Assurance GDS

� Preparación de la muestra basada en IMS� Sondas y primers altamente específicos� Innovativa plataforma del instrumento giratoria

Assurance GDS utiliza los últimos desarrollos en tecnología para lograr los mejores tiempos para resultados y precisión

Precisión + Rapidez + Fácil de usar

Avances en m últiples áreas

Preparación de la muestra

Sistema de reactivos

Plataforma del Instrumento

Preparación de la Muestra

¿Qué es IMS?:� “Separación Immunomagnética” � Anticuerpo específico captura y envuelve los organismos� Captura – anticuerpo cubierto con partículas paramagnéticas� Separación – imánes colectan y aislan partículas que cubrieron los

organismos

Separación Immunomagn ética (IMS)

Mejora Ia pureza de la muestra:� Reduce la microflora competitiva

� Aumento en especificidad� Mejora la aislación del organismo target en cajas/platos con agar� Mejora la selectividad de los enriquecimientos

� Remueve los inhibidores potenciales del PCR� Residuos de alimento, sanitizantes, medios de cultivo, etc

Incrementa la cantidad de ADN para el análisis� Concentra los organismos target

� Provee 1-2 log de aumento en densidad de células post-enriquecimiento

� Mayor cantidad de ADN a analizar

Separación Immunomagn ética (IMS)

PickPen IMS� Muestra y partículas combinados en el pocillo del sample block � La captura de partículas y envoltura del organismo es intrasolución� Partículas son físicamente extraídas de la muestra� Punta inmersa en la solución de lavado� Partículas resuspendidas� Transferencia al sistema de detección

Assurance GDS PickPen IMS

Sistema de Reactivos

Amplificación

Target – Secuencia específica de una cadena de ADN del organismo que estamos tratanto de detectar

- ADN es la secuencia que es

amplificada en el proceso de PCR

A

AGTC

Primer - Cadena sencilla de la secuencia del ADN encontrada en el target

- Responsable de iniciar el copiado de la secuencia del ADN “target”

- Usado en pares

Taq polymerasa -Enzima térmicamente estable y es la responsable de copiar el ADN

“target”Nucleótidos – (A, T, C, G)bloques constructores del ADN usados para juntar copias del ADN “target

Componentes requeridos :

Amplificación

Proceso – Una reacción (ciclo):

Separación de las 2 cadenas cuando se calienta (95°C)

A

AGTC

C

T

T

AG

Paso 1 – Desnaturalización del ADN

Los primers se unen a la secuencia complementaria del target cuando se enfría(55°C)

A

AGTC

C

T

T

AG

Step 2 - Primers

La enzima Taq elabora nuevas cadenas de ADN (72°C)

A

AGTC

TCA

C

T

T

AG

A

TC

Step 3 - Extensión

El proceso completo se repite con los cambios de temperatura.

Step 4 – Se repite el ciclo

Detección

� Detección es post amplificación� No hay secuencia específica� Todo el ADN produce señal con el

Sybr Green� Targets identificados por el punto de

fusión; y en función a la secuencia de la longitud de la cadena

� Interferencia de primers y un alto grado de ruido de fondo

Análisis de Curvas de Fusión

Detección

� Amplificación y detección coexistentes� Secuencia específica� Especificidad Adicional� No es afectado por primers� No es afectado por ADN extraños � Señal discreta por el target y el

Control Interno

Detección basada en la sonda

¿Cómo funciona la sonda MGB Eclipse ?hv

MGB

Correlacion directa entre la cantidad de fluorescencia y la cantidad del target

Sonda en solución� Acomodada al azar � Marcador fluorescente inhibido

Sonda ligada al target� Se vuelve lineal� Marcador fluorescente se expone

= Fluoróforo

= Inhibidor

= MGB

Assurance GDS Sistema de Reactivos

� MGB – mejora especificidad � Permite secuencias mas cortas del target � Previene uniones no deseadas � Mejor discriminación del target

� No hay curvas de fusión� Ahorras > 1 hora en tiempo de instrumento� No hay interpretación subjectiva

Beneficios de la sonda del Assurance GDS

Assurance GDS Sistema de Reactivos

� Detección específica del Target

� Control Interno Verdadero � Juego de primer y sondas

independientes � Señales separadas

� Detección directa del target� Relación 1:1 sonda-target

Beneficios de la sonda del Assurance GDS

Plataforma del Instrumento

� Bloque de Peltier basado calentar / enfriar � Detección en un solo canal

Termocicladores Tradicionales

Formato Tradicional

Limitaciones� ciclos lentos – aumentan el gradiente

de temperatura� Ciclos con temperatura inconsistente

entre los pocillos� Dependientes de un colorante no

específico y del análisis de curvas de fusión

Assurance GDSPlataforma del Instrumento

� Muestras acomodadas en un formato rotativo para calentamiento / enfriamiento directo

� Movimiento centrífugo con intercambio constante de aire

� Asegura temperatura uniforme a través de todas las reacciones

� Elimina los tiempos largos de gradiente de temperatura requeridos por los sistemas basados en bloques

Assurance GDS Rotor-GeneTM

� Rotor-Gene controla las reacciones de PCR ya que es altamente consistente

� Produce resultados precisos y confiables

� Genera confianza

# of

cyc

les

Test #

Assurance GDSPlataforma del Instrumento

Precisión mejorada

Paso del PCR Rotativo Bloque Tiempo ahorrado

Tiempo que empieza la desnaturalización

3 min 10 min 7 min

Tiempo típico de un ciclo <2 min 4 min --

Tiempo total ciclo (42 ciclos) 70 mins 170 min 100 min

Curva de fusión 0 60 min 60 min

TOTAL 75 min 240 min >2.5 horas!

Assurance GDSPlataforma del Instrumento

Resultados mas rápidos

Velocidad IMS concentra el target = tiempos enriquecimientos mas cortos

Sonda elimina curvas de fusión

Eficiencia térmica disminuye tiempos del ciclo

Especificidad IMS provee especificidad de Primer nivel

Primer – solo el target es amplificadoSonda - solo el target es detectado

Sistema Multi Canalpermite el uso de sondas altamente específicas

Fácil de usar PickPen – preparación de la muestra en tan solo20 min

Reactivos Liofilizados en los tubos de amplificación

Resultados Definitivos –sin la interpretación deCurvas de fusión

Precisión IMS separa al target de los inhibidores del PCR

Especificidad Dual de primers y sondas

PCR Consistente reacción en cada tubo

Plataforma del InstrumentoSistema de reactivos Preparación Muestra

Ventajas del Assurance GDS

Definición regulatoria de las Top STEC o Big Six

La definición regulatoria de las Top STEC indica que son las E.coli que presentan una combinación del serogrupo O y los

genes que definen la patogenicidad de las E.coli enterohemorrágicas.

Serogroup

O157

O103

O26

O145O111

O121

O45

eae stx1 or stx2

STEC

O Serogroups

Pathogenicity Genes

Immunological Genetic

¿Cómo definir el método de análisis?

Métodos InmunológicosIm

mun

olog

ical

M

etho

ds • EIA / Lateral Flow / ELFA• O group does not indicate pathogenicity• Many non-E. coli will cross react• E. coli with correct O group may not

contain one or more of the pathogenicity genes

• Only ½ of the definition• High rate of false positives

Immunological

Serogrupos O

Serogroup

O157

O103

O26

O145O111

O121

O45• Solo la mitad de la definición

• Métodos tipo ELISA, flujo lateral o tipo ELFA

• El grupo O no indica patogenicidad

• Muchas no-E.coli pueden dar reacción

• E.coli con el correcto grupo O puede no contener uno o mas genes de patogenicidad.

•Alta tasa de falsos positivos

Método Genético - PCRG

enet

ic M

etho

ds

• PCR • > 200 other serotypes of E. coli that contain 1

or more of the target genes• stx genes are phage-encoded and highly

mobile • Many non-E. coli can contain target genes• Multi-Organism effect – no way to determine if

all targets are present in a single organism• Only ½ of the definition• High rate of false positives

Genes de Patogenicidad

Genetic

eae stx1 or stx2

• Solamente la mitad de la definición

• >200 serotipos de E.coli tienen uno o mas de los genes terget.

• Muchas no E.coli pueden contener los genes target.

• Alta tasa de falsos positivos

• Efecto multiorganismo, no hay forma de determinar si todos los targets están presentes en un solo organismo

La solución es combinar los dos métodos…

Serogroup

O157

O103

O26

O145O111

O121

O45

eae stx1 or stx2

STEC

Aislar los serogrupos O

Detectar los Genes de patogenicidad

Immunological Genetic

La solución de BioControl…“Building Block”

Immunomagnetic (IMS)

Immunomagnetic Separation (IMS)

• Top 7 IMS Capture (O26, O45, O103, O111, O121, O145 and O157)

• Top 6 IMS Capture (no O157)• O157 IMS Capture• No IMS

Gene Target Combinations

• eae• stx1 + stx2

• eae + stx1 + stx2

• eae + stx1 + stx2 + E. coli O157:H7

Assurance GDS MPX Top 6/7 STEC

TEXT TEXT TEXT TEXT

Enrichment: 10-18 h @ 42°C in mEHEC®

IMS sample preparation*

O103, O26, O145, O111, O121, O45

PCR analysis for eae, stx1, and stx2

* IMS Sample Prep concentrates target serogroups

12 hours min. TTR

Enrichment: 10-18 h @ 42°C in mEHEC®

IMS sample preparation*

O103, O26, O145, O111, O121, O45,

O157

PCR analysis for eae, stx1, stx2, and

E. coli O157:H7

TOP 7

TOP 6

Detección de Patógenos en la Práctica

• Salmonella

• Listeria spp.

• Listeria monocytogenes

• Cronobacter sakazakii

• E. coli O157:H7 (EHEC)

• Shiga Toxin Genes O157

• MPX Top 7 STEC

• MPX Top 6 STEC

Assurance GDS familia de pruebas:

� Muchas gracias por su atención

Karla Celada UgaldeGerente México, AC y El CaribeTel. (722) 2160802Nextel (55) 10180626karla@biocontrolsys.comwww.biocontrolsys.comBIOCONTROLResults Right Now