Aplicaciones LC/MS en el campo alimentario

Juan AybarEspecialista de Producto GCMS/LCMS

Agilent Technologies Spaing g pEnero 2010

Universitat de Lleida

Agendag1. Resumen de tecnologías disponibles y

últimas novedadesúltimas novedadesUHPLCLCMS (QQQ/TOF/QTOF/AJS)( )CEICPMS

2 MRM dinámico aplicado a a la2. MRM dinámico aplicado a a la determinación de plaguicidas en muestras alimentarias

3. Screening de sustancias prohibidas con sistemas de tiempo de vuelo

4. Adulteraciones y su determinación con sistemas TOF

Page 2

Clearly Better LC / LC/MSAgilent FY09 Nuevos Productos

Agilent 1290 Infinity LC (7100 CE)El mejor sistema de • El mayor rango de potencia entre losEl mejor sistema decromatografía líquida paraLC/MS – de la HISTORIA!

• El mayor rango de potencia entre los (U)HPLC disponibles• Nuevo DAD de mayor sensibilidad• Permite conversión de cualquier

6430 Triple Cuadrupolo LC/MSRápido, robusto,

método LC

• Rápido cambio de polaridadp , ,sensible. Ideal para acomplamientos HPLC-Chip

• Rápido cambio de polaridad• MRM más rápidos• Dynamic MRM• Ideal para análisis complejos multi-

6538/40 UHD Accurate Mass Q-TOF LC/MS(6230 Accurate Mass TOF LC/MS)

compuesto

Datos de ultra-alta definición;resultados de investigación en un sistema de sobremesa

• Sistema cualitativo de última generación• Ultra alta resolución• Exactitud de masa sub-ppm

E l t ibilid d di á i

Page 3

• Excelente sensibilidad y rango dinámico

Agilent 1290 Infinity LCg y

June 06, 2005Page 4

1290 Infinity Compatible con cualquier HPLC y UHPLC del mercadoCompatible con cualquier HPLC y UHPLC del mercado

barUn nuevo rango de potencias capaz de proporcionar el máximo

rendimiento, flexibilidad, compatibilidad y protección de la inversión

1290 Infinity

1000

1200

800

Vendor A

Vendor D

600

Agilent RRLCVendor B

200

400

Vendor C

0

200

0 1 2 3 4 5 /

Standard LC0 1 2 3 4 5 ml/min

1290 Infinity posicionamiento del portfolio de LC de AgilentAgilent El máximo rendimiento y flexibilidad preservando/mejorando las características del Sistema Agilent 1200

1290 Infinity LC

1200 RRLC

1290 Infinity = 1200 RRLC + X1200 RRLC = 1200 HPLC + Y

1200Standard

LC

1200 RRLC = 1200 HPLC + Y

1200 HPLC = 1120 HPLC + Z

1120 Compact

LC

Agilent Serie 6400. Triple CuadrupoloLa plataforma cuantitativa más completa en LC/MS (2006-2009)

6410 Triple Cuadrupolo LC/MS • Celda de colisión con aceleración lineal axialRobusto, Facilidad de Uso.Menores coste de mantenimiento.

• Rápido cambio de polaridad• Análisis MRM• Robustez y sensibilidad

6430 Triple Cuadrupolo LC/MS • Optimización rápida con Optimizer

Rá id bi d l id dRápido, robusto,Cuantificación con alta sensibilidad,.Ideal para HPLC Chip

• Rápido cambio de polaridad•Métodos Dynamic MRM• Análisis complejo multi-analito• Cuantificación de proteinas targetIdeal para HPLC-Chip p g

6460 Triple Cuadrupolo LC/MSEl T i l • Agilent Jet Stream – sensibilidad sub-fg!El TripleCuadrupolo LC/MS Más sensible del mercado

Agilent Jet Stream sensibilidad sub-fg!• Perfecto para las aplicaciones más exigentes• Rápido cambio de polaridad

Page 7

• Métodos Dynamic MRM

Agilent Jet Stream

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LC/MS – 6230 TOFMasa Exacta en Rutina• El sistema más estable del mercado• Especificación 2 ppm - Típica 1 ppm• Hasta 5 órdenes de magnitud de rango• Hasta 5 órdenes de magnitud de rango

dinámico espectral

Sensibilidad• 5 - 10 x mejor que cualquier otro TOF

de sobremesa del mercado

Facilidad de UsoFacilidad de Uso• Autotune• Autocalibracion con 2 (o más) puntosAutocalibracion con 2 (o más) puntos• Sistema de introduccíón directa de

calibrante (CDS)

Plataforma QTOFA il t T h l i J li 2009Agilent Technologies Julio 2009

6540/6438 6530 6520

Agilent HPLC-Chip/QQQ LCMS TechnologyConfiguración Chip-Nanospray proporciona una nueva era en laConfiguración Chip Nanospray proporciona una nueva era en la cuantificación de alta sensibilidad

HPLC Chip Cube systemNanoLC system foranalytical chromatography

HPLC Chip Cube system

CapLC pump for sample

QQQ LCMS

loading on enrichment column

Sensitivity: down to low amolDynamic range: up to 105

HPLC-Chip/MSB fi iBeneficios

Poliimida InerteMax. Eficiencia & Sensibilidad

µ-filtro

Volumen muerto cero para mejor cromatografíaLC/MS sensibilidad

Columna de Enriquecimiento

Sin problemas. Todo en UnoCanales creados por ablacion láserC l A lítiColumna AnalíticaColumna de EnriquecimientoConexión con MicrovalvulaPunta de nano-electrospray

Columna Analíticap y

Micro-filtros

Sin tiempos perdidos

Aguja de spray

Sin obturaciones de la aguja de sprayRecambios Plug-&-Play

Aguja de spray

Agilent 7100 CE-MS portfolioPl g & spraPlug & spray

Agilent es el único proveedor del portfolio completo de CE MSAgilent es el único proveedor del portfolio completo de CE-MS

Agilent CE-MS proporcionan: •Salida de capilar a tierraSalida de capilar a tierra• La interfase ESI más robusta• El intercambio más rápido entre LC - CE-MS•ChemStation control de CE-MSD - CE-trapChemStation control de CE MSD CE trap• QQQ, TOF, Q-TOF via ChemStation + MH

Aplicaciones clave:p•Compuestos naturales CE-MSD• Impurezas farmaceúticas CE-QQQ, CE-Trap• Estudios metabolómicos CE-TOF•Análisis de proteínas y glicanos CE-TOF

Agilent 6000 Series mass spectrometers

ICP-MS. Historia de Agilent( )Pasado (1994 ‐ 2000) Agilent 4500 Series 

Casi 1000 unidades instaladas. El primer ICP‐MS de sobremesa controlado via PC

Futuro!Futuro!7700 Series – la nueva cara de ICP‐MS

Presente (2000 ‐ 2009) Agilent 7500 Series Casi 3000 unidades instaladas – el ICP‐MS con mejores ventas de la historia

MRM di á iMRM dinámico aplicado a a la pdeterminación de plaguicidasde plaguicidas en muestras alimentarias

Page 15

Tendencias en análisis li t i / di bi t l

• Necesidad de métodos de screening; confirmacion y cuantificación

alimentario/medioambientalg; y

únicamente de positivos (p.e. directiva marco de la EU para análisis de aguas)

• Necesidad de métodos “listos para usar” incluyendo la fase de preparación Necesidad de métodos listos para usar incluyendo la fase de preparación de muestra (p.e. EPA 1694: “Productos farmaceúticos y de cuidado personal en aguas, suelos, sedimentos, y biosólidos por HPLC/MS/MS”)

• Mayor número de muestras:Mayor número de muestras:• Necesidad de métodos más rápidos con menos preparación de

muestra• Necesidad de análisis multi componente• Necesidad de análisis multi-componente• Necesidad de una solución eficaz de gestión de datos

• Ideal:• Facilidad en la preparación de muestra• Identificación sin riesgo• Screening y cuantificación en el mismo runScreening y cuantificación en el mismo run

Flujo de trabajo habitual en alimentación/medioambiente con LC QQQalimentación/medioambiente con LC-QQQ

Screening Confirmacion Cuantificación

Características del diseñoTriple CuadrupoloTriple Cuadrupolo

Capilar dielectrico frio

Cuadrupolos hiperbolicos

Guía de iones octopolar

Celda de colision hexapolar

Detección Off-axis

Una bomba turbo1º Cuadrupolo 3º Cuadrupolo

p

Espectro con i d l

Q1 sólo deja l ió

Celda Colisión l ió 210

Q3 monitoriza sólo los fragmentos 158

Guía de iones octopolar Celda de colisión (hexapolo) Detector

210

iones del “fondo” (API: ESI, APCI,…)

pasar el ión “precursor” 210 pass

210

rompe el ión 210 (y sus productos)

los fragmentos 158 y 191

característicos del ión 210 para cuantificar y

170 210 250 290

210

222

268 280165190 210 150 170 190 210

210158

191

cualificar con máx. sensibilidad

160

158

190191

170 210 250 290 50 0 90 0

Beneficios de los sistemas UHPLC en acoplamientos a LC/MS Triple Quadacoplamientos a LC/MS Triple Quad

Típicamente 1,000 bar o mayoresMS – menores tiempos de análisis

Alta Presión MS menores tiempos de análisis

Típicamente menores de 200 uL

Presión

Bajo Vol pMS – mayor productividad

Bajo Vol. Muerto

MRMs 1 ms dwell por MRM30 P /N S it hirápidos

UHPLC30 ms Pos/Neg Switching> 200 MRMs/ sec

UHPLC combinado con un número muy elevado de MRMs virtualmente elimina la necesidad de las utilidades de scan en la

mayor parte de aplicaciones

Page 19

mayor parte de aplicaciones

MRM t d A ti B1 C l 6 (10 / l)Métodos para pesticidas con Agilent 1290 Infinity LC

MRM trazas de Avermectina B1a para Cal_6 (10 ng/ml)2x103 5x103 8x103

Método RRLC (25 min gradiente)

RT 18 98 i

Método 1290 (12 min gradiente)

RT 9 70 i

Método 1290(7 min gradiente)

RT 5 51 iRT 18.98 minWidth 0.346 min

RT 9.70 minWidth 0.127 min

RT 5.51 minWidth 0.091 min

Consideraciones prácticas MS/FastLC

Una cuantificacion para ser aceptable requiere, al menos, entre 10-15 puntos a lo largo del pico cromatográfico.

4x10

4.5

A medida que los picos son más

3

3.5

4

W1/2 = 0.63 s

Buena calidad datos:Avg W1/2 = 0.63 s Avg. W = 1.8 s5 puntos W1/2 13 puntos W

picos son más estrechos … el

detector debe “barrer” más deprisa. Los

1

1.5

2

2.513 puntos WArea RSD [%] = 4.7SNR (3RMS) = 1672

tiempos de ciclo se reducen por lo que,

los MRMs/cambios de polaridad deben ser

0

0.5

1

Counts vs. Acquisition Time (min)

0.49 0.495 0.5 0.505 0.51 0.515 0.52 0.525 0.53 0.535 0.54 0.545 0.55 0.555 0.56

W = 1.8 s

polaridad deben ser más rápidos.

W 1.8 s

MS tiempo de ciclo = 122.5 ms

Durante cada ciclo de medida, el sistema MS tiene que analizar 5 transiciones MRM y cambiar de polaridad.5 ms MRM dwell times + 30 ms cambio de polaridad en el sistema 6430 QQQp QQQ

Análisis por segmentos vs. MRM dinámicox105

4

5 Segmento 1Segmento 2

Segmento 3Segmento 4

2

3

1

Counts vs. Acquisition Time (min)1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14MRM Dinámico: No hay segmentos de tiempo

La lista de MRM se confecciona de modo dinámico basándose en el RT de los compuestos de interésMenor tiempo de ciclo/Mejor definición de pico

Principios de funcionamiento de Dynamic MRM

Time (min) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25Time Segment 1 Time Segment 2 Time Segment 3 Time Segment 4

MRM

MRM

Compounds (10/block)

Cycle Time (sec)50 800.5 0.8 1 0.7

100 70

Dynamic MRM

Max Coincident

Cycle Time (sec) 0.4 0.4 0.4 0.420 40 40 30

Ciclos 2 x menores permiten manejar picos cromatográficos másestrechos, más analitos y dwell times mayores por compuesto, y y p p

Control de 300 Pesticidas en matriz de manzananiveles de ppb cuantificados en 15 min con 1290 LC/6430 QQQniveles de ppb cuantificados en 15 min con 1290 LC/6430 QQQ

Residuos de Pesticidas La mayor parte de frutas y verduras en nuestras bolsas de la compra se cultivan con la ayuda de productos químicos que previene la presencia de insectos y

l hi bmalas hierbas. Los sistemas de salud pública controlan de modo regular los pesticidas presentes en aguas y alimentosen aguas y alimentos.

Page 24

Puesta en marcha de un método Dynamic MRM1. Crear una tabla con los nombres de los compuestos, transiciones

MRM y parámetros, tiempos de retención y ventanas de tiempos de retención en EXCEL via MassHunter Quant reportingretención en EXCEL via MassHunter Quant reporting

Page 25

Puesta en marcha de un método Dynamic MRM2. Seleccionar “Dynamic MRM” como Scan type en la pantalla de

MassHunter Acq (permite hasta 200 MRMs simultáneos y hasta 4000 MRMs en total manteniendo constante el tiempo de ciclo)4000 MRMs en total manteniendo constante el tiempo de ciclo)

1. 2.

3. Copiar la tabla de EXCEL y pegar en MassHunter Acquisitionp y p g qdesde el clipboard o importar las transiciones desde Optimizer (la base de datos aun no contiene los tiempos de retención)

Page 26

Puesta en marcha de un método Dynamic MRM4. El botón “Apply” genera el método MRM5. El establecimiento de los segmentos de tiempo y dwell times

se hace automáticamente usando el tiempo de ciclo especificado, los RTs y las ventanas de RTs.

3.

6. Se calcula el máximo número de MRMs concurrentes y los valores mínimos y máximos de dwell timey

Page 27

Método MRM estático para pesticidas seleccionados (25 ng/ml)seleccionados (25 ng/ml)

4x10

6.5

7

+ESI MRM Frag=120.0V CID@** (309.0 -> 281.0) pos_QC_07-r001.d

1 17x104

3

3.5

4

4.5

5

5.5

6

0.5

1

1.5

2

2.5

3

12.96513934

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

• El método final incluye 11 pesticidas con 2 transiciones MRM

• Dwell time 25 ms para cada transición, inter-scan delay 2 ms

Counts vs. Acquisition Time (min)0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

Método MRM Dynamic para 175 pesticidas (25 ng/ml)ng/ml)

4x10

7.5

8

+ESI MRM Frag=120.0V (309.0 -> 281.0) 250Mix_25 ppb-r001.d

1 18x104

3.5

4

4.5

5

5.5

6

6.5

7

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

12.94814952

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25Counts vs. Acquisition Time (min)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

• El método final incluye 175 pesticidas con 2 MRM (350 MRMs)

• Dwell times flexibles con un cycle time fijo de 750 ms Inter scan delay 3 5 ms• Dwell times flexibles con un cycle time fijo de 750 ms, Inter-scan delay 3.5 ms

Page 29

Comparación MRM estático vs dinámico (10 ng/ml)Peak Areas Solvent

(n = 20)Citron(n = 5)

Carrot(n = 5)

Cucumber(n = 5)

Dynamic Static Dynamic Static Dynamic Static Dynamic Static MRM MRM MRM MRM MRM MRM MRM MRM

MethamidophosAverage

CV276770.95

265792.22

229460.82

216752.40

229522.23

228792.16

224752.68

215911.40

AcephateAverage

CV248131.62

237652.17

238542.30

233281.36

252351.65

244610.75

254281.84

245820.82

CarbendazimCarbendazimAverage

CV897200.94

860271.66

534130.80

518371.20

538141.42

525320.92

919441.00

898120.61

AldicarbA 31069 29859 16687 16260 30924 30245 28214 26707Average

CV310691.21

298591.77

166870.75

162601.23

309241.76

302451.12

282141.37

267071.15

FensulfothionAverage 29533 28304 22060 21476 33777 32610 31789 30235

CV 1.55 1.38 0.73 1.59 1.29 1.78 2.47 0.76

FenhexamidAverage

CV60132.43

57912.54

50091.14

46253.57

93314.48

94332.85

47008.50

54246.98

Page 30

Comparación MRM estático vs dinámico (10 ng/ml)Peak Areas Solvent

(n = 20)Citron(n = 5)

Carrot(n = 5)

Cucumber(n = 5)

Dynamic MRM

Static MRM

Dynamic MRM

Static MRM

Dynamic MRM

Static MRM

Dynamic MRM

Static MRMMRM MRM MRM MRM MRM MRM MRM MRM

Diflubenzuron Average

CV71302.46

67202.40

16396.14

17443.76

68024.68

63981.40

66092.02

62791.57

Spinosyn AAverage

CV153897

1.12151002

1.23142868

0.86143027

0.47114625

0.97114595

0.28112952

0.76109072

0.84

Spinosyn DA 44289 43248 41065 40807 23030 23067 25979 25154Average

CV442890.75

432481.88

410650.48

408070.61

230300.51

230671.13

259790.35

251540.92

CypermethrinAverage

CV19214 20

18174 46

26574 26

27754 30

16056 96

14572 61

17251 11

16845 00CV 4.20 4.46 4.26 4.30 6.96 2.61 1.11 5.00

Avermectin B1aAverage

CV105153.34

42825.90

113941.43

55561.06

105402.50

49024.65

70823.49

35622.55

Page 31

Kits de Aplicaciones para LC/MS QqQLC/MS-QqQKits Base de Datos DMRM• Adaptables a la cromatografía del usuario.

• Chequeo opcional de la aplicación on-site.

• Kit 600 pesticidas i l :• Kit 600 pesticidas incluye:– Columna y mezcla de test específica.– QuEChERS Trial pack para preparación muestra.– DVD con los parámetros del métodos/s (LC y MS).– Nota de aplicación y guía de inicio rápido.– Ejemplos con distintas configuraciones y HPLC’s. 5990-4253EN

• Kit 200 compuestos de interés Toxicológico incluye:– Columna y mezcla de test específica.

5990-4254EN

y p– DVD con los parámetros del métodos/s.– Nota de aplicación y guía de inicio rápido.– Contiene esencialmente drogas de abuso y fármacos

Página 32

5990 4254EN

Resumen1. Agilent 1290 Infinity LC permite separaciones ultra-

rápidas y con muy buena resolución cromatográficaGran capacidad de pico para separaciones complejasExcelente precisión en inyección y RTBajos volúmenes muertos para métodos ultra-rápidosMuy bajo efecto memoria en AS

2. Agilent MS/MS Triple Cuadrupolo. El complemento perfectoperfecto

Cambio de polaridad pos/neg de alta velocidadMét d á id MRM / D i MRM QQQMétodos rápidos MRM / Dynamic MRM para QQQExcelente sensibilidad y rango dinámico lineal

Page 33

Agilent Application Kits

6230 TOF 6530 QTOF 6540 QTOF

Screening de substancias hibid i t dprohibidas con sistemas de

Tiempo de Vuelop

Aportación de los sistemas de Tiempo de VueloMasa Exacta Inferior a 1 ppmMasa Exacta Inferior a 1 ppm

Aportaciones de la Masa Exacta1. Especificidad en la comparación.2. Muy Elevada Selectividad Cuantitativa para la extracción de informaciónespecífica de cada metabolito/compuesto con métodos de adquisición genéricosespecífica de cada metabolito/compuesto con métodos de adquisición genéricos(modo barrido).Requerimientos en Biociencia

1. “Masa Exacta” independiente de la concentración del analito.2. Buena Sensibilidad en modo barrido (métodos genéricos MS-SCAN).

Exactitud Masa (ppm) Nº posibles fórmulas empíricas Tecnología

165 ppm 209 QUAD/TRAPpp10ppm 135 ppm 72 ppm 2 TOF /Q-TOF

Comp : Reserpina (C33H40N2O9) [M+H]+: 609 281 m/zComp.: Reserpina (C33H40N2O9). [M+H] : 609.281 m/z

Molecular Feature Extractor (MFE)Desde la complejidad de los datos iniciales a la obtención de la informacion p jmás relevante

2D2D

3D

Molecular Feature ExtractorPaso efectivo de Datos en Información RelevantePaso efectivo de Datos en Información Relevante

Raw data Background noise removed

Individual m/z peaks grouped into isotope

Isotope clusters grouped intoremoved grouped into isotope

clustersgrouped intomolecular features

Al it d D t Mi i t t d A il t T h l iAlgoritmo de Data Mining patentado por Agilent Technologies.

Mucho más que un simple reporting de presencia de iones con datos de masa exactade masa exacta

Identificación sencilla de 400 compuestos en una muestra de miel con generación automática de fórmula … ¡en 5 g ¡minutos!

Lista de tcompuestos con

fórmulasmoleculares

Superposición de ECCs (Extracted

Compound

Resultadosdetallados del

pChromatograms)

Detailed Formula

detallados del cálculo de la

fórmula

Generation Results

Espectro de masascon superposición

del patrón isotópicoesperadoesperado

Empirical Formula Generation – Mass Hunter

Listas de compuestos con fórmulas empíricas calculadas

Cromatogramas extraídos para cada MF encontrada por el softwarep

Resultados usados para pel cálculo de la fórmula molecular

Espectro de masa con pattern isotópico esperado superpuesto

Búsquedas en librerías comerciales, propias, herramientas para pacotar resultados …

Agilent TOF Solución de ScreeningAgilent 6220/30 TOF• 20K Resolucion• 5 decadas en-scan

S ibilid d i l d b j• Sensibilidad a nivel de pg bajos

Page 40

Agilent Personal Compound Database Base de Datos de masa exacta con 1600 pesticidasBase de Datos de masa exacta con 1600 pesticidas

Masa Monoisotópica(varia en ppm)

Scoring basado en

(varia en ppm)

Distribucion Isotópica

Isotope spacing(varia en ppm)

Distribucion Isotópica(varia en %)

Nuevo, para TOF/Q-TOF screening de pesticidas• Contiene 1600 pesticidas recopilados de 5 laboratorios de control regional en

Europa y AsiaEuropa y Asia• Misma interfase que METLIN – simple e intuitiva, incl. estructuras• Scoring basado en masas monoisotopicas, isotope spacing/distribution

Li k Ch id• Links a Chemspider

Matriz Compleja de Pimiento extraída con método QUECHERS . ¿Cómo identifiar los pesticidas presentes en este cromatograma FS?

Tanto si el cromatograma tiene pesticidas como si no, el aspecto del p , p

cromatograma es muy parecido

Respuesta: Búsqueda automatizada en bases de datos de masa exactadatos de masa exacta

Pero, ¿cómo se llega realmente de la transparencia anterior a esta?

Pesticide Personal Compound Database1600 Pesticides and Related compounds1600 Pesticides and Related compounds

Scoring basado en

Masa Monoisotópica(varia en ppm)

Isotope spacing(varia en ppm)

Distribucion Isotópica(varia en %)

(varia en ppm)

El usuario puede generar sus propias bases de datos en funcion de que el método usado pueda mejorarse para una matriz en particular

Paso 1: Analizar un set o sets de estandares de pesticidas y Procesar con MassHunter (MFE)

6

p y ( )

Paso 2: Importar fichero en PCDB y “Find Compounds” Resolución de posibles conflictosCompounds . Resolución de posibles conflictos

Los posibles conflictos (p.e. misma masa a dos RTs distintos) aparecen en color rojo. Una vez resueltos el color rojo desaparece. La base de datos puede además adaptarse

añadiendo/quitando compuestosañadiendo/quitando compuestos

Paso 3: Batch Summary Actualizar tiempos de retención para análisis target/no-target

Cuando se hace el update de RTs la base de datos puede usarse para compuestos target y no-target Aunque presentes en la base de datostarget …. Aunque presentes en la base de datos

Paso 4: Repetir el proceso para una muestra real: Target/No-Target.g g

Automatización de la búsqueda desde MassHunter CualitativoCualitativo

Una vez adaptada/comprobada la base de datos suele usarse desde MassHunter Qual

Análisis de un extracto real de pimiento extraído con el método QUECHERS

7

con el método QUECHERS

Resultados del Screening usando MFE + PCDB de pesticidaspesticidas

COMPUESTOS TARGET - RTs conocidos – Estándares inyectados

COMPUESTOS NO TARGET - RTs desconocidos pero loresentes en la DB – Estándares no inyectadosp y

Agilent Quick Start Application KitsEl camino más rápido a la productividad

Disponibles para GC, GC/MS, LC y LC/MS para:Análisis alimentario

El camino más rápido a la productividad

Análisis alimentarioAnálisis ambientalAnálisis Forense/ToxicológicoAnálisis Forense/ToxicológicoAnálisis petroquímico

Todo lo necesario para el éxito de su aplicación:• Configuración ideal de instrumento + Bases de Datos & Software• Consumibles específicos para la aplicación• Consumibles específicos para la aplicación• Documentación específica para la aplicación• Muestras de test específicas para la aplicación• Método en CDMétodo en CD• Herramientas de entrenamiento en video• Chequeo opcional en fábrica• Chequeo opcional de la aplicacion on-siteChequeo opcional de la aplicacion on site

Resumen Agilent TOF. Application Kit para screening de pesticidasscreening de pesticidas1. Diseñados para mantener una elevada

sensibilidad2. Elevada resolución MS3. Exactitud de masa mejor que 2 ppm4. Elevado rango dinámico espectral5. Excelentes prestaciones para screening de

compuestos• Nueva base de datos personalizada de

compuestos • Adaptable• Inicialmente con 1600 entradas

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Adulteraciones y su determinaciónAdulteraciones y su determinación con sistemas de tiempo de vuelo

Perfil metabolómico de vinos usando un sistemaHPLC-QTOFMS y herramientas avanzadas de estadísticas de

data mining/comparacióng p

Ondrej Lacinaa, Lukas Vaclavika, Jana Hajslovaa, Jerry Zweigenbaumb

a Institute of Chemical Technology Prague, Czech Republicb Agilent Technologies, Wilmington, DE, USA

Objetivos del estudioObjetivos del estudio1. Demostración del potencial del sistema Agilent LC–1. Demostración del potencial del sistema Agilent LC

QTOF-MS para el perfilado metabolómico de alimentos

2. Desarrollo de un procedimiento de data mining y

procesado de datos para obtener información acerca de p p

los potenciales marcadores de cada variedad de vino

3 C t ió d d l t dí ti d l ifi ió3. Construcción de un modelo estadístico de clasificación

4. Identificación de los compuestos marcadores de cada

una de las variedades

Flujo de trabajo propuesto

MUESTRAS

ANÁLISIS INSTRUMENTAL DATA MININGS S S U• RRLC separacion, columna RP• ESI(MM)-QTOFMS (MS - MS/MS)

• extracción molecular features • substracción del fondo

PROCESADOIDENTIFICACION• filtrado de datos• análisis estadístico (ANOVA, PCA)• clasificación (PLS-DA)

• experimentos MS/MS• estimación de formula molecular• busqueda en base de datos ( )busqueda e base de datos

MUESTRAS• Vino Tinto (45 samples total)

• Variedades: Cabernet Sauvignon (15), Merlot (16), Pinot Noir (14)

• Países de Origen: Czech Republic, Slovakia, France, Italy, Macedonia,

Bulgaria, Hungary, Australia, Chile, Germany, USA

• Añadas: 2004 - 2008

d blSet de muestras muy variable

Instrumentación Utilizada

?Sin preparación previa de muestra, análisis directo (previa microfiltración).

Jet Stream ESI source

?Jet Stream ESI sourceMultimode ion source

Software de áAnálisis

Estadístico Multivariante

Eclipse Plus C18 (2.1×100, 1.8µm)HILIC Plus C18 (2.1×100, 3.5µm)

Agilent Technologies6530 Accurate‐Mass Q‐TOF LC/MS

Agilent Technologies1200 RRLC system

Procesado de Datos. Total Ion Chromatograms

TIC vino y LC blanco, LC-(ESI+) QTOFMS

?? ??

???

??

??

?

??

???? ? ?

???

??

?

???

?????

??

?

??

?? 6x10

0.7

0.8

0.9

1

1.1

1.2

1.3+ESI Scan (6.248-6.387 min, 13 scans) Frag=125.0V ESI+_PN…

* 210.1133

Los espectros corresponden

a múltiples compuestos ? ?

BLANCOVINO

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

493.1350

200 400 600 800 1000

coeluyentes

1. Datos muy complejos.2. Compuestos minoritarios

enmascarados

Counts vs. Mass-to-Charge (m/z)200 400 600 800 1000

6x10

1.2

1.4

1.6

1.8+ESI Scan (3.888-3.981 min, 9 scans) Frag=125.0V ESI+_PN_…

enmascarados3. Se requiere software que extraiga y

caracterice todos los compuestos ionizados. 0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

358.1719

571.3074

Counts vs. Mass-to-Charge (m/z)200 400 600 800 1000

Extracción de Datos: “Find By Molecular Feature”

M.F.E. extrae 20.506 “features” del conjunto de todas las muestras

Find compound byMolecular Feature

ExtractorExtractor

Procesado de datos – Mass Profiler P f i l Ali d d MF l t d d tProfesional - Alineado de MFs en el set de datos

20506 entidades

molecularesmolecularesobtenidas

desde todaslas muestras

Procesado de datosFiltración de entradas por frecuencia (P i l )

Filtro por defecto: Presencia de una entidad en el 100% de

Filtración de entradas por frecuencia (Presencia en clases)

una entidad en el 100% de muestras al menos en un grupo

663 entidades de 20506 permanecen

inte

nsity

Aver

age

i

En sets de muestras muy complejos esta aproximacion puedeeliminar algunos compuestos significativoseliminar algunos compuestos significativos

Procesado de datosFiltración por frecuencia Entidad significativa – Pinot NoirFiltración por frecuencia. Entidad significativa – Pinot Noir

Este compuestoestá presente en 14 d l 1514 de las 15 muestras de Pinot NoirPinot Noir

tens

ityAv

erag

e in

t

Solo algunas entidades significativas están presentes en el

A

Solo algunas entidades significativas están presentes en el 100% de las muestras en una clase

Procesado de datosA áli i t dí ti O W ANOVAAnálisis estadístico: One-Way ANOVA

p<0.0540 tid d d40 entidades de

3600 permanecen

Procesado de datosAnálisis estadístico Cambio de forma (fold)Se usa Fold Change Analysis para identificar entidades con abundancias significativamente distintas en las clases seleccionadas

Análisis estadístico. Cambio de forma (fold)

abundancias significativamente distintas en las clases seleccionadas

tyge

inte

nsi

Aver

ag

Cabernet Sauvignon y Merlot son un par problemático se aplica un cut-off FC ≥ 2 0

26 entidades de 40 permanecenproblemático, se aplica un cut-off FC ≥ 2.0 permanecen

Revelado de la Estructura Interna de los Datos mediante Filtrado por Frecuencia y Análisis de Componentes

PCA de datos PCA de datos

Principales (PCA)

Entradas iniciales (20506)  Entradas filtradas por frecuencia (3600)

FILTRATION

CABERNET SAUVIGNONMERLOTPINOT NOIR

FILTRATION

PINOT NOIR

Revelado de la Estructura Interna de los Datos mediante ANOVA y Análisis de Componentes Principales (PCA)

PCA de los datos:Componentes después de ANOVA (p≤0.05) & Ratio de cambio (≥2.0): 26

y p p ( )

Componentes después de ANOVA (p≤0.05) & Ratio de cambio (≥2.0):   26

Un adecuado filtrado de los datos

es esencial para

FILTRACIÓN

puna buena

clasificación

CABERNET SAUVIGNONCABERNET SAUVIGNONMERLOTPINOT NOIR

CONCLUSIONES1. LC–QTOFMS es una herramienta extremadamente útil

para el estudio del metaboloma del vino e identificación de sus componentes

2 Mass Profiler Pro software permite un procesado avanzado2. Mass Profiler Pro software permite un procesado avanzado y eficaz de los datos haciendo uso de herramientas quimiométricas comunesquimiométricas comunes

3. Las diferentes variedades de vino puede discriminarse de modo eficaz usando perfiles LCMS y modelos de prediccion multivariantes

4. Para una mayor generalización (siempre) es necesario un mayor número de muestrasmayor número de muestras

Gracias por su atención

Juan AybarEspecialista de Producto GCMS/LCMSp

Agilent Technologies Spain901.11.68.90

juan-luis_aybar@agilent.com

This information is subject to change without notice© Agilent Technologies, Inc. 2010Published in Spain, January 15, 2010