El

transporte se realizó en hieleras con agua del oasis bajo condiciones de oscuridad y

con oxigenación constante a temperatura ambiente.

Además a 13 langostinos capturados en julio del 2017 se les determinó la

calidad espermática inmediatamente después de su recolección. Estos especímenes

fueron sacrificados para realizar análisis histológicos y análisis bioquímicos

proximales en el Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, S.C. (CIBNOR)

para inferir la calidad espermática y morfología de los espermatozoides. Estos

organismos silvestres fueron considerados el grupo de control.

24

Figura 2. San Pedro de la Presa (24º 50’ 53” N, -110º 59’ 38” W; Triangulo negro),

municipio de La Paz, Baja California Sur.

Debido a la heterogeneidad de la longitud total y peso de los 29 langostinos

recolectados, éstos fueron separados en tres grupos de tamaños mediante un

análisis de conglomerados (cluster analysis en inglés). El peso y la longitud total

fueron las variables de clasificación analizados mediante el método de distancia

euclidiana y método de agrupación por enlace completo o distancia más lejana

(Figura 3).

25

Figura 3. Dendrograma de clasificación de los 29 langostinos recolectados con corte

a nivel de tres grupos: pequeños (15-45 g) grupo central, medianos (46-80 g) grupo

de la izquierda y grandes (81-130 g) grupo de la derecha.

Una vez clasificados y separados por talla y peso, fueron redistribuidos en los

tres grupos de dietas experimentales. Cada grupo experimental fue definido por la

dieta a consumir y a su vez cada grupo experimental incluyó langostinos de los tres

tamaños con la finalidad de homogenizar la distribución de tallas y disminuir en lo

posible un sesgo por efecto de desarrollo ontogenético. Se utilizaron tres tanques

circulares de 600 L de capacidad para el cultivo de los tres grupos experimentales.

Cada langostino fue mantenido en una jaula rectangular de 40×15×15 cm forrados

con luz de malla de 1 cm2 para evitar canibalismo. La temperatura varió durante el

periodo de cultivo (244 días) de 24.8 a 28.9ºC (rango 4.1ºC). Cada tanque tuvo

aireación constante y cada jaula rectangular fue provista con un tubo de PVC

(policloruro de vinilo) como refugio (Figura 4). Cada langostino fue alimentado

Id Langostinos152822 5 3 1721 8 232419261011251416 6 1329 9 2720 7 18 1 2 4 12

Dis

tanc

ia e

uclid

iana

0

20

40

60

80

100

120

26

diariamente con un peso de alimento de aproximadamente el 5% del peso del

animal.

Diariamente se extrajo el alimento no ingerido del día anterior y las heces

mediante sifonado del fondo del tanque y un recambio de agua del 30% del volumen

de agua del tanque. Se registraron los parámetros de calidad de agua: temperatura,

pH, conductividad, solidos disueltos y salinidad, utilizando una sonda

multiparámetros (SmarTROLL™ MP Instrument, CO. USA).

Figura 4. A. Tanque circular de 600 L de agua dulce donde fueron cultivados 29

langostinos de río machos de M. americanum. B. Tubos de PVC como refugio para

cada individuo.

Dietas experimentales Las dietas experimentales con las que se alimentaron a los tres grupos de

langostinos fueron las siguientes:

Dieta 1: 100% de alimento fresco (50% de carne de calamar, Dosidicus gigas

(d'Orbigny, 1835) y 50% músculo de sardina, Sardinops sagax caeruleus (Jenyns,

1842)).

Dieta 2: 50% de alimento fresco y 50% de alimento pelletizado marca Camaronina

Purina® de 30% de proteína.

Dieta 3: 100% de alimento pelletizado Camaronina Purina® de 30% de proteína.

27

Para cuantificar la proporción de proteínas, carbohidratos y lípidos de cada

tipo de dieta se realizaron análisis proximales del alimento fresco y pelletizado de

acuerdo con los métodos definidos por la Association of Official Agricultural Chemists

(A.O.A.C., 1995).

Extracción de espermatóforos y conteo espermático

Los espermatóforos de M. americanum fueron extraídos en promedio cada 24

días (rango 20-28 días) mediante electro estimulación con una pila alcalina tipo D de

9 V y dos cables, cada uno conectado al polo positivo o negativo de la pila. El circuito

eléctrico se cierra al introducir uno de los dos cables en la cámara branquial del

langostino y tocando brevemente con el otro cable la base muscular del quinto par de

pereiópodos, cerca del ámpula terminal y los dos grupos musculares que la rodean

(Figura 5). Cuando el langostino recibe el estímulo eléctrico los músculos se contraen

rápidamente causando la expulsión de los espermatóforos a través de los gonoporos

(Díaz et al., 2002).

Figura 5. Extracción de espermatóforo mediante técnica de electro estimulación.

28

Debido a que de cada langostino se pueden obtener dos espermatóforos

durante cada extracción (derecho e izquierdo), uno de los espermatóforos extraídos

fue usado para la medición de la calidad espermática y el otro para realizar el análisis

químico proximal de proteínas, lípidos y carbohidratos. Cuando se extrajo sólo un

espermatóforo por langostino se priorizó el conteo y calidad espermática. La longitud

total (punta del rostro a la punta del telson), el peso de los langostinos y el peso de

los espermatóforos (en miligramos) fueron medidos en cada extracción de

espermatóforos.

El conteo espermático y la estimación del porcentaje de espermatozoides

muertos y anormales se realizó macerando un espermatóforo en 0.5 ml de agua

destilada y tiñendo los espermas con eosina-nigrosina en tubos tipo Eppendorf de

1.5 ml siguiendo el método descrito por Viana da Costa et al. (2016). Posteriormente

se realizaron los conteos espermáticos con una cámara de Neubauer y un

microscopio óptico con aumento de 10, 20, 40 y 100x. Se estimó el número de

espermatozoides contenidos en cada espermatóforo observado, así como el

porcentaje de espermatozoides anormales PA y porcentaje de espermatozoides

muertos PM mediante las siguientes fórmulas:

𝑃𝑀 =𝐸𝑚𝐸𝑡 ×100

Donde Em es el número de espermatozoides muertos contabilizados y Et el

número de espermatozoides totales contabilizados.

𝑃𝐴 =𝐸𝑎𝐸𝑡 ×100

Donde Ea es el número de espermatozoides anormales contabilizados y Et el

número de espermatozoides totales contabilizados.

Los espermatozoides normales tienen forma de “paraguas invertido” y una

espina recta y alargada. Los espermatozoides con la base de forma del paraguas

invertido inusual; espina ausente, espina corta o doblada fueron considerados

espermatozoides con morfología anormal (Figura 6).

29

Normal

Base con forma inusual

Base ausente

Espina ausente

Espina corta

Espina doblada

Figura 6. Criterios para la clasificación de espermatozoides normales y anormales.

Producción de espermatóforos

La producción de espermatóforos se calculó como el porcentaje de

espermatóforos producidos en cada extracción. Como cada organismo es capaz de

30

formar dos espermatóforos, el porcentaje de espermatóforos producidos POR se

calculó de la siguiente manera:

𝑃𝑂𝑅 =𝐸𝑝2𝑛 ×100

Donde Ep es el número de espermatóforos producidos, n es el número de

especímenes sobrevivientes. Este valor se multiplica por dos, debido a la formación

de dos espermatóforos, para estimar la producción total de espermas por extracción.

Crecimiento

Se calculó el incremento de peso en porcentaje IP% por cada grupo de peso y

por cada tipo de dieta mediante la siguiente fórmula:

𝐼𝑃% = (Pf− Pi)×100

Donde Pf es el peso final del espécimen, Pi es el peso inicial del espécimen.

Adicionalmente se calcularon las tasas de crecimiento por día (TC) por cada

grupo de peso y por cada tipo de dieta de la siguiente manera:

𝑇𝐶 = Pf− Pi

𝑡 ×100

Donde Pf es el peso final del espécimen, Pi es el peso inicial del espécimen y t

tiempo experimental en días.

Por último, se ajustó el modelo de peso-longitud a todos los valores de peso y

talla de los 29 langostinos macho registrados durante el experimento para inferir si el

patrón de crecimiento de los organismos experimentales es isométrico o alométrico.

El modelo W=a*Lb fue ajustado a los datos de peso y longitud.

donde W es el peso en gramos, a es el valor de la ordenada al origen, b es la

pendiente de la curva y L la longitud total del organismo en milímetros.

Histología de langostinos macho

Diecisiete organismos recién recolectados del Oasis San Pedro de La Presa

(grupo control) y tres organismos de cada tratamiento experimental (n=18), obtenidos

al final del experimento fueron analizados histológicamente (preservados en solución

Davidson por 48 h y después transferidos a etanol 70% para posteriormente ser

31

embebidos en parafina). De cada langostino preservado se realizaron múltiples

cortes de 4 µm de grosor del tejido conteniendo testículos, conductos deferentes y

espermatóforo. Los tejidos fueron teñidos usando procedimientos histológicos

estándar, montados en portaobjetos y cubiertos con cubreobjetos (Anexo 1). Cada

corte histológico fue examinado con microscopio óptico y fotografiado con una

cámara digital (Cool SNAP-Pro, Photometrics, Tucson, AZ, USA).

Microscopía electrónica de barrido

Los espermatóforos de M. americanum fueron deshidratados de forma gradual

en etanol (70, 80, 96%) y secados hasta el punto crítico mediante CO2 (Polaron

E3000). Los espermatóforos fueron cortados para poder visualizar los

espermatozoides contenidos en el interior y colocados en placas metálicas con

superficie adherente. Los espermatóforos y espermatozoides fueron cubiertos con

oro (Polaron E5100) y observados usando un microscopio electrónico de barrido a

20kv (SEM Hitachi S-3000N) en el Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste

en la cuidad de La Paz, BCS, México.

Análisis estadísticos

Se realizó un análisis de normalidad a los datos de todas las variables

medidas. La distribución de la frecuencia de los datos de las variables de peso del

espermatóforo, proporción de espermas normales y anormales, número de espermas

en los espermatóforos y tasa de crecimiento tuvieron una distribución normal. Con

estos datos se realizó un Análisis de Variancia (ANDEVA) de dos factores para

probar si existen diferencias significativas entre las medias debidas al efecto de cada

dieta experimental, de la longitud total de los organismos o de la interacción del

efecto combinado de ambos factores. La prueba de Friedman se realizó para la

proporción de espermatozoides vivos y muertos, única variable que no tuvo una

distribución normal. El nivel de significación para todas las comparaciones

estadísticas de las variables fue de p = 0.05 (Zar, 1998)

32

RESULTADOS Los 29 especímenes macho de M. americanum capturados para el presente

experimento tuvieron un rango de peso corporal de 15.5–130.0 g. Un alto porcentaje

de los machos (58.6%) pesaron entre 40 y 80 g. La moda fue de siete machos

(24.1%) con un peso entre 70 y 80 g. El primer grupo de tallas quedó compuesto por

ocho langostinos pequeños (rango 15-45 g). El segundo grupo estuvo compuesto de

17 langostinos medianos (rango 46-80 g) y el tercer grupo tuvo cuatro langostinos

grandes (rango 81-130 g) (Figura 7).

Figura 7. Distribución de frecuencia de pesos de 29 machos de Macrobrachium

americanum capturados en el Oasis de San Pedro de La Presa, B.C.S., México

utilizados para el experimento de biología reproductiva masculina.

Aspectos generales de reproducción


El experimento se realizó entre octubre 2016 y julio 2017 (244 días)

alimentando y observando cada langostino diariamente. Sin embargo, la extracción

de los espermatóforos se realizó entre los 20 y 28 días, en promedio cada 24 días.

En total se obtuvieron 138 espermatóforos. El éxito de extracción de los

Peso (g)0 20 40 60 80 100 120 140

Frec

uenc

ia

0

1

2

3

4

5

6

7

33

espermatóforos varió de manera individual con un rango de periodo de producción de

espermatóforo de entre 20 y 115 días. La mayoría de los espermatóforos extraídos

se formaron entre 20 y 30 días (77.7%; 108 de 138 casos registrados) (Figura 8).

Figura 8. Distribución de frecuencia del periodo de formación del espermatóforo por

individuo de M. americanum durante el tiempo experimental de 244 días.

El porcentaje de espermatóforos producidos disminuyó a lo largo del

experimento evidenciando un proceso de agotamiento reproductivo. No se

detectaron diferencias significativas entre los promedios de las variables de

porcentaje de espermatóforos de los langostinos alimentados con las tres distintas

dietas experimentales (p<0.05) (Figura 9A). La supervivencia final de los

especímenes experimentales fue del 62% causada principalmente por canibalismo

entre individuos que escaparon de su jaula y desoxigenación accidental del tanque

de cultivo. La mayor mortalidad de los organismos sucedió en la primera mitad del

experimento, aproximadamente en el día 140 dejó de registrarse la mortalidad y el

número de especímenes en el experimento permaneció constante.

El peso promedio de los espermatóforos disminuyó durante la parte final del

experimento. Se observaron diferencias significativas entre el peso promedio durante

el experimento y el peso promedio del grupo control (naturaleza) en los días 20 y

162-244. El día 115 (apróximadamente cuatro meses) fue cuando se registró el peso

Tiempo (Día)0 20 40 60 80 100 120

Frec

uenc

ia

0

20

40

60

80

100

120

34

promedio más alto del espermatóforo durante el periodo del experimento 19 ± 11 mg.

A partir de ese momento comenzó el decrecimiento promedio del peso y los

promedios calculados fueron estadísticamente más pequeños con respecto al

promedio del grupo control (silvestres) (Figura 9B). El peso de los espermatóforos

extraídos durante todo el experimento varió de 3 a 47 mg (n=138 espermatóforos). El

peso promedio general observado durante el experimento fue de 10 mg, esto

representa la mitad del peso promedio observado en los langostinos silvestres (20

mg). Los langostinos silvestres tuvieron un rango de peso corporal de 31 a 314 g.

La moda registrada fue 5 mg con una frecuencia de 56 espermatóforos (46%

del total de espermatóforos). La moda y promedio experimental estuvieron

influenciadas por un decrecimiento de la producción de espermatóforos a lo largo del

experimento (Figura 9C). La proporción del peso del espermatóforo con respecto al

peso total del macho de M. americanum es sumamente pequeño. La proporción del

peso del espermatóforo varió de 0.0005% a 0.2%. La moda calculada fue de 0.025%

con una frecuencia de 87 (72%) (Figura 10).

35

Figura 9. A. Porcentaje de producción de espermatóforos y supervivencia de M.

A

B

C

Peso de espermatóforo (10-3 g)0 10 20 30 40 50

Frec

uenc

ia

0

10

20

30

40

50

60

Tiempo (Día)20 48 69 91 115 142 162 189 216 244

Peso

(10-3

g)

0

5

10

15

20

25

30

35

40Media experimentalMedia naturalDiferencia entremedias (p<0.05)Valor mínimoValor máximo

Tiempo (Día)0 50 100 150 200 250

Prop

orci

ón (%

)

20

30

40

50

60

70

80

90

100Producción de espermatóforosSupervivencia

36

americanum a lo largo del tiempo experimental. B. Valores mínimo, máximo y

promedio del peso de los espermatóforos obtenidos del medio natural (control) y a lo

largo del experimento de 244 días de cultivo. C. Distribución de frecuencia del peso

del espermatóforo de todos los especímenes experimentales.

Figura 10. Distribución de frecuencia de la proporción del peso del espermatóforo

con respecto al peso total del macho de M. americanum.

Composición bioquímica (proteínas, lípidos y carbohidratos) del espermatóforo.

Debido al limitado tamaño y biomasa de los espermatóforos de. M

americanum y al mínimo tamaño de muestra necesaria (5 mg, peso seco) para la

confiabilidad del resultado del método de determinación bioquímica se realizó

únicamente una determinación para cada fecha de muestreo (combinando todos los

espermatóforos disponibles de cada fecha ).

Los promedios de cada componente a lo largo de todo el experimento fueron:

36.3% de proteínas, 25.8% de carbohidratos y 4.6% de lípidos. No existieron

diferencias estadísticas significativas de estos porcentajes a través del tiempo. La

figura 11 muestra las tendencias de éstos tres componentes de la dieta a lo largo del

tiempo experimental. Las proteínas del espermatóforo tuvieron una variabilidad del

Porcentaje (%)0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25

Frec

uenc

ia

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

37

33.5–41.5% (rango=8%) durante el periodo experimental, sin patrón claro de

disminución o aumento durante el periodo experimental. Los carbohidratos variaron

del 18.7–31.3% (rango=4.3%) con una ligera tendencia de disminución a lo largo del

periodo experimental. Los lípidos variaron del 3.3–6.3% (rango=3%) del peso del

espermatóforo, también, sin una tendencia clara de aumento o disminución a lo largo

del experimento.

Figura 11. Variación de la composición bioquímica promedio del espermatóforo de

Macrobrachium americanum en términos de porcentaje de proteínas, lípidos y

carbohidratos totales estimados a lo largo del periodo experimental (combinando

todos los especímenes de cada tratamiento por fecha de extracción).

Efecto de método de extracción de espermatóforo

La extracción de espermas mediante electro estimulación mostró ser

sumamente efectivo a lo largo del experimento. Sin embargo, la electro estimulación

periódica con un promedio de 24 días tuvo un efecto negativo en los machos de M.

americanum. En algunos especímenes se encontró melanización del tejido, necrosis

parcial y perforación del caparazón en la región de la cámara branquial (en el lugar

Tiempo (Día)0 50 100 150 200 250

Porc

enta

je (%

)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45ProteínaCarbohidratosLípidos

38

de la descarga eléctrica) que probablemente tuvo influencia en el agotamiento

reproductivo observado durante 244 días de duración.

En ocho machos se observó una melanización en la base del quinto par de

pereiópodos y en sus espermatóforos. La melanización del espermatóforo

generalmente fue en una pequeña o moderada fracción de la parte más distal del

espermatóforo (Figura 12). Solamente en dos ocasiones se observó una

melanización de todo el espermatóforo asociada con el mayor número de

espermatozoides anormales (18%) y los mayores porcentajes de espermatozoides

muertos (>70%).

Figura 12. Melanización del espermatóforo. A. Espermatóforo normal. B.

Espermatóforo melanizado. C. Perforación (P) del caparazón en la región de la

cámara branquial de M. americanum.

39

Calidad espermática

El número total estimado de espermatozoides por espermatóforo varió de 3 a

66 millones por individuo (n = 94 conteos espermáticos). La media estimada para la

población experimental fue de 12.1 ± 13.5 millones de espermatozoides contenidos

por espermatóforo. Cada macho produce simultáneamente dos espermatóforos

(derecho e izquierdo). Por lo tanto, la cantidad total de espermas por cada macho es

aproximadamente el doble de la previamente mencionada. El 68% de los

espermatóforos contuvieron entre 3.6 y 10 millones de espermatozoides (Figura

13A). El mayor número promedio de espermatozoides por espermatóforo observado

durante el experimento fue registrado durante el día 115 con (25.5 millones de

espermatozoides casi cuatro meses después de iniciado el experimento). A partir de

esa fecha se observó un declive en la producción de espermatozoides del que ya no

se recuperó la población experimental. Durante los días 216 y 244 se observaron

números de espermatozoides significativamente menores (<1 millón de

espermatozoides por espermatóforo) que el grupo control (17.7 ± 18 millones)

(p<0.05) (Figura 13B).

A

B Número de espermatozoides (x106)

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70

Frec

uenc

ia

0

5

10

15

20

25

30

40

Figura 13. A. Distribución de frecuencia del número de espermatozoides estimado

por cada espermatóforo de M. americanum durante el experimento. B. Comparación

del número de espermatozoides por espermatóforo de M. americanum registrados en

el experimento con respecto al observado en especímenes recién recolectados en la

naturaleza (grupo control).

El porcentaje promedio de espermatozoides con morfología anormal

contenidos en el espermatóforo fue <18% (n=126 conteos). El 80% de los

espermatóforos tuvieron entre 0 y 2% de espermatozoides anormales indicando que

ésta no es una condición frecuente en espermas de M. americanum ni una condición

particularmente relevante para disminuir el vigor reproductivo de los machos.

De los tipos de morfología anormal identificadas se encontraron casi en su

totalidad los espermatozoides con base inusual y sólo algunos casos de espina

doblada (no contabilizados). No se observó ningún caso de espermatozoides con

base o espina ausente ni espina corta.

Los espermatóforos melanizados fueron los que presentaron el máximo

porcentaje de espermas anormales (dos de ellos con 18%) (Figura 14A). Durante los

días 69 (2.8% ± 5.04%) y 115 (2.7 ± 5.20%) se registraron los valores de

espermatozoides anormales más altos. El valor promedio del porcentaje de

espermatozoides anormales en el grupo control de langostinos fue 1.5% ± 1.02%

(Figura 14B). El porcentaje promedio de espermatozoides con morfología anormal no

Tiempo (Día)20 48 69 91 115 142 162 189 216 244

Espe

rmat

ozoi

des

(106 )

0

10

20

30

40

50

60

70Media experimentalMedia naturalDiferencia entre medias (p<0.05)Valor mínimoValor máximo

41

presentó diferencias significativas entre el grupo control y el grupo experimental, ni

entre grupos de dietas (p>0,05).

A

B

Figura 14. A. Distribución de frecuencia del porcentaje de espermatozoides

anormales observados en el espermatóforo de M. americanum. B. Valores máximos,

mínimos y comparación del porcentaje promedio de espermatozoides anormales,

registrados durante el experimento, con el de langostinos recién colectados de su

medio natural (control), no hubo diferencias significativas entre promedios.

Esperma anormal (%)0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Frec

uenc

ia

0

20

40

60

80

100

120

Tiempo (Día)20 48 69 91 115 142 162 189 216 244

Porc

enta

je (%

)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20Media experimentalMedia naturalValor mínimoValor máximo

42

El porcentaje de espermatozoides muertos observados por espermatóforo

varió del 5 al 95% (n=126 conteos). El 82% de los especímenes observados tuvieron

entre 10-50% espermatozoides muertos. El promedio de espermatozoides muertos

fue de 35% ± 21% (Figura 15A). Esto indica que, aunque la mayoría de los

espermatozoides tengan morfología normal (baja proporción de espermatozoides

anormales) al menos una tercera parte de los espermatozoides de M. americanum

no sobrevive.

Conforme transcurrió el tiempo del experimento se evidenció una tendencia al

incremento del porcentaje de espermatozoides muertos. El mayor porcentaje de

espermatozoides muertos (52.3% ± 23.2%) se registró durante el día 142. Este valor

fue significativamente mayor que el valor promedio del porcentaje de

espermatozoides muertos observado en especímenes recién colectados (control,

33.7% ± 12.1%) (Figura 15B).

A

B Esperma muerto (%)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100100

Frec

uenc

ia

0

5

10

15

20

25

30

43

Figura 15. A. Distribución de frecuencia del porcentaje de espermatozoides muertos

observados en el espermatóforo de M. americanum. B. Comparación del porcentaje

de espermatozoides muertos en los espermatóforos de los langostinos alimentados

durante el experimento con los de langostinos recién colectados del campo (control).

Efecto de las dietas

En la Tabla 2 se presentan los valores promedio del porcentaje de

carbohidratos, proteínas y lípidos de las tres dietas utilizadas durante el experimento.

La dieta conformada por pellet comercial Camaronina 30 Purina® fue la dieta con

mayor porcentaje de carbohidratos y lípidos, pero el valor más bajo de contenido de

proteínas. La dieta de alimento fresco tuvo el mayor porcentaje de proteínas, pero el

menor de lípidos de las tres dietas. La dieta conformada por la mezcla de ambos

insumos presentó, como era de esperar, los valores intermedios para proteínas,

lípidos y carbohidratos.

Tiempo (Día)20 48 69 91 115 142 162 189 216 244

Porc

enta

je (%

)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100Media experimentalMedia naturalDiferencia entre medias p<0.05Valor mínimoValor máximo

44

Tabla 1. Composición proximal de las dietas ofrecidas diariamente al langostino de

río M. americanum durante el periodo experimental.

Carbohidratos (%) Proteína (%) Lípidos (%)

Alimento fresco 0.35 ± 0.003 97.46 ± 0.019 2.19 ± 0.019

Mezcla 50:50 18.06 ± 0.245 61.25 ± 0.245 20.69 ± 0.134

Pellet comercial 26.34 ± 0.094 47.13 ± 0.309 26.54 ± 0.385

Síntesis del análisis de la calidad espermática

Los valores promedio y error estándar de las seis variables de calidad

espermática en langostinos alimentados con cada tipo de dieta experimental (Tabla

3) y por tamaño del macho (Tabla 4) no tuvieron diferencias estadísticas

significativas (ANOVA de dos vías, p >0.05).


del langostino de río M. americanum alimentado con tres diferentes dietas.

Peso del

espermatóforo

(mg)

Esperma

muerto (%)

Esperma

anormal (%)

Número de

espermas

(x106)

Producción de

espermatóforos

(%)

Control 17.5 ± 2.5b 26.3 ± 5.0 1.6 ± 0.6 17.7 ± 3.9 - Pellet 9.1 ± 1.6 a 36.8 ± 3.1 a 1.0 ± 0.4 a 16.5 ± 2.7 a 48 ± 6.45 Mezcla 7.9 ± 1.7 a 33.8 ± 3.3 a 1.4 ± 0.4 a 11.6 ± 2.7 a 49 ± 6.45 Fresco 12.2 ± 1.6 ab 34.3 ± 3.2 a 1.5 ± 0.4 a 9.6 ± 2.2 a 48 ± 6.45

Valores dentro de las columnas con superíndices iguales no son significativamente

diferentes (p >0.05).

45


de los tres intervalos de peso de langostino de río M. americanum utilizados en este

experimento, pequeños (15-45 g), medianos (46-80 g) y grandes (81-130 g).

Peso del

espermatóforo

(mg)

Esperma

muerto (%)

Esperma

anormal (%)

Número de

espermas

(x106)

Producción de

espermatóforos

(%)

Pequeños 7.8 ± 1.6 a 34.5± 3.3 a 1.9 ± 0.4 a 11.1 ± 2.4b 50.1 ± 7.6 Medianos 10 ± 1.1 a 36.5 ± 2.5 a 1.0 ± 0.3 a 10.5 ± 1.8b 51.2 ± 7.6 Grandes 13.5 ± 2.4 a 29.3 ± 5.4 a 1.2 ± 0.7 a 23.4 ± 3.9a 37.5 ± 7.6



Crecimiento

El incremento porcentual del peso y la tasa de crecimiento se calcularon para

los especímenes de cada dieta experimental (pelletizado, fresco o 50:50) y cada

intervalo de peso (chicos, medianos y grandes). No existieron diferencias

significativas en la tasa de crecimiento entre los tres tipos de dietas.

La dieta de mezcla del alimento fresco y pelletizado, y el grupo de langostinos

pequeños fueron las categorías con mayores porcentajes de incremento de peso, por

consecuencia mayores tasas de crecimiento. Los langostinos alimentados con pellet

camaronina 30 Purina® y los langostinos con tamaño grande tuvieron los menores

porcentajes de incremento de peso y tasas de crecimiento (Tablas 5 y 6).

Los datos de peso-longitud de machos de M. americanum se ajustaron al

modelo de regresión lineal tipo potencial con un índice de determinación de R2=0.83:

a = 0.012 y b = 3.1 (W=0.012*L3.1). El exponente cercano a tres indica que los

machos de M. americanum tienen un patrón de crecimiento somático ontogenético

isométrico en el rango de longitud total observado (9-18 cm). El Análisis de Variancia

de la regresión correspondiente (prueba para determinar si el modelo utilizado es

adecuado para los datos de estudio) resultó en una F =439 y un valor de p=0 (Figura

16). Este resultado demuestra que es adecuado usar este modelo de regresión lineal

potencial para el grupo de datos de peso y talla analizados de M. americanum.

46


tasa de crecimiento y el valor final de supervivencia observados en langostinos de M.

americanum alimentados con cada tipo de dieta experimental.

Dieta Incremento

de peso (%)

Tasa de crecimiento

(% day-1)

Supervivencia

(%)

Pellet 21 ± 10 a 0.03 ± 0.03 a 78 Mezcla 61 ± 12 a 0.07 ± 0.03 a 50 Fresco 52 ± 12 a 0.07 ± 0.03 a 60




tasa de crecimiento obtenidos por cada intervalo de peso de adultos (chicos 15-45 g,

medianos 46-80 g y grandes 81-130 g), también se muestra el valor final de

supervivencia de los machos de M. americanum utilizados en este experimento.

Intervalo de peso Incremento de

peso (%)

Tasa de crecimiento

(% day-1)

Supervivencia

(%)

Pequeños (15-45 g) 68 ± 12 a 0.07 ± 0.03 a 62 Medianos (46-80 g) 31 ± 9 a 0.06 ± 0.02 a 59 Grandes (81-130 g) 29 ± 19 a 0.02 ± 0.04 a 75



47

Figura 16. Ajuste del modelo potencial de peso-longitud (W=a*Lb) de langostinos

macho de M. americanum.

Histología del tracto reproductivo en machos

Los testículos de M. americanum están compuestos de dos lóbulos

testiculares, cada uno constituido a su vez de numerosos túbulos seminíferos (Figura

17A). El testículo y cada túbulo seminífero se encuentran rodeados de una delgada

capa de tejido conectivo. En la periferia de los túbulos seminíferos se localizan las

espermatogonias que son células ovaladas con núcleos principalmente compuestos

de eucromatina a partir de las cuales comienza la espermatogénesis (Figura 17B).

Las espermatogonias se dividen por mitosis para posteriormente diferenciarse en

espermatocitos primarios. Éstos a su vez se diferencian en espermatocitos

secundarios y se localizan en el centro del túbulo seminal en sus seis fases de

división celular (leptoteno, zigoteno, paquiteno, diploteno, diacinesis y metafase)

(Figura 17C).

Durante la espermiogénesis las espermátidas se transforman en

espermatozoides. Éstos derivan de los espermatocitos secundarios y se caracterizan

por tener un tamaño más pequeño que en las fases predecesoras, abundantes

Longitud total (mm)9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

Peso

(g)

0

50

100

150

48

ribosomas, mitocondrias en el citoplasma y su núcleo contiene una proporción

variable de heterocromatina y eucromatina (Figura 17D).

Los espermatozoides en el testículo presentan una proyección conocida como

espina (spike en inglés) y una base semicircular, similar a un paraguas invertido, que

contiene el material genético que usualmente se tiñe de azul (Figura 17E). Los

espermatozoides recién formados se encuentran en la luz de los túbulos conectados

a la parte proximal del conducto deferente. Los espermatozoides del conducto

deferente están más desarrollados que los testiculares, su base en forma aplanada

asemeja una “tachuela” más que un paraguas; además, se encuentran rodeados de

una secreción producida por tejido epitelial que funciona como envoltura (Figura

17F). En algunas regiones del conducto deferente donde el tejido epitelial es

columnar la cantidad de secreción del epitelio es abundante (Figura 17H). El

conducto deferente se encuentra rodeado por una delgada capa muscular externa.

El ámpula terminal está rodeada de dos capas de músculo liso, una

transversal y otra longitudinal. Estas capas musculares y la capa de tejido epitelial

presente son más gruesas que las que usualmente se observan en la mayoría del

conducto deferente. En el ámpula termina se segregan las sustancias protectoras y

adherentes de los espermatóforos, éstas secreciones harán posible la sobrevivencia

de los espermatozoides y la adhesión al télico de la hembra (Figura 17I).

50

Figura 17. A. Fotografía de microscopio óptico de testículo de M. americanum teñido

con Hematoxilina y Eosina mostrando los túbulos seminíferos que lo componen. B. Túbulos seminíferos, algunos con espermatogonias (Sg) en la periferia. C. Túbulo

seminífero con espermatocitos (Sc) en diversas fases de división celular. D. Túbulos

seminíferos en la parte próxima al conducto deferente (Cd) con espermátidas (St) y

los primeros espermatozoides en testículo (Sz). E. Espermatozoides en testículo

(material genético teñido de azul) en forma semicircular. F. Sección del conducto

deferente con espermatozoides maduros (Sz) de base “aplanada” y rodeados de una

secreción protectora (SP), el epitelio (Ep) y la capa muscular externa (Mu). H. Conducto deferente con epitelio columnar (Ec). I. Ámpula terminal y sus dos capas

gruesas de músculo liso: una transversal (Mt) y otra longitudinal (Ml) en el centro

epitelio (Ep).

Morfología fina del espermatóforo y del espermatozoide

La estructura del espermatóforo y del espermatozoide se observó con mayor

detalle mediante el uso de microscopía electrónica de barrido (MEB). El

espermatóforo tiene claramente definidas la sección ventral y dorsal (Figura 18A). La

zona ventral que se fusiona con el otro espermatóforo parece tener una superficie

más lisa y con menor cantidad de secreción mucosa. En la zona dorsal la mucosidad

parece estar estructurada en “placas cuadradas” que rodean casi todo el

espermatóforo, semejante al cuerpo septado de una oruga (Figura 18B). La envoltura

está organizada en secciones rectangulares compuestas por fibras de

mucopolisacáridos que se orientan de manera transversal en la región dorsal del

espermatóforo. La Figura 18C muestra una sección del espermatóforo con la

envoltura degradada a tal grado que permite observar las fibras transversales que las

constituyen.

Dentro del espermatóforo, la masa espermática está protegida con una capa

de 30 a 100 µm de grosor (Figura 18D). Todo este material se mueve a través del

conducto deferente embebida en lo que parece una matriz que la cubre y protege. En

esta sección existe una concentración alta de espermatozoides aglomerados sin

orden específico (Figura 18E).

51

Los espermatozoides con forma de paraguas invertido son altamente flexibles

de la espina y de la base (Figura 18F). La base tiene entre 21 y 25 radios que corren

desde la periferia convergiendo hacia la base de la espina. La espina es una

proyección de aproximadamente 13-15 µm de longitud y el núcleo se encuentra

específicamente dentro de la región cóncava de la base de la espina.

52

Figura 18. A. Imagen de microscopía electrónica de barrido (MEB) que muestra la

sección ventral y sección dorsal del espermatóforo. B. Sección ventral del

espermatóforo mostrando placas cuadradas. C. Envoltura degradada del

espermatóforo que muestra las fibras transversales que la constituyen. D. Corte

transversal del espermatóforo que muestra el grosor de la envoltura (Ev) que protege

a la masa espermática (ME). E. Vista de masa espermática compuesta de

espermatozoides (Sz). F. Espermatozoide con morfología normal, base (Ba), espina

(Es) y radios (ra).

53

DISCUSIÓN

La presente investigación demostró que las seis variables de calidad

espermática evaluadas en M. americanum no tuvieron diferencias significativas en

función del tipo de dietas ni de los intervalos de peso. Los 29 organismos capturados

tuvieron un rango de peso relativamente amplio. Esta heterogeneidad entre los

organismos permitió investigar si existe alguna relación entre las variables de calidad

espermática en función de la variabilidad ontogenética de los adultos. Debido a que

se conoce que las tasas metabólicas y el desarrollo de la gónada masculina varía en

función de la longitud total (Harrison, 1990) se esperaban diferencias en la calidad

espermática en función del tamaño de los organismos. Sin embargo, los tres grupos

de tamaños (chicos 15-45 g, medianos 46-80 g y grandes 81-130 g) formados a partir

del análisis de conglomerados no mostraron diferencias significativas entre las

variables medidas de calidad reproductiva. Tampoco se evidenció una relación entre

el tamaño de los organismos con las variables medidas. A continuación se discuten,

de manera general, aspectos de la biología reproductiva masculina de M.

americanum. Este conocimiento fue obtenido a partir de los datos de 29

especímenes con peso corporal entre 15.5-130 g y longitud total entre 9.5-17.5 mm.

Biología reproductiva de M. americanum


Debido a que 108 de los 138 espermatóforos obtenidos se formaron entre 20-

30 días (Figura 7) se infiere que este es el periodo que la mayoría de los machos

adultos de M. americanum tarda en formar un nuevo espermatóforo. En camarones

peneidos, la renovación del espermatóforo puede producirse cíclicamente

aproximadamente cada quince días (Alfaro-Montoya, 2010) , lo que nos hace pensar

que el tiempo de formación inferido en el presente experimento es razonable.

Es probable que M. americanum pueda producir espermatóforos en un periodo

menor a la frecuencia mínima de extracción de espermatóforos de 20 d. A partir de

un experimento piloto, electro estimulando a los langostinos cada 10, 15 y 20 días, se

concluyó que el periodo de 20 días resultó en mayor número de extracciones

consecutivas exitosas de espermatóforos, pero es posible encontrar organismos con

54

producción de espermatóforos de 10 días (Cortés-Jacinto, com. pers.). Dado que

observamos un efecto negativo de la electro-estimulación con un intervalo promedio

de 24 días, no es recomendable realizar electro estimulación en intervalos < 20 días.

Evidencia experimental obtenida en el langostino M. rosenbergii muestra la

extracción de espermatóforos en periodos considerablemente más cortos (Harris &

Sanducera, 1986) que los reportados para M. americanum en el presente trabajo.

Doce machos de M. rosenbergii fueron electro-estimulados con una pila de 4V

durante un mes (cada 24, 30, 36 y 48 h para cada una de las cuatro semanas del

mes) y se obtuvo un promedio de éxito en extracción del espermatóforo de 93.5%.

En el presente trabajo se utilizaron 9V de corriente para electro-estimular a M.

americanum. De acuerdo con Harris & Sanducera (1986) M. rosenbergii produce un

par de espermatóforos cada uno o dos días. Otra diferencia entre los experimentos

en ambas especies es que el peso promedio del espermatóforo de M. americanum

es aproximadamente cinco veces mayor (10 mg) que el de M. rosenbergii (2 mg), lo

que sugiere un mayor tiempo de producción de espermatóforo en M. americanum. Se

asume que el voltaje es directamente proporcional a la contracción muscular y que

provoca una mayor fuerza de expulsión y cantidad de espermatóforo. Una electro

estimulación de 9V posiblemente extrae más biomasa espermática en el ámpula

terminal del organismo que una estimulación con cuatro volts, por lo que la

extracción con 4 V causa extracción de porciones de espermatóforo más pequeñas y

expulsión de espermatóforos más frecuente. Si éste razonamiento es correcto, el

éxito de electro estimulación depende directamente de la intensidad de corriente

utilizada e indirectamente de la frecuencia con la que se aplica. Aún no existe

consenso sobre cuál es el voltaje y frecuencia adecuados en la electro estimulación a

reproductores de M. americanum. Viana da Costa et al. (2016) evaluaron el efecto de

4.5 V y 6 V sobre el éxito de producción de espermatóforos en M. acanthurus sin

encontrar diferencias significativas en la producción o supervivencia espermática

evaluada, concluyendo que debido a que observaron un menor porcentaje de

mortalidad, el uso de 6 V posiblemente sea la mejor decisión. Cabe señalar que

fueron utilizados organismos más pequeños (rango de peso de 2 a 29 g) que los

utilizados en el presente experimento (rango de peso de 15 a 130 g).

55

Aún se requiere realizar un experimento dirigido a probar con diferentes

intensidades de corriente y tiempos de extracción de espermatóforos de M.

americanum para inferir si, al igual que M. rosenbergii, puede expulsar

espermatóforos cada uno o dos días, o si se pueden usar menores voltajes como en

el caso de M. acanthurus. Este conocimiento sería más útil y aplicable si además se

conociera el peso promedio del espermatóforo que el macho expulsa en una cópula

de manera natural (sin electro estimulación).

Durante el presente experimento se efectuó electro estimulación en promedio

cada 24 días. Esto es tiempo suficiente para que se forme el espermatóforo y se

recupere el organismo. En general, es deseable que especímenes reproductores

bajo cultivo se reproduzcan naturalmente (sin extraer espermatóforos por ningún

método invasivo). Aunque la electro estimulación es un método efectivo, las heridas

que produce en el animal podrían derivar en infecciones bacterianas si existe mala

calidad del agua. Las heridas y melanización causadas por electro estimulación

disminuyen la calidad espermática de los especímenes (Fontaine & Lightner, 1973).

El proceso de agotamiento reproductivo fue evidenciado con la disminución en

la producción y peso del espermatóforo durante el transcurso del experimento

(Figura 8A). Esto puede atribuirse al efecto del estrés producido por el encierro, el

cambio de alimentación o ausencia de estímulo hormonal de las hembras. Aunque la

mortalidad de los organismos se detuvo aproximadamente a la mitad del

experimento, el porcentaje de producción continuó disminuyendo con los

especímenes sobrevivientes. Es importante considerar que en la naturaleza puede

haber algún efecto inductor por parte de la hembra sobre la producción de

espermatóforo del macho. En ausencia de hembras podría afectarse la producción

de espermatóforo (hipótesis a ensayar).

Los alimentos utilizados en el presente experimento son distintos de los que

M. americanum consume en su hábitat natural, sin embargo, éstos alimentos son

utilizados frecuentemente en la acuicultura de camarón y de M. rosenbergii (de

ambos sexos). Conocer el tipo de alimento que ingieren los especímenes silvestres

durante el periodo reproductivo puede ser útil para aumentar el rendimiento y la

56

formulación de dietas acorde a los requerimientos nutricionales de los reproductores

machos de M. americanum.

El peso promedio del espermatóforo tendió a incrementar durante la primera

parte del experimento alcanzando su máximo durante el día 115. Después de esa

fecha el peso promedio del espermatóforo disminuyó progresivamente, siendo

estadísticamente más pequeño a partir del día 162 en comparación con los

observados en especímenes silvestres. Esto implica que el uso de reproductores

machos de M. americanum en cultivo no debiera exceder a más de 162 días

(aproximadamente cinco meses) como máximo (Figura 8B).

Aunque el peso del espermatóforo tuvo una moda de 5 mg (Figura 8C) y un

promedio de 9 mg consideramos, por los inusuales bajos valores observados al final

del experimento, que estas estimaciones subestiman el peso del espermatóforo (los

últimos cuatro muestreos, 40% del tiempo experimental). A pesar del bajo número de

muestras de especímenes silvestres, la media obtenida en la naturaleza (20 mg)

parece ser una aproximación más precisa del tamaño usual del espermatóforo de M.

americanum. El promedio de peso de espermatóforo está dentro del rango

observado en la langosta americana Homarus americanus H. Milne Edwards, 1837

(3-32 mg), el camarón P. paulensis (Pérez Farfante, 1967) (22-27 mg para machos

de 20 g) (Braga et al., 2010); M. rosenbergii (1-3 mg) (Harris & Sanducera, 1986) y 9

mg (Claudet et al., 2016). El peso reportado por Claudet et al. (2016) es similar a lo

estimado para M. americanum en el presente estudio. Para el caso de M. acanthurus

se reportó un rango de peso del espermatóforo de 0.1–2 mg para organismos con

peso promedio de 10 ± 5 g (Viana da Costa et al., 2016).

La proporción del peso del espermatóforo con respecto al peso corporal en M.

americanum es despreciable (promedio= 0.02%, Figura 9). La inversión energética

del macho es considerablemente menor a la invertida por las hembras en la

producción de gametos. Las hembras de crustáceos como el krill pueden derivar de

10 al 40% de su peso corporal en producción de huevos (Gómez-Gutiérrez et al.,

2007). Las hembras de M rosenbergii pueden disminuir su tasa de crecimiento o

incluso dejar de crecer cuando inicia la gametogénesis, derivando energía a la

reproducción cuando alcanzan la fase adulta (Ra’Anan, 1987). Aunque la media y la

57

moda del peso del espermatóforo fue influenciada por el agotamiento reproductivo, si

tomáramos en cuenta sólo el valor máximo obtenido (0.2%), la proporción de

biomasa aún seguiría siendo virtualmente despreciable. Aunque la inversión

energética y la biomasa del macho sea considerablemente menor al de la hembra,

no es acertado asumir que el macho no tiene influencia en la calidad de los

embriones fecundados y en la producción de huevos viables en las puestas de las

hembras. La calidad espermática (porcentaje de vivos:muertos, normales:anormales)

puede tener considerable influencia en el éxito reproductivo de los machos, incluso

mayor influencia que la concentración de espermatozoides en el espermatóforo por

sí misma.

Composición bioquímica (proteínas, lípidos y carbohidratos) del espermatóforo.

No se evidenciaron tendencias claras en la variación de las proteínas o los

lípidos durante el experimento, pero sí una pequeña tendencia al decremento de los

carbohidratos. De acuerdo con lo indicado por Racotta (2003): “una manera indirecta

de inferir los requerimientos nutricionales de los crustáceos reproductores es

mediante el análisis de la composición bioquímica de órganos implicados en la

transferencia y acumulación de nutrientes asociados al proceso reproductivo”,

suponemos que la proporción en la dieta ideal de los reproductores machos de M.

americanum sería similar al promedio general determinado en este experimento

(36.3% de proteína, 4.6% de lípidos y 25.8% de carbohidratos), teniendo en cuenta

que el nivel de carbohidratos óptimo podría ser un valor unas cuantas unidades

porcentuales más arriba que el de este experimento. De las dietas suministradas, el

pellet comercial tuvo la proporción de proteínas, lípidos y carbohidratos más parecida

a la determinada para el espermatóforo de M. americanum en el presente

experimento.


La calidad espermática de M. americanum no varió en función del peso de los

machos, ni fue significativamente influenciada por las tres dietas utilizadas. De

manera general, los valores de calidad espermática registrados en especímenes

58

recién colectados de la naturaleza fueron mejores que los de especímenes cultivados

durante el experimento.

El número promedio de espermatozoides de especímenes silvestres (control)

fue de 17 ×106 espermatozoides (Figura 12). La calidad espermática, y no la cantidad

de espermatozoides, parece ser la característica más influyente en el éxito

reproductivo de M. americanum. Las hembras de ésta especie puede producir hasta

900,000 óvulos por hembra (Cabrera et al., 1979). Aún si tomamos como referencia

el valor más pequeño de número de espermas por espermatóforo registrados en el

presente experimento, sería al menos el triple de la cantidad de producción de

oocitos reportada en hembras.

Otras especies de crustáceos también producen elevadas cantidades de

espermatozoides. Por ejemplo, machos de 22.4 g del camarón rosa P. paulensis

producen en promedio 3-6×106 espermatozoides por espermatóforo (Braga et al.,

2010). Machos de 21 g de camarón P. schmitti (Burkenroad, 1936) producen en

promedio 10-16×106 espermatozoides por espermatóforo (Pérez-Jar 2005). Sin

embargo, M rosenbergii tiene reportes de 6×106 espermatozoides por espermatóforo

en machos con peso promedio de 16 g (Revathi et al., 2012), 5.2-5.8×108

espermatozoides por espermatóforo para machos de 24±10 g (Harris & Sanducera,

1986) y 6±4×109 espermatozoides por espermatóforo para machos con peso

promedio de 45±4 g (Claudet et al., 2016).

Es evidente que M. rosenbergii tiene notable variabilidad en producción de

espermatozoides (hasta tres órdenes de magnitud) cuando se compara la producción

de espermatozoides en función de la longitud total de los machos. Es decir, M.

rosenbergii tiene una relación directa de tamaño corporal del macho y el número de

espermatozoides contenidos en el espermatóforo. Ésta tendencia no fue observada

en machos de M. americanum de 9-18 cm de longitud total.

La proporción de espermatozoides con morfología anormal observada durante

el presente estudio fue relativamente baja. Esta variable se incrementó hacia el final

del periodo experimental pero no mostró diferencias significativas con respecto al

promedio observado en especímenes silvestres (control) (Figura 13B). La proporción

de espermatozoides con morfología anormal parece ser más alta en otras especies

59

de crustáceos. M. malcolmsonii (H. Milne Edwards, 1844) aumentó la proporción de

espermatozoides anormales de 20% a 80% en 70 días de cultivo (Kannupandi &

Soundarapandian, 1999). El camarón P. schmitti tuvo proporciones de 10-16%

espermatozoides anormales durante un experimento de 60 días (Pérez-Jar, 2005). El

camarón blanco Penaeus vannamei (Boone, 1931) tiene valores de 20-35% de

espermatozoides anormales durante tres regeneraciones consecutivas del

espermatóforo (Ceballos-Vázquez, 2003).

Los resultados indican que M. americanum es una especie con bajo

porcentaje de espermatozoides con morfología anormal en comparación con otras

especies de crustáceos. Los tipos de malformaciones observadas en M. americanum

fueron: base con forma inusual y espina doblada. La evidencia obtenida hasta ahora

indica que las malformaciones de los espermatozoides no son una causa relevante

para explicar el agotamiento reproductivo de los machos, por lo que no se esperaría

una alta proporción de espermatozoides con morfología anormal en condiciones

naturales o en cultivo, además la dieta no parece influenciar de manera significativa

este porcentaje.

El porcentaje de espermatozoides muertos por espermatóforo de M.

americanum está dentro del rango reportado en otras especies crustáceos (Figura

14). P. vannamei tendió a disminuir su porcentaje inicial de 48% de espermatozoides

muertos a 20% en la tercera regeneración del espermatóforo (Ceballos-Vázquez,

2003). Pérez-Jar (2005) reportó porcentajes del 3.7-4.3% de espermatozoides

muertos en machos de P. schmitti durante 60 días de cultivo. M. malcolmsonii

aumentó aproximadamente del 10% al 100% en cuatro semanas de cultivo

(Kannupandi & Soundarapandian, 1999). Los camarones P. setiferus (Linnaeus,

1767), P. vannamei, y P. stylirostris Stimpson, 1871, al igual que M. americanum,

tienen porcentajes de espermatozoides muertos relativamente bajos (4-8%). De esta

forma, aunque M. americanum tiene un porcentaje de espermas anormales

relativamente bajo al compararla con otras especies, el porcentaje de

espermatozoides muertos parece estar limitando el éxito reproductivo de los machos

y explicar en parte el agotamiento reproductivo.

60

Histología del tracto reproductivo en machos y morfología de alta resolución del

espermatóforo y espermatozoides

Los resultados de este trabajo no presentan diferencias morfológicas a nivel

de grandes rasgos del sistema reproductor de M. americanum de acuerdo a

revisiones previas de otras especies de crustáceos (López-Greco, 2012). Sucede lo

mismo para la fase temprana de la espermatogénesis. Es en la espermiogénesis que

se presentan algunas diferencias cuando se desarrolla el espermatozoide. Los

espermatozoides de M. americanum son semejantes a la morfología previamente

reportada para otras especies de palemónidos (Poljaroen et al., 2010),

particularmente parecidos a los de M. rosenbergii debido a la cercanía filogenética. El

espermatozoide normal de M. rosenbergii tiene entre 15 a 20 radios en la base. La

espina mide de 10 a 15 µm de largo con un diámetro de la base de 10 µm. Los

espermatozoides de M. americanum tienen entre 21-25 radios en la base (22.9 ± 1.5,

n=30). La espina mide de 13-15 µm de largo (14 ± 0.8, n=30) con un diámetro de la

base promedio de 9.1 ± 0.8 µm, n=30. De esta forma, el espermatozoide de M.

americanum a diferencia de M. rosenbergii parece tener, en promedio, un diámetro

menor en la base (1 µm), más radios (6 aproximadamente) y la espina un poco más

grande (1.5 µm).

Es claro que mientras los espermatozoides maduros recorren el conducto

deferente, el epitelio suministra nutrientes y material de adherencia a los

espermatozoides para mantenerlos con vida hasta su salida. La capa muscular que

rodea al conducto deferente probablemente es la responsable de hacer avanzar la

masa espermática y su matriz hasta la zona del ámpula terminal mediante

movimientos peristálticos. Al llegar a la zona del ámpula terminal el espermatóforo se

acumula hasta el momento de su transferencia al exterior de la hembra, en el

momento de la ovulación de la misma, como sucede en otras especies de crustáceos

(López-Greco, 2012). La gruesa doble capa muscular es la encargada de expulsar al

espermatóforo formado hacia el exterior mediante una fuerte contracción.

61

Efecto de dietas


Las dietas proporcionadas a M. americanum en este experimento tuvieron

proporciones considerablemente distintas de carbohidratos, proteínas y lípidos (Tabla

2). A pesar de las diferencias en la composición bioquímica de las tres dietas no se

presentaron diferencias significativas en la calidad espermática de los langostinos

alimentados con cada dieta. El supuesto inicial era que el alimento fresco constituido

en su mayoría de proteína (97%) y con una cantidad de lípidos y carbohidratos

considerablemente baja, podría afectar negativamente la producción de

espermatozoides o la formación del espermatóforo debido a la relevante función de

los carbohidratos como precursores de intermediarios metabólicos, componentes

lipoproteícos que facilitan el transporte de nutrientes del hepatopáncreas a la gónada

a través de la hemolinfa y la síntesis de los ácidos nucleicos (Harrison, 1990).

Aunque las tres dietas fueron distintas en composición bromatológica, y los

carbohidratos, proteínas y lípidos tienen diferente función en la síntesis de los

gametos y del espermatóforo, en el presente experimento no existió evidencia que

indique diferencias estadísticamente significativas de las dietas en la calidad

espermática (Tabla 3). Debido a que el alimento pelletizado camaronina 30 Purina®

es de menor costo y es fácil de proporcionar a los langostinos se recomienda

alimentar a los reproductores macho únicamente con alimento pelletizado.

Tampoco se encontró evidencia de que el tamaño de los organismos cause

diferencias significativas en la calidad espermática (Tabla 4). Los langostinos más

grandes tuvieron, en general, mayores valores promedio de tres de las cinco

variables de calidad espermática utilizadas (peso del espermatóforo, número de

espermatozoides y porcentaje de espermas muertos). Sin embargo, los valores de

error estándar estimados para las medias de los especímenes grandes también

fueron los mayores (n=4). En general, no se encontró una relación significativa entre

la longitud total del langostino y las variables de calidad espermática, como también

fue observado en M. acanthurus (Viana da Costa et al., 2016).

Aunque los resultados de la presente investigación no demostraron una

relación entre el tamaño del langostino y la calidad espermática, tampoco es

62

evidencia inequívoca de que esta relación no existe. Es evidente que se debe

investigar la talla de primera madurez de machos de M. americanum, es decir, en

especímenes más pequeños de 8 cm LT. La expectativa es que los especímenes

más jóvenes y más viejos (los más pequeños y grandes) tuvieran los valores de

calidad espermática más bajos, y que hubiera un intervalo de peso o longitud total

intermedio donde la calidad espermática de los langostinos alcance su máximo

potencial durante su desarrollo ontogenético.

Crecimiento

Aunque el objetivo del presente trabajo no fue estrictamente evaluar el

crecimiento corporal y no se detectaron diferencias significativas en crecimiento en

relación a las dietas suministradas. El alimento combinado fue el que tuvo el valor

más alto del porcentaje de incremento en peso (10% más que el alimento fresco).

Con esta dieta también se observó la mayor tasa de crecimiento, por lo que

podríamos suponer que esta dieta podría cubrir de manera efectiva las necesidades

de los machos de M americanum para la síntesis de gametos y espermatóforos.

Tampoco se detectó una diferencia significativa de crecimiento en función del peso.

Se esperaba que los langostinos de menor tamaño tuvieran las mayores tasas

metabólicas y altos valores del porcentaje de incremento de peso en comparación

con los langostinos más grandes. El exponente del modelo de regresión potencial

ajustado tuvo un valor cercano a 3 (W=0.012*L3.1), esto indica que los langostinos

crecieron de manera isométrica durante el periodo experimental. Este patrón es

característico de organismos adultos jóvenes. Los valores > 3 son característicos en

adultos viejos que han dejado de crecer en longitud pero tienden a ser más robustos.

El registro de M. americanum más pesado hasta ahora fue de 500 g (Arana-Magallón

& Ortega-Salas, 2004). El espécimen más grande colectado en el presente estudio

fue de 130 g. Es decir que el rango de 9-18 cm de longitud total podría no ser

representativo de la variabilidad ontogenética de esta especie en su fase adulta. Es

posible que al trabajar con especímenes de un más amplio espectro de tallas se

pueda observar una relación entre el tamaño y la calidad espermática en un

experimento diseñado específicamente para ello.

63

CONCLUSIONES 1) Los valores de calidad espermática fueron significativamente mayores en

especímenes silvestres que en especímenes cultivados alimentados con las dietas

experimentales.

2) Se evidenció agotamiento reproductivo mediante el declive de la producción de

espermatóforos, el peso del espermatóforo, el número de espermatozoides por

espermatóforo y el aumento del porcentaje de espermatozoides muertos y anormales

de los espermatóforos extraídos consecutivamente durante el experimento.

3) La composición bioquímica general del espermatóforo fue de 36.3% de proteínas,

4.6% de lípidos y 25.8% de carbohidratos y el pellet comercial tiene la proporción

más parecida.

4) El análisis histológico no reveló ninguna diferencia atribuible a las dietas o los

tamaños de los individuos, sin embargo, se describió por primera vez el tamaño y la

morfología fina típica del espermatozoide de M. americanum.

5) El tiempo recomendable de mantenimiento de los reproductores machos de M.

americanum bajo cautiverio sería de un máximo de cuatro meses (120 días) debido a

que después de ese periodo los langostinos mostraron evidencia de agotamiento

reproductivo mediante la disminución en la calidad espermática y de la producción

del espermatóforo.

6) No se detectaron diferencias significativas de los indicadores de calidad

espermática en función de las tres dietas provistas y por lo tanto se recomendaría

alimentar a los reproductores macho con alimento pelletizado pues es de menor

costo y más fácil de proporcionar a los langostinos que el alimento fresco.

64

7) Se evidencio un daño físico por la electro estimulación, se deben probar distintos

voltajes e intervalos de extracción de espermas que permita llegar a una eficiente

obtención de espermas con el mínimo daño posible a los machos reproductores.

65

REFERENCIAS

Alfaro-Montoya, J. 2010. The reproductive conditions of male shrimps, genus

Penaeus, sub-genus Litopenaeus (open thelyca penaeoid shrimps): a review.

Aquacult., 300: 1–9.

Alfaro-Montoya, J. 2013. Descripción histológica de la oogénesis y espermatogénesis

del camarón de cultivo, Litopenaeus vannamei. Rev. Biol. Mar. Oceanogr.

48(2): 335–344.

Álvarez, N. 1997. Los crustáceos Decápodos de agua dulce de México. Universidad

Nacional Autónoma de México. Instituto de Biología. Informe final SNIB-

CONABIO proyecto No. E002. México D.F. 7 p.

A.O.A.C. Association of Official Analytical Chemists. 1995. Official Methods of

Analysis, 16ª ed., Arlington: AOAC International. 1141 p.

Arana-Magallón, F. & Ortega-Salas, A. 2004. Rearing of the cauque prawn under

laboratory conditions. N. Am. J. Aquacult., 66: 158–161.

Cabrera-Jiménez, J., Chávez C. & C. Martínez. 1979. Fecundidad y cultivo de

Macrobrachium tenellum (Smith) en el laboratorio. Anexo Instituto de

Ciencias del Mar y Limnología. Universidad Nacional Autónoma de México,

Zool. 50(1): 127–152.

Castille, F. L. & A. L. Lawrence. 1989. Relationship between maturation and

biochemical composition of the gonads and digestive glands of the shrimps

Penaeus aztecus (Ives) and P. setiferus (L.). J. Crust. Biol. 9: 201–211.

Ceballos-Vázquez, B. 2003. Evaluación del potencial reproductivo de camarón

blanco Litopenaeus vannamei en condiciones de domesticación. Tesis

doctoral. La Paz, B.C.S. Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste,

S. C. 178 p.

Chaves, T. 2010. Avaliação de técnicas de criopreservação de sêmen do camarão

branco, Litopenaeus schmitti (Crustacea, Dendrobranchiata, Penaeidae).

Dissertação para obtenção de título de Mestre em Ciências na UFRRJ.

Seropédica/RJ, abril, 28 p.

Claudet, V., Selvakumar, N., Munuswamy, N. & Coman, G. J. 2016. Preliminary

studies on the sperm characteristics and sperm quality of Macrobrachium

66

rosenbergii (De Man, 1879). IJIRSET, 5(9): 2347–6710.

Arnold, S. J., Callaghan, T. R. & Preston, N. P. 2007. Effect of two maturation diet

combinations on reproductive performance of domesticated Penaeus

monodon. Aquacult. 263: 75–83.

De la Cruz, M. 1968. Contribución al conocimiento de los Palemónidos de México: III.

Palemónidos del Golfo de California, con notas sobre la biología de

Macrobrachium americanum Bate. F.A.O. Fish. Rep., 2(57): 373–380.

Diarte-Plata, G., Escamilla-Montes, R., Granados-Alcántar, S., Sainz Hernández, J. &

F. Arzola-González. 2012. Aspectos poblacionales del langostino de río

Macrobrachium americanum (Bate, 1868). 93–113 pp. En: Martínez-Ruiz, R.,

Martínez-Valenzuela, M. & Rojo-Martínez, G. (Eds.). Recursos Naturales y

Sistemas Productivos. 1ª edición, México.

Díaz, A., Fernandez-Gimenez, A., Petriella, A. & Fenucci, J. 2002. Morphological and

functional study of the male reproductive tract in the shrimp P. muelleri Bate

(Decapoda, Panoeoidea). Invertebr. Reprod. Develop. 42: 69-74.

Díaz-Monge, F. 2011. Producción larval de camarón de río nativo, Macrobrachium

americanum, en laboratorio. Informe de investigación sobre producción larval

de camarón nativo de río, Macrobrachium americanum. Universidad de San

Carlos de Guatemala. 88 pp.

Fontaine, C. T. & Lightner, D. 1973. Observations on the process of wound repair in

penaeid shrimp. J. Invert. Pathol., 22: 23–33.

García-Guerrero, M., Becerril-Morales, F., Vega-Villasante, F. & L. Espinosa-

Chaurand. 2013. Los langostinos del género Macrobrachium con importancia

económica y pesquera en América Latina: conocimiento actual, rol ecológico

y conservación. Lat. Am. J. Aquat. Res. 41(4): 651–675.

Gómez-Gutiérrez, J., Feinberg, L., Shaw T., Peterson W. 2007. Interannual and

geographical variability of the brood size of the euphausiids Euphausia

pacifica and Thysanoessa spinifera along the Oregon coast (1999–2004).

Deep Sea Res. Part I: Ocean. Res. Pap. 54 (12), 2145-2169.

Hernández-Valencia, A. 2010. Evaluación de la frecuencia alimenticia en cultivo

larvario del langostino de río Macrobrachium americanum Bate. 1868

67

(Decapoda: Palaemonidae), en Guasave de Levva, Sinaloa y Coyuca de

Benítez, Guerrero. Tesis de licenciatura. Universidad Autónoma de Guerrero,

Unidad Académica de Ecología Marina. 62 pp.

Harrison, K. 1990. The role of nutrition in maturation, reproduction and embryonic

development of Decapod Crustaceans: a review. J. Shellfish Res. 9: 1–28.

Krol, M., Hawkins, W. & R. Overstreet. 1992. Reproductive components. Pág. 295–

343 en: Humes, A. G. & F.W. Harrison (Eds). Microscopic anatomy of

invertebrates. Crustacea, Vol. 10. Wiley-Liss , New York.

Leung-Trujillo, J. & A. Lawrence. 1987. Observations on the decline in sperm quality

of Penaeus setiferus under laboratory conditions. Aquacult. 65: 363–370.

López-Greco, L. S. 2013. Functional anatomy of the reproductive system. 413-450.

En: Watling, L. & Thiel M. (Ed.) Functional Morphology and Diversity. Oxford

University Press, USA, 516 p.

McLaughlin, P. A 1983. Internal anatomy. Pag. 1-52. In: Mantell H. (Editor). The

Biology of Crustacea. Internal Anatomy and Physiological Regulation.

Academic Press, New York, v. 5, 471 p.

Meunpol, O., Meejing, P. & S. Piyatiratitivorakul. 2005. Maturation diet based on fatty

acid content for male Penaeus monodon (Fabricius) broodstock. Aquac. Res.

36: 1216–1225.

Nagabhushanam, R. & G. K. Kulkani. 1981. Effect of exogenous testosterone on the

androgenic gland and testis of a marine penaeid prawn. Parapenaeopsis

hardwikii (Miers) (Crustacea, Decapoda, Penaeideae). Aquacult. 23: 19–27.

Nates, R. J. L. & H. A. Villalobos. 1990. Dos especies nuevas de camarones de agua

dulce del género Macrobrachium Bate (Crustacea, Decapoda, Palaemonidae)

en la vertiente occidental de México. Ann. Inst. Biol. UNAM (61)1: 1–11.

New, M. B. 2002. Farming freshwater prawns. A manual for the culture of the giant

river prawn (Macrobrachium rosenbergii). FAO Fish. Tech. Pap. 428. Roma,

p. 33.

Pérez-Jar, L. 2005. Fisiología y calidad reproductiva de machos de camarón blanco

Litopenaeus schmitti en condiciones de cautiverio. Tesis doctoral. La Paz,

B.C.S. Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, S. C. 113 p.

68

Pérez-Velázquez, P., Ulloa-Ramírez, P. & J. Patiño-Valencia. 2006. Análisis

preliminar de la pesquería comercial de langostinos del río Ameca, Nayarit. III

Foro Científico de Pesca Ribereña. SAGARPA-INP. Puerto Vallarta, Jalisco.

21-22.

Pochon-Masson, J. 1983. Arthropoda-Crustacea. Adiyodi, K. G. & R. G. Adiyodi. Eds.

Reproductive biology of Invertebrates. Vol. II: Spermatogenesis and sperm

function. New York: John Wiley & Sons Ltd. Ch 21: 407-449.

Poljaroen, J., Vanichviriyakit, R., Tinikul, Y., Phoungpetchara, I., Linthong, V.,

Weerachatyanukul, W. & P. Sobhon. 2010. Spermatogenesis and distinctive

mature sperm in the giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii (De

Man, 1879). Zool. Anzeiger. 249: 81–94.

Racotta, I. S., Palacios, E. & A. M., Ibarra. 2003. Shrimp larval quality in relation to

broodstock condition. Aquacult. 227: 107–130.

Ra’Anan, Z. 1987. Maturation vs. growth in males and females of the fresh water

prawn Macrobrachium rosenbegii - description of pattern and implications to

aquacultural practices. World Aquacult. Soc., Jan. 18-23

Sasikala, S. L. & T. Subramoniam. 1987. On the occurrence of acid

mucopolysaccharides in the spermatophores of two marine prawns, Penaeus

indicus (Milne-Edwards) and Metapenaeus monoceros (Fabricius) (Crustacea:

Macrura). J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 133: 145–153.

Viana da Costa, T., Yoshii-Oshiro, L., López-Greco, L., Melo, P., Antunes de Mattos,

L. & Bambozzi-Fernandes A. 2016. Determinación del voltaje y el tamaño del

animal óptimos para la extracción de espermatóforos en el camarón de agua

dulce Macrobrachium acanthurus. Lat. Am. J. Aquat. Res., 44(2): 422-428.

Wouters, R., Lavens, P., Nieto, J., & P. Sorgeloos, 2001. Penaeid shrimp broodstock

nutrition: an updated review on research and development. Aquacult. 202: 1–

21.

Yamasaki-Granados, S., García-Guerrero, M., Vega-Villasante, F., Castellanos-León,

F., Cavalli, R. & E. Cortés-Jacinto. 2013. Experimental culture of the river

prawn Macrobrachium americanum larvae (Bate, 1868), with emphasis on

feeding and stocking density effect on survival. Lat. Am. J. Aquat. Res. 41(4):

69

793–800.

Zar, J. H. 1998. Biostatistical analysis. In: Prentice-Hall (ed.). 4th. Upper Saddle

River , New Jersey, USA. pp 236-346.

70

ANEXOS A.TECNICA DE INCLUSIÓN EN

PARAFINA

Fijación de tejidos:

-Los tejidos se fijan en solución Davidson

durante 48 h. Se cambian a alcohol etílico

al 70% transcurridas 48 h.

Deshidratación:

-Alcohol etílico 70% I y II durante una

hora en c/u

-Alcohol etílico 80°( 1 hora )

-Alcohol etílico 90° (1 hora)

-Alcohol etílico 96° I y II (una h c/u)

-Alcohol etílico 100 I, II, III (1 h en c/u)

-Mezcla de alcohol etílico absoluto-xilol (

1:1) 20 minutos.

-Xilol absoluto (100 %) 5-10 minutos.

Tiempo total de deshidratación: Tejidos

9.5 h.

Infiltración en parafina

-Parafina-xilol (1:1) 30 minutos

-Parafina (Paraplast) I (1 a 2 h)

-Parafina (Paraplast) II (1 a 2 h)

-Pafafina (Paraplast) III ( 1 a 2 h)

-Parafina (Paraplast) IV (1 a 2 h)

Tiempo total de infiltración en parafina: 8.5

h.

B. CORTE EN MICROTOMO DE

ROTACION A 4 MICRAS

C. TECNICA DE TINCION

HEMATOXILINA EOSINA (de Harris).

1.-Xilol I, II y III-(10 min en cada uno).

2.-Alcohol etílico 96% (2 min).

3.- Alcohol etílico 70% I y 70% II- 2 min c/u

4.-Agua destilada 5 min.

5.-Hematoxilina de Harris 4 min

(hematoxilina natural, le damos 4 min)

6.-Agua corriente 5 min y agua destilada 5

min

7.-Alcohol ácido 10-15 segundos (1 lt

alcohol 96% con 5 gotas de ácido

clorhídrico)

8.- Agua destilada 5 min

9.- Agua amoniacal (hidróxido de amonio,

5 gotas por caja de tinción)10-15

segundos

10.-Agua destilada 5 min

11.-Alcohol etílico 50% 2 min

12.- Alcohol etílico al 70% 2 min

13.- Eosina 3 min

14.- Alcohol 96% I y II, 1-2 min c/u

15.- Alcohol 100% I y II, 1 min c/u

16.- Citrisolv l I, II, III 5 min c/u.

17.- Montar en resina sintética o Entellan.

Los núcleos quedan teñidos de color azul

a morado y los citoplasmas de naranja,

rojo o rosa.

biologÍa reproductiva (calidad …...5 proyectos: conacyt cb2010/156252, de infraestructura 2014/...

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