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216 Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 216-230ISSN 0325-7541

Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 216-230ACTUALIZACIÓN

Avances en el desarrollo de vacunas contrala neosporosis bovina

YANINA P. HECKER1*, MARÍA C. VENTURINI2, CARLOS M. CAMPERO1, ANSELMO C. ODEÓN1,DADÍN P. MOORE1

1Patología Veterinaria, Estación Experimental Agropecuaria, Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA), CC 276(7620) Balcarce; 2Laboratorio de Parasitología e Inmunoparasitología, Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad

Nacional de La Plata (UNLP), 60 y 118 (1900) La Plata, Argentina.*Correspondencia. E-mail: [email protected]

RESUMENLa neosporosis es una enfermedad que ocasiona abortos en bovinos y está causada por un protozoo intracelularobligado denominado Neospora caninum. Las graves pérdidas económicas que provoca en los sistemas deproducción de bovinos justifica la necesidad de avanzar en el desarrollo de vacunas. La resistencia a parásitosApicomplexa está asociada a una respuesta inmune T helper 1 mediada por linfocitos T CD4 citotóxicos y a laproducción de interferón-gamma, interleuquina-12, factor de necrosis tumoral e inmunoglobulina G2. La disminuciónde la transmisión vertical en las sucesivas preñeces y el bajo nivel de repetición de abortos en animalesinfectados sugieren la existencia de mecanismos inmunitarios de protección. Hasta el momento se conoce que lainoculación pre-servicio con taquizoítos vivos protege contra la infección y el aborto. Los antecedentes dedesarrollo de vacunas vivas contra otros protozoos estimulan a los investigadores a continuar en la búsqueda deuna vacuna de este tipo contra N. caninum de buena eficacia. Por otra parte, una vacuna inactivada, aun con unabaja eficacia, es útil en la prevención del aborto en aquellos establecimientos donde la enfermedad es epizoótica.Una vacuna contra la neosporosis debería evitar el aborto, la transmisión transplacental y la persistencia de lainfección. Este trabajo menciona los diversos tipos de vacunas que han sido evaluados hasta el momento,incluyendo inmunógenos inactivos, taquizoítos vivos, antígenos recombinantes y vacunas en vectores.

Palabras clave: Neospora caninum, bovinos, aborto, vacuna

ABSTRACTAdvances in the development of vaccines for bovine neosporosis. Neosporosis, a disease caused bythe obligate intracellular protozoan Neospora caninum, produces abortions in cattle. The severe economic lossesin cattle industry justify the need to develop control measures for preventing bovine abortion. Apicomplexanparasitic resistance is associated with T helper 1 immune response mediated by CD4 cytotoxic T lymphocytes,the production of interferon-gamma, interleukin-12, tumor necrosis factor and immunoglobulin G2. The reduction ofvertical transmission in subsequent pregnancies and the low levels of abortion repetition suggests the existenceof protective immune mechanisms. Inoculation with live tachyzoites before mating protects against infection andabortion. Antecedents of the development of live vaccines against other protozoa stimulate research to develop alive vaccine against N. caninum. On the other hand, an inactivated vaccine with low efficacy against neosporosisis useful in the prevention of abortion in farms with epizootic disease. A neosporosis vaccine should avoidabortion, transplacental transmission and infection persistence. In the present work, advances in vaccinedevelopment including lysate of tachyzoites, live parasites, recombinant antigens and vaccine vectors are reviewed.

Key words: Neospora caninum, bovines, abortion, vaccine

INTRODUCCIÓN

Generalidades de la enfermedadLa neosporosis es una enfermedad que ocasiona

abortos en bovinos y está causada por un protozoointracelular obligado denominado Neospora caninum.Su ciclo de vida es heteroxeno e involucra tres estadiosparasitarios reconocidos: taquizoítos, bradizoítos yesporozoítos (22). Los taquizoítos y bradizoítos se

encuentran en hospedadores intermediarios (bovinos,ovinos, caprinos, búfalos, ciervos, equinos y otrasespecies de sangre caliente), mientras que losesporozoítos contenidos en esporocistos se eliminandentro de ooquistes en las heces de los hospedadoresdefinitivos (perros, dingos y coyotes) (8, 26, 35, 48).

El ganado bovino se puede infectar de formahorizontal, por ingestión de ooquistes eliminados porel hospedador definitivo, y vertical o transplacental,

Vacunas contra la neosporosis 217

cuando la madre infectada transmite a su cría lainfección durante la gestación. Trees y Williams (81)propusieron el uso del término transmisión trans-placental endógena para definir la infección fetal apartir de la reactivación de una infección crónicalatente y así diferenciarlo de la transmisión trans-placental exógena, que alude a la infección fetal queocurre como resultado de la infección de la madrepor ingestión de ooquistes durante la preñez.Cualquiera de estas vías de transmisión conduce ala infección del feto y, ocasionalmente, al aborto. Elaborto es la principal manifestación clínica en laneosporosis bovina y se puede producir en formaenzoótica, asociado a frecuentes infecciones cró-nicas verticales, o epizoótica, en relación coninfecciones agudas posnatales (22).

Medidas de controlDesde el punto de vista económico, Reichel y Ellis

(70) mencionan que establecimientos con prevalenciasde N. caninum iguales o menores del 21 % puedenconvivir con la enfermedad sin implementar medidasde control.

Las medidas de lucha contra la neosporosis bovinapueden sustentarse en limitar el ciclo parasitario, enla quimioterapéutica y/o en el desarrollo de vacunas.Para limitar el ciclo parasitario se debe controlar elingreso de perros a las fuentes de agua y de alimentode los bovinos, también es preciso eliminar fetosabortados y realizar el control de roedores (22). Laeliminación de todos los animales infectados, aunqueeconómicamente inviable, sería desde el punto devista sanitario la opción más eficaz (70). Sin embargo,no existen garantías de minimizar el riesgo deinfección posnatal y tormentas de aborto teniendoun rodeo libre de N. caninum (22). Por otro lado, se hamencionado el empleo de transferencia embrionaria(12) y la reposición selectiva con animales serone-gativos como otra posible forma de control (22).

En relación con la quimioterapéutica, la aplicaciónde drogas in vitro ha llevado a resultados variables,y es escasa la información acerca de tratamientosin vivo para bovinos (22, 32). Experimentalmente seha evaluado el efecto del toltrazuril sobre N. caninumcon resultados alentadores, aunque el uso de estadroga en la práctica diaria es una opción económi-camente inviable (70).

Se han evaluado diversos tipos de vacunas. Lasvacunas inactivadas son seguras, pero handemostrado baja eficacia (25 a 60 %) y no previenenla transmisión vertical (74, 83). Sin embargo, son una

herramienta económicamente viable en hatos dondela seroprevalencia es superior al 21 % (70). Encontraposición, la vacunación con parásitos vivosen la hembra bovina genera protección no solo contrala transmisión vertical, sino también contra el aborto(30, 87), pero produce infecciones crónicas en elanimal (71). Por otra parte, los resultados obtenidoshasta el momento en trabajos donde se emplearonproteínas recombinantes y vectores no han sidoalentadores (1, 15, 39, 61, 71, 78). Una vacuna contrala neosporosis debería evitar el aborto, la transmisióntransplacental y la persistencia de la infección.

Situación actual de la enfermedad en el paísLa situación de la neosporosis en la Argentina ya

fue revisada previamente (53); sin embargo, desdeentonces se han realizado algunos estudios dediagnóstico, epidemiología y desarrollo de inmunó-genos experimentales.

En 2008, se implicó como causa de aborto a N.caninum en 10 % de 666 fetos que presentabanlesiones histopatológicas compatibles y resultaronpositivos mediante inmunofluorescencia indirecta (IFI)(fluido fetal >1:25) y/o inmunohistoquímica y/onested-PCR (55). Posteriormente, Moore et al. (56)demostraron que la prevalencia hallada en bovinos(IFI >1:200) fue diferente de acuerdo con la categoríaanalizada. En las categorías vaquillona de reposicióny vaca para carne se hallaron prevalencias del 2,6 %(n = 265) y 17,3 % (n = 1190), respectivamente. Porotra parte, en el ganado para leche se observó unaprevalencia en la vaquillona de reemplazo del 18,8 %(n = 2501), y en la vaca en ordeñe del 39,8 % (n = 291).

Avalando la hipótesis acerca de la transmisiónhorizontal, Moré et al. (58) describen que 9/19 ter-neros seronegativos precalostrales evidenciaron se-roconversión cuando fueron evaluados a los 7 meses(IFI >1:25).

BASES DE LA RESPUESTA INMUNITARIA EN LAENFERMEDAD NATURAL Y FACTIBILIDAD DEUNA VACUNA

La resistencia a parásitos Apicomplexa estáasociada a una respuesta inmunitaria T helper 1 (Th1)mediada por linfocitos T CD4+ citotóxicos, conproducción de IFN-γ (interferón-gamma), IL-12(interleuquina-12), FNT (factor de necrosis tumoral)e IgG2 (inmunoglobulina G2) (30, 31, 87).

La respuesta Th1 desencadenada por el parásitoal comienzo de la preñez genera una serie de

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procesos inmunopatológicos que son incompatiblescon el mantenimiento de la gestación. Por otro lado,en la gestación tardía, cuando la respuesta Th1 esmoderada, la lesión en la placenta es menor y el fetosobrevive (31). La disminución de la transmisiónvertical en las sucesivas preñeces y el bajo nivel derepetición de abortos en animales infectados sugierenla existencia de mecanismos inmunitarios adaptativosde protección (31, 49).

Williams et al. (86) desafiaron hembras preñadascrónicamente infectadas y no infectadas, y hallaronque los fetos de las hembras no infectadas murierona las 3-5 semanas posdesafío; sin embargo, lashembras con infección crónica parieron terneros sinsignos clínicos, pero congénitamente infectados. Re-sultados similares obtuvieron Andrianarivo et al. (6),quienes observaron que vaquillonas naturalmenteinfectadas parieron terneros infectados, a pesar dehaber sido inmunizadas con anterioridad con parásitosinactivados. También, Williams et al. (87) inmunizaronhembras bovinas a las 9 semanas pre-servicio yluego las desafiaron (día 70 de la gestación), yobservaron que la vacunación con taquizoítos vivosprevino eficientemente el aborto. Los estudios men-cionados alientan la posibilidad de desarrollar unavacuna contra esta enfermedad.

Hay referencias del desarrollo y empleo de vacunasvivas contra otros protozoos. Existe en el mercadouna vacuna contra Toxoplasma gondii elaborada apartir de taquizoítos vivos de la cepa S48, atenuadosluego de sucesivos pasajes. Esta vacuna presentauna elevada eficacia y un adecuado nivel de pro-tección contra el aborto durante 18 meses (10). Otrosejemplos de vacunas vivas son las existentes contrala coccidiosis aviar y la babesiosis bovina, quepresentan una eficacia de 80-90 % (32, 33, 71). Porotro lado, también existen en el mercado vacunasinactivadas con buena eficacia contra otros protozoosque afectan a los caninos, como es el caso de lagiardiosis y la leishmaniosis (33, 71).

Modelos experimentales murinosLa realización de ensayos experimentales en

bovinos implica un alto costo e insume tiempo debidoal período gestacional de esta especie. Por eso seha recurrido al uso de modelos experimentalesmurinos antes de pasar a la experimentación enbovinos.

En los modelos experimentales se han preferidoespecies de corta gestación y bajo costo de mante-nimiento, como ratones y meriones (Tabla 1). Se han

utilizado varias cepas de ratones, entre ellas losratones BALB/c y C57BL/6, porque los animalesenfermos manifiestan signos clínicos característicos,cambios en el peso corporal y lesiones histopatológicasconsiderables (40). La transmisión transplacental fueevaluada desafiando ratones Quackenbush (Qs), losque tienen la particularidad de ser resistentes a N.caninum, son muy prolíficos y pueden transmitireficazmente la infección a sus fetos in utero (51).

Rojo-Montejo et al. (72) describieron una cepa deN. caninum poco patógena en ratones. Esta fueposteriormente evaluada en bovinos, en los que seobtuvieron similares resultados. Se ha sugerido lautilización de esta cepa para el desarrollo de unavacuna viva en bovinos, considerando que eldesarrollo de la vacuna contra T. gondii con la cepaS48 fue posible gracias a la atenuación que se produjoluego de más de 3000 pasajes en ratón (10, 11).

Estudios en bovinosDebido a que el efecto de N. caninum sobre la

hembra bovina gestante varía según el períodogestacional que esté cursando (85), varios autoreshan realizado trabajos experimentales en diferentesmomentos de dicho período, para evaluar la respuestainmunitaria y sus consecuencias (Tabla 2). Algunosautores han inoculado taquizoítos vivos en el primertercio de la gestación y han observado el aborto entrelas 3 y las 6 semanas posinfección (44, 73, 85, 86).En contraste, en otros trabajos donde se inoculó N.caninum en el segundo tercio de la gestación, lainfección fetal fue el hallazgo más común y raramentese produjeron abortos (20, 45). La inoculación en elúltimo tercio de la gestación demostró que larespuesta inmunitaria fetal puede controlar la infec-ción y evitar el aborto, aunque los terneros nacenpersistentemente infectados (85).

Además de las vías de inoculación convencionalespara taquizoítos vivos (endovenosa, intramuscular,subcutánea), se han probado otros modelos expe-rimentales basados en la ingestión oral de ooquistes.Estos han demostrado que la infección del animaldepende de la dosis ingerida (27, 80). En adición, sehan estudiado también las vías de infección venéreay conjuntival. Serrano et al. (75, 76) concluyeron quesi bien vaquillonas inseminadas con semen infectadocon taquizoítos seroconvirtieron, es poco probableque esto ocurra naturalmente debido a que la dosisinfectante usada en el semen fue muy alta (22). Porotra parte, de Yaniz et al. (20) desafiaron vaquillonasseronegativas con 5 meses de gestación por vía


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conjuntival con taquizoítos vivos de N. caninum yobservaron que estas desarrollaron anticuerpos alsexto mes de gestación, pero revirtieron su condiciónserológica al final de la preñez.

Para la evaluación de inmunógenos experimentalesen bovinos se han utilizado modelos de vacunación/desafío que permiten mejorar el conocimiento de lainmunopatología de la enfermedad y evaluar laseguridad y eficacia de la vacuna. Innes et al. (30)utilizaron un modelo de vacunación pre-servicio ydesafío a mitad de la gestación en hembras bovinasseronegativas. Dicho estudio mostró que la respuestainmunitaria generada evitó la transmisión congénitaal feto. Por otra parte, Williams et al. (87) observaronque hembras bovinas inmunizadas pre-servicio contaquizoítos vivos no abortaron cuando fueron desa-fiadas al día 70 de gestación, y las madres no llegarona infectarse persistentemente.

VACUNAS EXPERIMENTALESEl desarrollo de los primeros inmunógenos expe-

rimentales en bovinos se sustentó en formulacionescon lisados completos de taquizoítos más la utiliza-ción de diversos adyuvantes, capaces de ocasionaruna respuesta inmunitaria similar a la producida porla enfermedad (4, 5, 16, 53, 57). Considerando lasecuencia cronológica de estas investigaciones,revisaremos brevemente el concepto de adyuvantes,para luego detallar los últimos avances en la pro-ducción y evaluación de antígenos.

AdyuvantesLos adyuvantes se utilizan para la formulación de

vacunas, combinados con los antígenos paraaumentar su inmunogenicidad e inducir mecanismosinmunitarios asociados a la protección (60). Existeuna gran variedad de compuestos químicos y bioló-gicos con propiedades adyuvantes; los más utilizadosen medicina veterinaria son las emulsiones de aceitemineral (agua en aceite o aceite en agua) y losadsorbentes (hidróxido de aluminio y fosfato dealuminio). En la actualidad, son cada vez más usadoslos sistemas de transporte de antígenos como loscomplejos inmunoestimulantes (ISCOM, por sussiglas en inglés) y los liposomas. La descripción ycaracterización de cada uno de ellos exceden losobjetivos de este trabajo, sin embargo, se men-cionarán aquellos utilizados en el desarrollo deinmunógenos experimentales para controlar laneosporosis.

Las sales de aluminio son adyuvantes relativa-mente débiles que principalmente inducen respuestadel tipo Th2, con producción de IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 e IgG1. Dicha característica hace que no seanadecuados para protozoos intracelulares como N.caninum, en los que la respuesta Th1 con producciónde IFN-γ, IL-12, FNT e IgG2 es fundamental para laprotección. Con este tipo de adyuvantes son pocofrecuentes los efectos adversos, por lo generalrelacionados con reacciones alérgicas y granulomasen el sitio de inoculación (60, 77).

Dentro del grupo de adyuvantes oleosos se en-cuentran las emulsiones de aceite en agua o agua enaceite, como Montanide 773, Marcol 52 y VSA-3.Dichos compuestos inducen una respuesta inmunitariatanto Th1 como Th2. Sin embargo, pueden provocarreacciones adversas en el sitio de inyección, conformación de granulomas, a causa de su limitadabiodegradabilidad y biocompatibilidad (60, 77).

Las saponinas son una mezcla de glicósidostriterpenoides derivados del extracto crudo de la cortezade un árbol llamado Quillaja saponaria, que tienenefectos adyuvantes pero son de elevada toxicidad. QuilA es una mezcla parcialmente purificada de esteextracto crudo, de menor toxicidad, que es usada enmedicina veterinaria en vacunas para bovinos, porcinos,equinos, caninos y felinos. El fraccionamiento de QuilA llevó a la obtención de 28 fracciones, de las cualeslas identificadas como QS21 y ISCOPREP 703 sonlas que más han sido estudiadas. Las saponinasinducen una importante respuesta Th1 al activar lavía endógena de procesamiento de antígenos, conproducción de IL-2 e IFN-γ. La seguridad de estoscompuestos depende de la ruta de administración,la especie y la saponina específica que se administra(25, 60, 77).

Otro grupo de adyuvantes que se han usado enmedicina veterinaria son los adyuvantes de Freund,de los cuales existen dos tipos: completo eincompleto. El adyuvante incompleto de Freund (FIA)consiste en una solución acuosa en la que se incluyeel antígeno, más un aceite mineral y un agentedispersante. Por otro lado, el adyuvante completo deFreund (FCA) presenta la misma composición que elincompleto, pero se le añade una suspensión demicobacterias muertas por calor. Estos compuestoshan sido utilizados durante muchos años y siguenempleándose, especialmente cuando se dispone decantidades limitadas de antígenos o cuando estospresentan baja inmunogenicidad. El FCA provoca unamejor activación de macrófagos que liberan IL-1, al


inducir la respuesta Th1 debido a la incorporacióndel muramil dipéptido. Sin embargo, este compuestopuede provocar efectos adversos (60, 77).

Una serie de polímeros sintéticos pueden serusados como adyuvantes dada su baja toxicidad,con una buena respuesta Th1 (77). Como ejemplo deeste tipo de compuestos se mencionan Polygen® yHavlogen®. Este último se prepara mezclandoCarbopol (resina soluble en agua) con detergentes,como el Tween 80 o el Span 20, y finalmente se añadeun aceite para producir la emulsión. El adyuvantePolygen® es una base de polímeros de bajo pesomolecular, que pueden formar enlaces cruzados ensolución para convertirse en un gel de alto pesomolecular. Sin embargo, los resultados obtenidos convacunas experimentales de N. caninum utilizandoPolygen® y Havlogen® como adyuvantes no fueronsatisfactorios (4, 5).

El empleo de los adyuvantes que incluyen secuen-cias CpG resulta una opción interesante. Este tipode secuencias de nucleótidos se halla presente enel ADN bacteriano y en el eucariota, pero en elsegundo son de baja expresión y se encuentranmetiladas. Debido a esto, cuando las secuenciasCpG ingresan al organismo son reconocidas comoun agente extraño por el sistema inmunitario, porreceptores de la familia Toll-like tipo 9. La elaboraciónde oligodeoxinucleótidos sintéticos (ODN) queexpresan motivos CpG (CpG-ODN) resulta una opcióninteresante en situaciones donde la cantidad deinmunógenos utilizada en la elaboración de vacunases subóptima. Este tipo de compuestos despiertanespecíficamente una respuesta Th1 con producciónde IFN-γ, el cual estimula la producción de IgG2 yfacilita el desarrollo de una respuesta citotóxica (36).

Los ISCOM son micropartículas esféricas huecasde 40 nm de diámetro, que están constituidas porlípidos, saponinas y antígenos. En general, la saponinaes Quil A, los lípidos pueden ser una mezcla decolesterol y fosfatidilcolina o bien fosfatidiletanolamina,y el antígeno puede ser una proteína con un dominiotransmembrana. Los ISCOM promueven la formaciónde anticuerpos y estimulan reacciones de hipersen-sibilidad retardada y citotoxicidad. La producciónprominente de IL-12 en el sistema inmunitario es unareacción típica inducida por los ISCOM, que tiene comoconsecuencia una importante respuesta Th1 (59).

Los liposomas son micropartículas lipídicas sintéticasque contienen encapsulado al antígeno para evitar surápida degradación. Se han obtenido buenos resultadosutilizando liposomas con antígenos de los agentes que

ocasionan la malaria y el cólera (60). En general, losliposomas generan mejor respuesta inmunitaria cuandose asocian con otros adyuvantes (77).

ANTÍGENOS UTILIZADOS

Vacunas a base de lisado de taquizoítosUno de los primeros trabajos realizados con lisados

de taquizoítos fue el de Andrianarivo et al. (4), quienesevaluaron la respuesta inmunitaria en bovinosutilizando tres adyuvantes sintéticos (Havlogen®,Polygen® y un tercero, que era la combinación deHavlogen® con Bay R-1005®), y también uno oleoso(Montanide ISA 773). En este estudio, la formulacióncon Polygen® fue uno de los productos que generómáxima respuesta de anticuerpos, con niveles deIFN-γ similares a los presentes en vaquillonasinfectadas con taquizoítos vivos. Posteriormente, elmismo grupo de trabajo evaluó la prevención de lainfección fetal en vaquillonas preñadas inmunizadasal día 35 de gestación con una vacuna a base delisado de taquizoítos y Polygen® (5). Las vaquillonasfueron desafiadas posteriormente con taquizoítosvivos. Los resultados mostraron que la formulaciónno fue efectiva y que todos los fetos resultaroninfectados. La respuesta proliferativa celular y laproducción de IFN-γ luego del desafío fueronsemejantes a las obtenidas posinmunización. En esemismo año, Choromansky et al. (16) evaluaron larespuesta inmunitaria humoral inducida por un lisadode taquizoítos en Havlogen® y Bay R 1005®. Losautores concluyeron que las formulaciones nogeneraron reacciones en el sitio de inoculación y quetodos los animales vacunados generaron anticuerposespecíficos contra N. caninum, especialmente luegode la segunda dosis vacunal.

Existe en el mercado una única vacuna comercialdisponible (Neoguard®, Intervet, Millsboro, EstadosUnidos), que está formulada con lisado de taquizoítosen Havlogen® y se aplica antes del servicio o 2 vecesen el primer trimestre de gestación, con un intervalode 4 semanas.

Romero et al. (74) llevaron a cabo una prueba acampo de esta vacuna sobre dos rodeos lecherosde Costa Rica. Los resultados mostraron unaincidencia de abortos del 11,2 % (49/438) y 20,8 %(91/438) al comparar los animales que fueronvacunados con aquellos que solo recibieron elplacebo (solución fisiológica), respectivamente. Esteestudio demostró que la vacuna tuvo un efecto


razonable sobre el porcentaje total de abortos enrodeos lecheros de Costa Rica, aunque no serealizaron estudios para caracterizar los abortosproducidos, por lo cual queda un margen de dudasobre su eficacia real. Dicho inmunógeno tambiénse utilizó en Nueva Zelanda en 5 rodeos lecheros,donde se observó un efecto significativo en 2 de los5 hatos evaluados. La eficacia de la vacuna varió entreel 30 y el 54 %. En uno de esos establecimientos,donde hubo frecuentes abortos por N. caninum, lautilización de la vacuna fue beneficiosa, con unaeficacia del 61 % (83).

Vacunas vivasLa utilización de las vacunas vivas para controlar

la neosporosis bovina, si bien ha demostrado serefectiva, se encuentra limitada debido a la posibilidadde generar infecciones crónicas con posteriortransmisión vertical (70). No obstante, la protecciónque genera este tipo de vacunas las convierte enuna opción interesante como herramienta de luchacontra la enfermedad. A este fin, sería deseable contarcon una cepa de N. caninum de escasa virulenciaque no provoque infección crónica en el animalvacunado, que no se transmita verticalmente al fetoy que no implique riesgo de reversión de virulencia(32). Como se mencionó previamente, existe en elmercado una vacuna contra T. gondii elaborada apartir de la cepa S48, que perdió su capacidad paradiferenciarse a bradizoítos. El mecanismo por el cualse produjo este cambio aún no es comprendido, ypersiste la chance de que esta cepa vuelva a cambiarsus características (10, 11, 33). En adición, estavacuna fue usada en un modelo de vacunación/desafío en hembras ovinas gestantes desafiadas aldía 90 de gestación, con el objeto de evaluar laexistencia de reactividad cruzada entre T. gondii yN. caninum. Si bien los resultados evidenciaron laexistencia de mecanismos inmunitarios comunes aambos agentes, la vacuna contra T. gondii no protegiódel aborto inducido por el desafío con N. caninum(32). En contraposición, Penarete Vargas et al. (63)reportan que ratones vacunados con una cepa de T.gondii de baja virulencia (MIC1-3KO) resistieron eldesafío letal con N. caninum.

Una vacuna viva, en general, se logra sobre labase de poblaciones de parásitos que han sidoatenuados en una o más de sus característicasfenotípicas. Las mutantes sensibles a temperaturasy los taquizoítos irradiados son algunos ejemplos deestas poblaciones, y ambos tipos han sido empleados

en experimentos en ratones (41, 66). No se hanpublicado aún pruebas de inmunización usandodichas mutantes en bovinos.

La cepa atenuada Nc-Nowra fue aislada deterneros sin signos clínicos, en Australia (50). Estacepa no es patógena en ratones. Miller et al. (60)realizaron un ensayo con esta cepa inoculandoratones antes de la preñez y obtuvieron una reducciónde la transmisión transplacental. En otro trabajorealizado en bovinos por Williams et al. (87), tambiénse vacunó con Nc-Nowra antes de la preñez, y sedeterminó la existencia de protección contra lamuerte fetal luego del desafío al día 70 de gestacióncon la cepa patógena Nc Liverpool. Estos animalestuvieron una respuesta inmunitaria celular con altosniveles de IFN-γ antes del desafío con la cepafetopatogénica.

Otra cepa bovina de baja virulencia que ha sidoaislada y caracterizada es la Nc-Spain 1H (72, 73).Esta se aisló del cerebro de un ternero naturalmenteinfectado asintomático. La patogenicidad de esta cepafue examinada en ratones BALB/c. No se observaronsignos clínicos y/o muerte, y el ADN del parásito nofue detectado durante el estadio crónico de lainfección en el cerebro de los ratones. Utilizando elmodelo de ratón preñado, dicha cepa evidenció unporcentaje de sobrevivencia de las crías de madresinfectadas del 95 %, con detección de ADN de N.caninum solo en una cría (72). Posteriormente, estacepa fue inoculada también en hembras bovinasgestantes al día 70 de gestación. No se observómuerte fetal, ni lesiones histopatológicas moderadaso graves, como así tampoco presencia de ADN (73).Los resultados obtenidos en estos dos últimostrabajos crean expectativas favorables para eldesarrollo de una vacuna viva atenuada.

Vacunas a subunidadesEl desarrollo de vacunas con proteínas

recombinantes es otra de las posibilidades para laobtención de un inmunógeno para mejorar el controlde la neosporosis; no obstante, su participación enlos ensayos vacunales es aún limitada (Tabla 3). Lalocalización y la función celular son criteriosimportantes que deben ser considerados al momentode la elección de un inmunógeno para el desarrollode una vacuna (71).

Proteínas de superficie como inmunógenosLas proteínas de superficie de todos los parásitos

intracelulares obligados son las primeras en inte-


ractuar con la célula del hospedador y con loscomponentes del sistema inmunitario, por lo quejuegan un papel crítico en la infección (18, 61) y enla invasión celular (29, 88). NcSAG1 y NcSRS2 sondos de las proteínas de superficie localizadas en lamembrana del parásito que más se han estudiadohasta el momento (24).

NcSRS2 es una proteína de superficie detaquizoítos y bradizoítos también presente en T.gondii (71). Pinitkiatisakul et al. (65) observaron quela proteína NcSRS2 acoplada a una matriz de tipoISCOM biotinilada indujo una importante respuestacelular que se relacionó con la baja carga parasitariahallada en el cerebro de los ratones vacunados. Choet al. (15) evaluaron el grado de protección inducido porla vacunación con diferentes antígenos recombinantes,y hallaron que la combinación de NcSRS2 con NcDG1(proteína de gránulos densos) tuvo el mayor efectoprotector sobre los animales (67,5 % ratonessobrevivieron). Además, la proteína NcSRS2formulada en adyuvante FIA fue evaluada tambiénen un modelo de transmisión transplacental murino(28). Los resultados evidenciaron que el porcentajede transmisión congénita fue del 24 % en ratonesvacunados, contra un 45 % en los no vacunados.Estos hallazgos se relacionaron con la elevadarelación IL-4/IFN-γ, lo que indica una respuestainmunitaria predominante del tipo Th2.

La proteína NcSAG1 solo está presente en lasuperficie de taquizoítos y es análoga a la proteínaTgSAG1, hallada en T. gondii. Esta ha sido utilizadacomo inmunógeno vacunal en un modelo murino de

infección cerebral y generó protección en el 75 % delos animales vacunados (13). Asimismo, NcSAG4,una proteína solo presente en la superficie de losbradizoítos, también ha sido evaluada recientementecomo inmunógeno vacunal en un modelo murino,aunque la protección conferida fue baja (1).

Proteínas del complejo apical comoinmunógenos

Las proteínas de los micronemas han sidoconsideradas como posibles candidatos vacunalesdebido a que son secretadas en el momento en quese produce la interacción física entre la superficiedel parásito y la célula del hospedador (14). Algunasde las proteínas que han sido identificadas sonNcMIC1, NsMIC2, NcMIC3, NcMIC4 y NcMIC10 (2,14, 21, 71, 78).

Cannas et al. (14) evaluaron en un modelo deinfección cerebral murino una vacuna formulada conNcMIC3 recombinante, que confirió protección al 75 %de los animales inmunizados. La protección se asocióa una respuesta del tipo Th2 con niveles significativosde IgG1 cuando se inoculó solo NcMIC3 nativa yniveles significativos de IgG1 e IgG2a cuando seinoculó una proteína recombinante de NcMIC3(rNcMIC3). Utilizando la proteína NcMIC4 en formanativa y recombinante, asociada a la producción deIgG1 y de IgG1-IgG2, respectivamente, se registró un80 % de protección con ambos antígenos (78).Recientemente, la proteína NcMIC10 fue evaluadaen un modelo de transmisión transplacentaria murino(21). Los resultados evidenciaron que además de

Localización Proteínas Cita (N.º)

Proteínas de superficie SAG 1 (1) (14) (15)

SAG 4 (1)

SRS2 (13) (15) (28) (61) (64) (65) (68) (82) (89)

Proteínas del Micronema MIC1 (2) (17) (68)

complejo MIC3 (14) (18) (68)

apical MIC4 (78)

MIC10 (23)

Roptrias ROP2 (17) (18) (19)

Gránulos densos GRA1 (15) (23)

GRA2 (15) (23) (68)

GRA6 (68)

GRA7 (1) (34) (39) (82)

Tabla 3. Antígenos de Neospora que se han evaluado como inmunógenos


resultar inmunogénica, la combinación de NcMIC10con otra proteína recombinante (rNcp24B) produjoprotección parcial contra la infección transplacentaria.

Las roptrias son organelas secretorias que seliberan en el momento de la invasión al hospedadory su contenido facilita la propulsión del parásito dentrode la célula una vez producido su ingreso. Hasta elmomento, solo una proteína de roptria (NcROP2) deN. caninum ha sido investigada como un posiblecandidato vacunal (17, 18). Debache et al. (17)realizaron un ensayo en ratones utilizando unaproteina recombinando NcROP2 (rNcROP2) conadyuvante FIA y saponinas. Los animales vacunadosno manifestaron signos clínicos luego del desafío ydesarrollaron anticuerpos contra rNcROP2. Lapresencia de parásitos en el cerebro de los animalesvacunados, evaluada mediante PCR, se redujo enun 93 % cuando se usaron saponinas, conpredominio de IgG1, y un 75 % cuando se usó comoadyuvante FIA, con predominio de IgG2. En otrotrabajo en ratones se evaluó la proteína rNcROP2,sola o en combinación con rNcMIC1 y rNcMIC3, consaponina como adyuvante. No se hallaron parásitosviables en el cerebro de los animales vacunados conrNcROP2/NcMIC3 y se observó un 100 % detransmisión vertical en todos los grupos vacunados,con bajo porcentaje de crías muertas al nacer (6 %)en el grupo inmunizado con rNcROP2/NcMIC1/NcMIC3. La mortalidad neonatal fue de 50 % enanimales vacunados con rNcROP2 y de 35 % en losgrupos inmunizados con rNcROP2/NcMIC1/NcMIC3(18).

Recientemente, Debache et al. (19) utilizaronrNcROP2 como inmunógeno aplicándolo víaintraperitoneal e intranasal en ratones, y obtuvieron 70% y 60 % de protección posdesafío, respectivamente.

Los gránulos densos están unidos a la membranadel parásito y son también organelas secretorias detamaño variable, con un importante papel en laformación y mantenimiento de la vacuola parasitófora.Algunas de las proteínas de los gránulos densosevaluadas hasta el momento son la NcDG1, laNcDG2, la NcNTPasa, la NcGRA2 y la recientementeidentificada NcGRA7 (3, 37, 71). Cuando las proteínasNcDG1 y NcDG2 fueron utilizadas en su forma nativacomo inmunógenos en un modelo de infeccióncerebral en meriones, el nivel de proteccióndesarrollado fue bajo (15). En dos trabajos en losque se inocularon ratones con la proteína NcGRA7,se registraron similares parámetros de inmunidad(IgG

1/IgG

2a y producción de IFN-γ), pero los niveles

de protección fueron contradictorios (1, 62). Dichadiferencia podría deberse a la utilización de diferentesformulaciones y adyuvantes. Aguado Martínez et al.(1) describieron un porcentaje de sobrevida menor del8 %; en tanto que Nishikawa et al. (62) obtuvieron unporcentaje de sobrevida de crías de 68,6 % cuandose usaron liposomas recubiertos con manotriosa(trímero de la manosa). Esto podría deberse a que, sibien la respuesta Th1 con producción de IFN-γasociada a una baja relación IgG1/IgG2a es deseablepara limitar las infecciones por N. caninum en ratoneso en bovinos, otras variables de la respuestainmunitaria tales como la producción de IL-4, IL-10,IL-12, FNT (sistémicas o placentarias) tendríandiferente significado en estas especies (5, 22, 33, 71).

Vacunas de ADNLas vacunas de ADN constituyen una promisoria

herramienta en inmunógenos contra N. caninum,basada en la inmunización con un plásmido quecontiene la información genética de uno o varios genesque codifican proteínas inmunogénicas del parásito.Cannas et al. (13) inmunizaron ratones con unplásmido que expresaba NcSRS2 y NcSAG1, yposteriormente realizaron un booster en el que soloincluyeron los antígenos recombinantes correspon-dientes. Los resultados demostraron que la vacunaprotegió durante el desafío experimental.

La inmunogenicidad de una vacuna de ADN queexpresaba la proteína NcSRS2 en ratones BALB/cfue evaluada luego de ser aplicada en 2 dosis conadyuvante FCA. Esta indujo inmunidad celular conincremento significativo de las concentraciones deóxido nítrico, expresión de IL-2 e IFN-γ y proliferaciónde linfocitos. Por otro lado, se comparó el efecto deuna vacuna de ADN que codificaba la proteínaNcSRS2. Los resultados evidenciaron que la vacunade ADN no indujo activación de células T niproducción de IFN-γ (9).

Lidell et al. (39) vacunaron ratones antes de lapreñez con un plásmido que codificaba la proteínaNcGRA7 (pCMVi-NcGRA7) o la NcsHSP33 (pCMVi-NcsHSP33). Posteriormente, desafiaron los animalesy observaron que el 54 % de las crías de los animalesinmunizados con pCMVi-NcGRA7 y el 47 % de losvacunados con pCMVi-NcsHSP33 fueron negativosa PCR, por lo tanto, se concluyó que esta vacunaconfirió protección parcial contra la neosporosiscongénita.

Jenkins et al. (34) hallaron que una vacuna basadaen un plásmido de ADN que codificaba NcGRA7, con


CpG (ImmunoEasy®, Quiagen, Tokio, Japón) comoadyuvante (pNcGRA7+CpG), incrementó al doble elnivel de protección de la transmisión congénita enrelación con una vacuna formulada solo con pNcGRA7.Sin embargo, Srinivasan et al. (78) informaron quedespués de la inmunización de ratones con unplásmido que codificaba la proteína recombinanteNcMIC3 (pcDNA-MIC3), los animales no desarrollaronrespuesta humoral anti-MIC3, y el 60 % de ellosmurieron tres semanas después del desafío.

Vacunas en vectoresLos vectores biológicos recombinantes repre-

sentan también una opción interesante para el trans-porte de antígenos de N. caninum al sistemainmunitario del hospedador susceptible. Entre losvirus que actúan como vectores de expresión, elHerpevirus recombinante y el virus vaccinia handemostrado ser eficientes para infecciones para-sitarias por protozoos (61, 72). Se realizó un trabajoinmunizando caninos vía nasal con Herpesviruscanino recombinante que expresaba la proteína desuperficie NcSRS2 y se logró la producción deanticuerpos IgG contra N. caninum. (71).

Otro virus que se ha utilizado como vector es elde vaccinia. En un trabajo se realizó la vacunacióncon virus vaccinia recombinante que expresabaNcSAG1 o NcSRS2. Los resultados evidenciaron quela inmunización con este recombinante pudo protegera los ratones ante el desafío con N. caninum (61).Más tarde, en otro ensayo en ratones, la vacunaciónde las madres con vaccinia recombinante queexpresaba NcSRS2 confirió protección efectivacontra la transmisión vertical a las crías de ratonesBALB/c “y” no se detectó ADN de parásitos en elcerebro de los animales analizados (61).

También se han utilizado vectores bacterianos parala expresión de antígenos recombinantes. En variosestudios se usó la cepa de Brucella abortus RB51como vector para diferentes antígenos de N.caninum, como NcMIC1, NcMIC3, NcGRA2,NcGRA6 y NcSRS2 (67, 68, 82). En ratones C57BLvacunados con la cepa RB51 recombinante queexpresa NcMIC1 o NcGRA6, se logró proteccióncompleta de la infección cerebral contra el desafío(68). En otro trabajo en el que se emplearon ratonesBALB/c con una cepa RB51 recombinante queexpresa NcSRS2 o NcGRA7, se concluyó que losratones vacunados con RB51-NcSRS2 mostraronresistencia a la infección cerebral luego del desafíocon taquizoítos de N. caninum (71). También

Ramamoorthy et al. (68) usaron una cepa de B.abortus RB51 que expresaba diversas proteínasrecombinantes, solas o en conjunto, en un modelode transmisión vertical en ratones C57BL/6. Estetrabajo evidenció que la transmisión vertical variódesde un 94 % al vacunar con RB51-NcSRS2, hastaun 62 % cuando se empleó RB51-NcMIC3, y que fuedel 78 % para la cepa RB51 que expresaba todas lasproteínas recombinantes evaluadas en este estudio.Los animales que recibieron RB51-NcSRS2 de-sarrollaron una respuesta mixta de IgG1 e IgG2a

asociada a una mortalidad incluso superior a la delos controles. La relación IgG1 / IgG2a inducida porciertos antígenos favorecería (RB51-NcMIC3) o no(RB51-NcSRS2) la protección o eficacia del inmu-nógeno. Sin embargo, desde el punto de vistaveterinario es necesario considerar las implicanciasdel uso de B. abortus RB-51 como vector en bovinos,teniendo en cuenta que si bien presenta bajavirulencia en el hombre, esta cepa es zoonótica. Porotra parte, debería considerarse también que la cepaRB-51 es resistente a la rifampicina, que es elantibiótico usado en la terapéutica de la enfermedad.

Como contraparte, N. caninum también ha sidousado como vector de antígenos de T. gondii. Zhanget al. (88) informan que la inmunización con una cepade N. caninum que expresa la proteína de superficieTgSAG1 protegió a los ratones cuando estos fuerondesafiados letalmente con T. gondii.

Ensayos de inmunógenos en el paísEl primer trabajo fue publicado por Moore et al. en

2005 (54). En este estudio se vacunaron vaquillonascon lisado de taquizoítos en un adyuvante oleoso(13 % Arlacel, 85 % Marcol 52 y 2 % Tween 80)durante el segundo trimestre de gestación y secomparó la respuesta inmunitaria a N. caninum convaquillonas naturalmente infectadas sin vacunar queno abortaron. Los títulos de IgG

1 e IgG

2 fueron

semejantes en animales inmunizados, pero difirieroncuando se los comparó con aquellos de los animalesnaturalmente infectados. Los niveles de IFN-γ fueronsemejantes en ambos grupos; sin embargo, no seobservó respuesta celular en el grupo vacunado.

Recientemente Moore et al. (57) utilizaron unaformulación experimental que contenía antígenos deN. caninum formulados con ISCOM en terneros, ycompararon la respuesta inmunitaria obtenida conaquella observada en animales que habían sidoinoculados con taquizoítos vivos. En la segundasemana posinoculación, se observó que los animales


inoculados con el inmunógeno desarrollaronanticuerpos específicos contra N.caninum en nivelessimilares a aquellos del grupo inoculado con taqui-zoítos vivos. Sin embargo, al utilizar la vacuna expe-rimental hubo una respuesta de anticuerpospredominante del subisotipo IgG1, mientras que losque recibieron parásitos vivos desarrollaron nivelessuperiores de IgG2. Por otro lado, los niveles de IFN-γfueron semejantes en ambos grupos de animales.

PERSPECTIVAS Y CONCLUSIONESSi bien en la actualidad no hay disponible en el

mercado una vacuna eficaz contra la neosporosisbovina, en los últimos 5 años se han producidoavances notables en busca de un inmunógenoexperimental contra la enfermedad. Hasta el momentose conoce que la inoculación pre-servicio contaquizoítos vivos protege contra la infección y elaborto. Teniendo en cuenta los antecedentes en eldesarrollo de vacunas vivas contra otros protozoos,sería factible pensar en una vacuna de este tipo contraN. caninum. Por otra parte, se ha avanzado en elestudio de vacunas inactivadas y recombinantes enmodelos murinos; sin embargo, se necesitan mástrabajos experimentales en bovinos. Considerandolas ventajas de las vacunas inactivadas, se requierenfuturas investigaciones para tratar de mejorar sueficacia. Por último, se debe tener en cuenta que lavacunación no es la única forma de lucha contra laenfermedad, y que resulta necesario implementarmedidas integrales de control y manejo.

Agradecimientos: al Consejo Nacional de InvestigacionesCientíficas y Técnicas de la República Argentina por elfinanciamiento otorgado a YP Hecker durante su formación deposgrado. La presente revisión bibliográfica se enmarca en losproyectos PICT 2008-1880 (otorgado a DP Moore) e INTAAESA 3597 (otorgado a CM Campero).

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Recibido: 8/11/2011 – Aceptado: 19/6/2012

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