bioinformatica-tecnologías de recombinacion genética
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Vector de expresion, Diseño de PrimersTRANSCRIPT
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONALUNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍASEGUNDO EXAMEN PARCIAL DE TECNOLOGÍA DE LA RECOMBINACIÓN GENÉTICAFECHA Y HORA DE APLICACIÓN: 26 ABRIL 2011, 10.00FECHA Y HORA DE ENTREGA : 28 ABRIL 2011, 8.30PROF. JESÚS AGUSTIN BADILLO CORONANOMBRE:INSTRUCCIONES: Seguir la indicaciones y proporcionar la información solicitada de manera concisa y clara. El examen deberá ser devuelto impreso y únicamente con la información solicitada.
1. Proponer un gen que codifique para una proteína de interés biotecnológico o farmacéutico o ambiental. (valor 4 puntos)
a. Indicar que base de datos utilizóNCBI
b. Indicar el numero de acceso del gen NM_002273.3
c. Indicar el nombre del gen así como de la proteína para la cual codifica. /gene="KRT8" /gene_synonym="CARD2; CK8; CYK8; K2C8; K8; KO" /note="cytokeratin 8; CK-8; keratin-8; cytokeratin-8; type-II keratin Kb8" /codon_start=1 /product="keratin, type II cytoskeletal 8" /protein_id="NP_002264.1”
d. Indicar a que organismo pertenece este genORGANISM Homo sapiens
e. Comentar sobre la importancia biotecnológica o farmacéutica o ambiental de este gen.
Este gen es miembro del tipo II de la familia queratina agrupado en el brazo largo del cromosoma 12. Las queratinas Tipo I y Tipo II se heteropolimerizan para formar filamentos de tamaño intermedio en el citoplasma de células epiteliales. El producto de este gen típicamente dimeriza con queratina 18 para formar filamentos intermediarios en simples células epiteliales de una sola capa. Esta proteína juega un papel in mantener la integridad de la estructura celular y también funciona en la transducción de señales además de la diferenciación celular. La mutacion en este gen causa cirrosis criptogénica. La cirrosis criptogénica constituye del 3-30% de todos los casos de cirrosis. Típicamente se diagnostica después de una evaluación exhaustiva que incluye diagnóstico serológico, para eliminar etiologías identificables y usualmente después de una biopsia hepática. Los principales factores de riesgo para cirrosis criptogénica son: esteatohepatitis no alcohólica (NASH), obesidad, diabetes e hiperlipidemia. Hay factores genéticos que podrían explicar la progresión de esteatosis a cirrosis. Los polimorfismos en genes que codifican citocinas, leptina, queratinas y proteínas del metabolismo de hierro, pueden explicar la susceptibilidad a desarrollar cirrosis.
Mostrar la secuencia del gen seleccionado en formato FASTA dejando la información que aparece después del símbolo > (en caso de que la secuencia sea muy larga, utilizar tamaño de
letra 5).
>gi|196162709|ref|NM_002273.3| Homo sapiens keratin 8 (KRT8), mRNAAAAAGGCCATTCCTGAGAGCTCTCCTCACCAAGAAGCAGCTTCTCCGCTCCTTCTAGGATCTCCGCCTGGTTCGGCCCGCCTGCCTCCACTCCTGCCTCTACCATGTCCATCAGGGTGACCCAGAAGTCCTACAAGGTGTCCACCTCTGGCCCCCGGGCCTTCAGCAGCCGCTCCTACACGAGTGGGCCCGGTTCCCGCATCAGCTCCTC
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f. En caso de que el gen seleccionado tenga intrones, removerlos y mostrar la secuencia ya sin intrones (en caso de que la secuencia sea muy larga, utilizar tamaño de letra 5).
mol_type="mRNA"
g. Mostrar la secuencia de la proteína
>gi|4504919|ref|NP_002264.1| keratin, type II cytoskeletal 8 [Homo sapiens]MSIRVTQKSYKVSTSGPRAFSSRSYTSGPGSRISSSSFSRVGSSNFRGGLGGGYGGASGMGGITAVTVNQSLLSPLVLEVDPNIQAVRTQEKEQIKTLNNKFASFIDKVRFLEQQNKMLETKWSLLQQQKTARSNMDNMFESYINNLRRQLETLGQEKLKLEAELGNMQGLVEDFKNKYEDEINKRTEMENEFVLIKKDVDEAYMNKVELESRLEGLTDEINFLRQLYEEEIRELQSQISDTSVVLSMDNSRSLDMDSIIAEVKAQYEDIANRSRAEAESMYQIKYEELQSLAGKHGDDLRRTKTEISEMNRNISRLQAEIEGLKGQRASLEAAIADAEQRGELAIKDANAKLSELEAALQRAKQDMARQLREYQELMNVKLALDIEIATYRKLLEGEESRLESGMQNMSIHTKTTSGYA
GGLSSAYGGLTSPGLSYSLGSSFGSGAGSSSFSRTSSSRAVVVKKIETRDGKLVSESSDVLPK
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2. Utilizando el vector pET28a (ver mapa anexo) resolver y responder a los siguientes puntos tomando en cuenta el gen seleccionado en el punto 1. (valor 4 puntos)
a. Proponer un par de sitios de restricción en el polilinker para insertar el gen seleccionado en el punto 1. Proporcionar el nombre y la secuencia de los sitios de restricción.
BamHI y EagIb. ¿Dónde son cortados los sitios seleccionados en 2a y que tipo de extremos se
generan?
BamHI5’… G G A T C C … 3’3’… C C T A G G … 5’
“Sticky Ends”
EagI
5'...C G G C C G... 3'3'...G C C G G C... 5'
“Sticky Ends”
c. Verificar que estos sitios de restricción no estén presentes en el gen seleccionado en el punto 1. Mostrar los resultados obtenidos al digerir el gen en el digestor de la página de New England Biolabs (http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php) de que estas enzimas no cortan. En caso de que corten, volver al punto 2a y proponer otros sitios de corte.
# Enzyme Specificity 1 AbsI CC TCGA GG
2 Acc65I G GTAC C
3 AccI GT MK AC
4 AclI AA CG TT
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5 AfeI AGC GCT
6 AflII C TTAA G
7 AgeI A CCGG T
8 AhdI GACNN N NNGTC
9 AjuI (N)5 (N)7GAA(N)7TTGG(N)6 (N)5
10 AlfI NN (N)10GCA(N)6TGC(N)10 NN
11 AlwFI GAAAY(N)5RTG
12 ApaLI G TGCA C
13 ApyPI ATCGAC(N)18 NN
14 AscI GG CGCG CC
15 AseI AT TA AT
16 AsiSI GCG AT CGC
17 AvrII C CTAG G
18 BaeI (N)5 (N)10ACNNNNGTAYC(N)7 (N)5
19 BamHI G GATC C
20 BanI G GYRC C
21 BarI (N)5 (N)7GAAG(N)6TAC(N)7 (N)5
22 BciVI GTATCC(N)5 N
23 BclI T GATC A
24 BmgBI CAC GTC
25 BpuEI CTTGAG(N)14 NN
26 BsaBI GATNN NNATC
27 BsbI CAACAC(N)19 NN
28 BsgI GTGCAG(N)14 NN
29 BsiEI CG RY CG
30 BsiWI C GTAC G
31 BsmBI CGTCTCN NNNN
32 BsmI GAATG CN
33 BspDI AT CG AT
34 BspEI T CCGG A
35 BspHI T CATG A
36 BspQI GCTCTTCN NNN
37 BsrGI T GTAC A
38 BssHII G CGCG C
39 BstAPI GCAN NNN NTGC
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40 BstBI TT CG AA
41 BstZ17I GTA TAC
42 BtgZI GCGATG(N)10 NNNN
43 BtsI GCAGTG NN
44 ClaI AT CG AT
45 CspCI NN (N)11CAA(N)5GTGG(N)10 NN
46 DraI TTT AAA
47 DraIII CAC NNN GTG
48 DrdIV TACGAC(N)18 NN
49 EagI C GGCC G
50 EcoNI CCTNN N NNAGG
51 EcoRI G AATT C
52 EcoRV GAT ATC
53 FalI (N)5 (N)8AAG(N)5CTT(N)8 (N)5
54 FseI GG CCGG CC
55 GdiII C GGCC R
56 HaeII R GCGC Y
57 HaeIV (N)6 (N)7GAY(N)5RTC(N)9 (N)5
58 HgaI GACGC(N)5 (N)5
59 HgiEII ACC(N)6GGT
60 HpaI GTT AAC
61 KasI G GCGC C
62 KpnI G GTAC C
63 MaqI CRTTGAC(N)19 NN
64 MauBI CG CGCG CG
65 MluI A CGCG T
66 MmeI TCCRAC(N)18 NN
67 MreI CG CCGG CG
68 NarI GG CG CC
69 NdeI CA TA TG
70 NotI GC GGCC GC
71 NruI TCG CGA
72 NsiI A TGCA T
73 PacI TTA AT TAA
74 PasI CC CWG GG
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75 PcsI WCGNNN N NNNCGW
76 Pfl1108I TCGTAG
77 PflFI GACN N NGTC
78 PmeI GTTT AAAC
79 PpiI (N)5 (N)7GAAC(N)5CTC(N)8 (N)5
80 PshAI GACNN NNGTC
81 PsiI TTA TAA
82 PsrI (N)5 (N)7GAAC(N)6TAC(N)7 (N)5
83 PvuI CG AT CG
84 RceI CATCGAC(N)18 NN
85 RleAI CCCACA(N)9 NNN
86 RpaB5I CGRGGAC(N)18 NN
87 RpaBI CCCGCAG(N)18 NN
88 RsrII CG GWC CG
89 SacII CC GC GG
90 SalI G TCGA C
91 SapI GCTCTTCN NNN
92 SbfI CC TGCA GG
93 ScaI AGT ACT
94 SdeOSI NN (N)11GACNNNNRTGA(N)10 NN
95 SexAI A CCWGG T
96 SfoI GGC GCC
97 SgrAI CR CCGG YG
98 SgrDI CG TCGA CG
99 SnaBI TAC GTA
100 SpeI A CTAG T
101 SphI G CATG C
102 SpoDI GCGGRAG
103 SrfI GCCC GGGC
104 Sse8647I AG GWC CT
105 SspI AAT ATT
106 StuI AGG CCT
107 SwaI ATTT AAAT
108 TatI W GTAC W
109 TfiI G AWT C
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110 TsoI TARCCA(N)9 NN
111 TspGWI ACGGA(N)9 NN
112 TsuI GCGAC
113 Tth111I GACN N NGTC
114 UbaF14I CCA(N)5TCG
115 UbaF9I TAC(N)5RTGT
116 UbaPI CGAACG
117 XbaI T CTAG A
118 XmnI GAANN NNTTC
d. Diseñar un PAR de iniciadores (primers) para amplificar por PCR el gen seleccionado en 1. Mostrar solo el PAR de iniciadores seleccionados.
e. ¿Qué condiciones de temperatura y tiempos se necesitan para amplificar un producto de PCR con los primers diseñados?
Temperatura de entre 60.05 y 59.38 °C.Tiempo 1.802 minutos
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f. Mostrar la secuencia del producto de PCR amplificado.
231-gcagcaactt tcgcggtggc ctgggcggcg gctatggtgg ggccagcggc atgggaggca tcaccgcagttacggtcaac cagagcctgc tgagccccct tgtcctggag gtggacccca acatccaggc cgtgcgcacc caggagaagg agcagatcaa gaccctcaac aacaagtttg cctccttcat agacaaggta cggttcctgg agcagcagaa caagatgctg gagaccaagt ggagcctcct gcagcagcag aagacggctc gaagcaacat ggacaacatg ttcgagagct acatcaacaa ccttaggcgg cagctggaga ctctgggcca ggagaagctg aagctggagg cggagcttggcaacatgcag gggctggtgg aggacttcaa gaacaagtat gaggatgaga tcaataagcgtacagagatg gagaacgaat ttgtcctcat caagaaggat gtggatgaag cttacatgaacaaggtagag ctggagtctc gcctggaagg gctgaccgac gagatcaact tcctcaggca gctatatgaa gaggagatcc gggagctgca gtcccagatc tcggacacat ctgtggtgct gtccatggac aacagccgct ccctggacat ggacagcatc attgctgagg tcaaggcaca gtacgaggat attgccaacc gcagccgggc tgaggctgag agcatgtacc agatcaagta tgaggagctg cagagcctgg ctgggaagca cggggatgac ctgcggcgca caaagactga gatctctgag atgaaccgga acatcagccg gctccaggct gagattgagg gcctcaaagg ccagagggct tccctggagg ccgccattgc agatgccgag cagcgtggag agctggccat taaggatgcc aacgccaagt tgtccgagct ggaggccgcc ctgcagcggg ccaagcagga catggcgcgg cagctgcgtg agtaccagga gctgatgaac gtcaagctgg ccctggacat cgagatcgcc acctacagga agctgctgga gggcgaggag agccggctgg agtctgggat gcagaacatg agtattcata cgaagaccac cagcggctat gcaggtggtc tgagctcggc ctatgggggc ctcacaagcc ccggcctcag ctacagcctg ggctccagct ttggctctgg cgcgggctcc agctccttca gccgcaccag ctcctccagg gccgtggttg tgaagaagatcgagacacgt gatgggaagc tggtgtctga gtcctctgac gtcctgccca agtgaacagc tgcggcagcc cctcccagcc tacccctcc-1589
g. ¿Cómo cambiarían estos iniciadores si se quisiera introducir los sitios de restricción seleccionados en 2a?
BamHIG GATC C Forward primer GCAGCAACTTTCGCGGTGGC +
G GATC C Reverse primer GGAGGGGTAGGCTGGGAGGG
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EagI C GGCC G Forward primer GCAGCAACTTTCGCGGTGGC +
C GGCC G Reverse primer GGAGGGGTAGGCTGGGAGGG
h. ¿sobre que antibiótico se deberán crecer las células a las que se les introduce el vector pET28a?
Kanamicina.
i. ¿cuál es el origen del promotor T7? ¿cómo es que este promotor es funcional en bacteria? ¿la polimerasa de origen bacteriano reconoce este promotor? Si no es así, que polimerasa lo reconoce?
El Origen del Promotor T7 es VIRAL. El promotor del fago T7 necesita la ARN polimerasa específica del mismo fago, por lo que si queremos expresar genes bajo ese promotor, hay que clonar simultáneamente el gen de la polimerasa de T7. Normalmente este gen de la polimerasa se inserta en el cromosoma de E. coli o en el profago (la versión insertada del cromosoma del en las células lisogénicas) y bajo el control del promotor de lac. Entonces se procede a transformar las células con la construcción genética dotada del gen de interés aguas abajo del promotor del T7. Cuando añadimos el inductor IPTG, se induce el gen de la polimerasa de T7, proteína que transcribe a gran nivel el gen que hemos clonado.
3. Utilizando la siguiente secuencia (valor 2 puntos):Seq1. ATGTTCCATTTGACAAGCAGAGATGGGGAACCAAGAATGATAGTGGGAAAGAATGAGAGAGGTAAGTCACTTCTGTTTAAAACTGCAAGTGGAATTAATATGTGCACACTGATTGCAATGGATCTAGGGGAGATGTGTGATGATACAGTAACTTACAAGTGTCCTCATATTACAGAGGTTGAACCAGAAGATATAGACTGCTGGTGCAATTTGACCTCAACTTGGGTAACTTATGGCACTTGCAATCAAGCCGGTGAGCATAGAAGGGATAAGCGTAGCGTGGCATTGGCCCCTCATGTCGGCATGGGACTTGACACTCGAACTCAGACTTGGTAA
a. Realizar un Blast en el NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_PROGRAMS=megaBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK_LOC=blasthome) e indicar de que gen se trata.
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b. Utilizando la secuencia seq1 y seq2 (proporcionada en este punto), realizar un alineamiento pairwise (http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_matcher/nucleotide.html) de las dos secuencias utilizando las herramientas disponibles en Expasy. Mostrar el alineamiento y resaltar las diferencias. ¿Cuál es el porcentaje de identidad?
Seq2. ATATTCCATTTGACAAGCAGAGATGGGGAACCAAGAATGATAGTGGGAAAGAATGAGGGAGGTAAGTCACTTCTGTTTAAAACTGCAAGTGGAATTAATATGTGCACACTGATTGCAATGGATCTAGGTGAGATGTGAGATGATACAGTAACTTACAAGTGTCCTCATATTACAGAGGTTGAACCAGAAGATATAGACTGCTGGTGCAATTTGACCTCAACTTGGGTAACTTATGGCACTTGCAATCAAGCCGGTGAGCATAGAAGGGATAAGCGTAGCGTGGCTTTGGCCCCTCATGTCGGCATGGGACTTGACACTCGAACTCAGACTTGGTA
EMBOSS_001 1 ATGTTCCATTTGACAAGCAGAGATGGGGAACCAAGAATGATAGTGGGAAA 50||.|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
EMBOSS_001 1 ATATTCCATTTGACAAGCAGAGATGGGGAACCAAGAATGATAGTGGGAAA 50
EMBOSS_001 51 GAATGAGAGAGGTAAGTCACTTCTGTTTAAAACTGCAAGTGGAATTAATA 100|||||||.||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
EMBOSS_001 51 GAATGAGGGAGGTAAGTCACTTCTGTTTAAAACTGCAAGTGGAATTAATA 100
EMBOSS_001 101 TGTGCACACTGATTGCAATGGATCTAGGGGAGATGTGTGATGATACAGTA 150||||||||||||||||||||||||||||.||||||||.||||||||||||
EMBOSS_001 101 TGTGCACACTGATTGCAATGGATCTAGGTGAGATGTGAGATGATACAGTA 150
EMBOSS_001 151 ACTTACAAGTGTCCTCATATTACAGAGGTTGAACCAGAAGATATAGACTG 200||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
EMBOSS_001 151 ACTTACAAGTGTCCTCATATTACAGAGGTTGAACCAGAAGATATAGACTG 200
EMBOSS_001 201 CTGGTGCAATTTGACCTCAACTTGGGTAACTTATGGCACTTGCAATCAAG 250||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
EMBOSS_001 201 CTGGTGCAATTTGACCTCAACTTGGGTAACTTATGGCACTTGCAATCAAG 250
EMBOSS_001 251 CCGGTGAGCATAGAAGGGATAAGCGTAGCGTGGCATTGGCCCCTCATGTC 300||||||||||||||||||||||||||||||||||.|||||||||||||||
EMBOSS_001 251 CCGGTGAGCATAGAAGGGATAAGCGTAGCGTGGCTTTGGCCCCTCATGTC 300
EMBOSS_001 301 GGCATGGGACTTGACACTCGAACTCAGACTTGGTA 335|||||||||||||||||||||||||||||||||||
EMBOSS_001 301 GGCATGGGACTTGACACTCGAACTCAGACTTGGTA 335
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