El DNA o RNA información genética

2. Es flexible

3. Modificación de la información para generar nuevas instrucciones

Replicación, reparación

Mutaciones

Información basada en el orden

CriticoInstrucciones

4. Informacion pasa de generacion en generacion;

• cada cadena puede servir como molde para fabricar su complementaria;

ATGCCTTTAACCGATAG

TACGGAAATTGGCTATC

Las secuencias de ADN son copiadas exactamente durante los procesos de replicación

Errores= Mutaciones

Variabilidad Genética o cambios evolutivos

Secuenciar un ADN equivale a descifrar su mensaje genético. • El Codigo• Genético

Técnicas Moleculares Herramientas de la Biologia Molecular

Aloenzimas, Southern, Northern

RFLP’s

PCR- simples, multiples, cuantitativas

MicrosatélitesAFLP’s

SECUENCIACION

PRINCIPIOS EXTRACCION ADN

¿Cómo podemos extraer el DNA de cualquier tejido?

Selección de las muestras yExtracción de DNA

Es Importante Diferenciar dos Conceptos Extracción: sacar los componentes desde

un compartimento celular. Involucra: Lisis de las células que contienen a los AN Inactivación de nucleasas Clarificación: separación de los AN de los restos

celulares (debris). Purificación: Separación de AN:

De proteínas solubles De otros AN no deseados De Lípidos, carbohidratos De sales y otros compuestos orgánicos

EL PROBLEMA

Para muchas aplicaciones que involucran manipulación de AN es necesario disponer de éstos en estado puro.

Por qué purificar?• Nucleasas que se liberan al lisar las células degradan los

ácidos nucléicos.

• Interferentes que inhiben a las enzimas que se usan en ingeniería genética. • El desafío es separar los ácidos nucléicos deseados desde una

mezcla compleja, manteniendo la integridad de los AN

• Contaminantes: Proteínas, lípidos y carbohidratos, sales del medio, iones, etc.

Disgregación o fragmentación del tejido

Lisis celular

Clarificación

Purificación

AnálisisCualitativo:electroforesis

Cuantitativo: espectrofotometría UV

Etapas básicas de un procedimiento general para Extracción y Purificación de AN

Estas etapas deben ir acompañadas de medidas o agentes que inactiven nucleasas celulares

Durante todo el

procedimiento se

debe usar

soluciones y

material estéril, ademas

de guantes

1. Métodos de fragmentación y lisis celular para la extracción de AN

Métodos físicos Homogenización mecánica, Homogenización en solución Molienda manual en mortero Bolitas de vidrio Sonicación

El procedimiento ideal de lisis debe tener la fuerza necesaria para romper el material de inicio (células o tejido) y la delicadeza requerida

para preservar las moléculas de interés (ADN o ARN).

• Métodos químicos– Detergentes

• Métodos enzimáticos– Lysozima: rompe enlaces -1.4- entre N-acetil murámico y N-

acetil glucosamina de peptidoglicán de la pared celular de bacterias

– Lyticasa: rompe enlaces -1.3 de glucano de levaduras– Proteasas: rompe enlaces peptídicos de prot. de pared y

membrana plasmática e interacciones célula-célula.

Procedimiento

Seleccione un tejido bien preservado

Destrucción química y mecánica de las células del tejido

Desnaturalización de las Proteínas con la proteinasa K y precipitación con la centrifugación.

La funcion basica del aislamiento del DNA esla ruptura de la estructura celular se produce un lisado, se separa el DNA soluble de los fragmentos de elementos y otros materiales insolubles y purificar este DNA de las proteinas solubles y otros acidos nucleicos.

Historicamente esto se ha hecho con soluciones organicas como el fenol-cloroformo seguidos de un precipitacion con etanol; otros utlizan sales y dialisis.

Estos metodos emplean mucho tiempo y se utilizan sustancias con peligro para la salud humana

SoapGrease Grease and Soap

Heads

Tails

DNA Extraction Procedure - 2

Obtain DNA from digestion Add ethanol

Centrifuge

Wash the pellet

Resuspend

http://www.youtube.com/watch?v=JNl1kjw9ZDQ&feature=related

ELECTROFORESIS

Visualización del DNA

Aloenzimas

La técnica más ampliamente usada en los inicios de la Biología molecular, consiste en la detección de las variantes electroforéticas de enzimas.

Nimiadina Herrera- STRI

Toma en cuenta el hecho de que diferentes fragmentos de proteínas no desnaturalizadas migran a diferentes velocidades a través de geles de agarosa o acrilamida (o medios de soporte como las tiras de celulosa) a los cuales se les ha aplicado una corriente electrica

Automated Sequencing

Secuenciación A T C G A T C G A T C G A T C G