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Aplicaciones de la biología molecular a la patología tumoral
endocrinológica
Mercedes Robledo Hereditary Endocrine Cancer Group Human Cancer Genetics Programme
Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas, CNIO, Madrid [email protected]
Biología Molecular
Objetivo común
Diagnóstico temprano, estratificación de riesgo,
terapia adecuada del paciente
Tejido enfermo (tumor)
Staudt LM, N Eng J Med 348: 1777-85 (May, 2003) Staudt LM, N Eng J Med 348: 1777-85 (May, 2003)
Herramientas bioinformáticas
Genes que co-expresan...
¿Qué tienen
en común?
Distintos fenotipos
¿Que genes son
los responsables?
Preguntas:
Genes que interaccionan en
una red (A,B,C..)...
¿Como es
la red?
A
B C
D E
Genes de una clase ¿Qué patrón(es) tienen? y...
¿hay más?
Clasificación molecular
Imprescindible: criterios clínicos homogéneos
Bien diferenciados Pobremente diferenciados y anaplásicos (<5 %)
PTC (85 %) FTC (10 %)
Subtipo clásico
Variante folicular
Oncocítico, de células claras, esclerosante difuso, de células altas, etc
Minimamente invasivo Invasivo
Carcinoma de tiroides derivado de célula folicular: heterogeneidad
Escenario
Diferenciación
Peor pronóstico
PTC clásico
Célula folicular tiroidea normal
TCVPTC PDTC
Carcinoma Anaplásico
Adenoma Folicular
FTC PDTC
p53 β-catenina
p53 β-catenina
BRAF RAS RET/PTC NTRK MET c-myc
RAS PAX8/PPAR
PIK3CA
Sobre-expresión de Ciclina D1 Infra-expresión de p27
Adenoma Folicular hiperfuncionante o tóxico
TSHR GNAS1 (Gsα)
PTEN
(Modificado de Kondo et al., 2006)
Tejidos congelados + Datos clínico-patológicos
21 Adenomas foliculares (FA) 46 Carcinomas bien diferenciados (13 FTC y 33PTC)
6 Carcinomas pobremente diferenciados (PDTC) 8 Carcinomas indiferenciados (ATC)
6 Tejidos tiroideos normales
% células tumorales
Caracterización de las mutaciones puntuales (BRAF, HRAS, NRAS y KRAS)
Estudio de los reordenamientos Determinación de los perfiles de expresión
H & E
Extracción ADN
Extracción ARN
OBJETIVOS
Identificación de rutas de señalización y genes específicos relacionados con la carcinogénesis
tiroidea, así como un predictor molecular de curso clínico.
Identificación de marcadores moleculares y rutas biológicas implicadas en la pérdida de diferenciación celular y mal pronóstico
ATC/PDTC vs PTC ATC/PDTC vs FTC
ATC/PDTC vs PTC 1594 + 1456 -
ATC/PDTC vs FTC - 1652 + 1566
ATC/PDTC
vs PTC
ATC/PDTC
vs FTC
Pérdida de diferenciación
ATC/PDTC vs WDTC: 1309 + 1339
A B +
+ -
-
T-REX
Base de datos GO
Progresión del Ciclo Celular *Mitosis
*Replicación y reparación del ADN
*Reorganización cromosómica y
biogénesis
*Reorganización de los filamentos de
actina y los microtúbulos
Marcadores de mal pronóstico previamente descritos en
distintos tipos de cáncer:
*Inhibidores de la apoptosis: BIRC5
*Activadores de proteínas control del huso mitótico (BUB1, BUB3,
KNTC2, MAD2, PLK4 y STK6)
*Marcadores del ciclo celular (CCNB1, CCNA2 y CDC2)
ATC/PDTC vs PTC
ATC/PDTC
vs FTC
Pérdida de diferenciación
FAtiGOplus
Términos KEGG Genes sobre-expresados Genes sub-expresados
Ruta de señalización de las MAP quinasas
AKT2, SOS1, FGFR1, MAPK12, ATF4, STMN1, MYC,
ELK1, TGFB2, RAC1, HRAS, CRKL, ARRB2, MINK1,
TGFBR2, NRAS, MAP4K4, MKNK1, MAPK8IP1, CDC25B,
MAP2K3, PRKCA y MAP3K8
PLA2G6, NF1, CASP2, DUSP14 y CASP9
Ciclo celular
MCM7, MAD2L1, CDK2, PKMYT1, HDAC2, ORC6L,
CDKN2C, GSK3B, E2F2, MCM10, CCNA2, TGFB2, MCM6,
CCNB2, BUB1, CCNE1, CDC25A, CDC6, CDC25B, MCM3,
PRKDC y CDC2
-
Adhesión focal
ABI2, ARPC1B, MYH10, PFN1, SOS1, FGFR1, ARPC3,
GNA13, ITGA5, RAC1, HRAS, SSH1, CRKL, ACTN2,
DIAPH3, NRAS, ITGA11, VIL1, F2R y PIK3CD
ARHGAP5, PPP1CA y PAK3
Regulación del citoesqueleto de actina
ABI2, ARPC1B, MYH10, PFN1, SOS1, FGFR1, ARPC3,
GNA13, ITGA5, RAC1, HRAS, SSH1, CRKL, ACTN2,
DIAPH3, NRAS, ITGA11, VIL1, F2R y PIK3CD
PPP1CA, AVIL y PAK3
Ruta de señalización de TGFβ GDF5, THBS1, MYC, FST, TGFB2, SMURF1, TGFBR2,
RBX1 y IFNG
PPP2CB, ID1, SMAD7, ID2, BMPR1A, ZFYVE16
y ID4
Ruta de señalización de WNT WNT5B, WNT8B, GSK3B, MYC, VANGL1, RAC1, RBX1,
PRKCA y DVL3 PPP2CB, SIAH1, CXXC4 y FZD5 Transición del epitelio a mesénquima (EMT): proceso de pasos
múltiples que lleva a la pérdida de polaridad de la célula epitelial, represión de marcadores epiteliales y sobre-regulación de proteínas mesenquimales.
Identificación de marcadores moleculares y rutas biológicas implicadas en la pérdida de diferenciación celular y mal pronóstico
Familia Génica Símbolo del Gen
Familias génicas con genes sobre-expresados
Familia de las metaloproteasas de la matriz extracelular (MMP) MMP1, MMP2, MMP10, MMP11, MMP19 y MMP25
Familias Alpha, beta y gamma tubulinas TUBG2, TUBB5, TUBB, TUBA8, TUBA6, TUBA3 y TUBA1
Familia de los enzimas E2 ubiquitin-conjugantes UBE2C, UBE2T, UBE2I, UBE2V2 y UBE2V1
Familia A de los antígenos del melanoma MAGEA1, MAGEA2, MAGEA3, MAGEA4, MAGEA6, MAGEA8, MAGEA10 y
MAGEA11
Familia de las ciclinas involucradas en la transcripción CCNE1, CCNB2 y CCNA2
Familia de las proteínas centroméricas CENPA, CENPB, CENPE y CENPF
Familia de las lamininas de la matriz extracelular de glicoproteínas LAMB1, LAMA3, y LMNA y el mediador de la interacción entre laminina B y
cromatina (LBR)
Familia del colágeno COL12A1, COL6A3, COL6A2 y COL1A1
Familia de las proteínas DEAD box DDX11, DDX55, DDX39, DDX21 y DDX10
Familia de las quemoquinas X CXCL10, CXCL11 y CXCL3
Familia de las proteínas relacionadas con la actina (ARPs) ACTRT1, ACTL7B, ARPC3 y ARPC1B
Familia de los factores proteicos de transformación del crecimiento TGFBR2, TGFB2, TBRG4 y TGFB1I1
Superfamilia de receptores y ligandos de los factores de necrosis tumoral Receptores: TNFRSF6B, TNFRSF19L; Ligandos: TNFSF7, TNFSF13B y
TNFSF11
Familia de quinasas relacionadas con NIMA (never in mitosis gene a) NEK2, NEK3 y NEK6
Familias génicas con genes sub-expresados
Familia de las fosfatasas 2 PPP2R5C, PPP2R5A y PPP2CB
Familia de las proteínas dominante negativo helix-loop-helix ID1, ID2 y ID4
Familia de las proteíans Heat-shock DNAJC4, DNAJB5 y DNAJB2,
Familia de proteínas aldehído deshidrogenasas: ALDH9A1, ALDH6A1, ALDH3A2 y ALDH1A1
Superfamilia de cadherinas integrantes de membrana que median la adhesión célula-célula dependiente
de calcio CDH1 y CDH12
ATC/PDTC vs PTC
ATC/PDTC
vs FTC
Pérdida de diferenciación
PubMed, Entrez Gene, …
Se expresan en muy pocos tejidos normales Asociados a un fenotipo agresivo
Resistencia a agentes quimioterapéuticos
¿Inmunoterapia anti-MAGE para los ATC/PDTC?
Procesos biológicos y rutas moleculares implicadas en la pérdida de
diferenciación del cáncer del epitelio folicular tiroideo.
Dianas potenciales para el diseño de terapias dirigidas.
Identificación de marcadores moleculares y rutas biológicas implicadas en la pérdida de diferenciación celular y mal pronóstico
Clase predictor
Clase real ATC/PDTC PTC/FTC Error
ATC/PDTC 16 0 0
PTC/FTC 2 26 0,0714
Mal pronóstico
Error Total: 0,0455
Buen pronóstico
ATC/PDTC vs PTC
ATC/PDTC
vs FTC
Pérdida de diferenciación
Prophet
* *DSVPTC
Seguimiento <2 años
Validación de la firma: de inmediata aplicación clínica
Identificación de marcadores moleculares y rutas biológicas implicadas en la pérdida de diferenciación celular y mal pronóstico
Son tumores relativamente frecuentes: representan el 16,7% de los tumores intracraneales (14.4% en estudios de autopsia y 22.5% en estudios radiológicos).
Shereen Ezzat. Cancer 2004;101:613–9
Comportamiento biológico muy variable (producción hormonal/ proliferación celular). Tras el tratamiento inicial, la posibilidad de persistencia de restos tumorales obligan en muchos casos a considerar una nueva intervención (dependiente de tamaño y de funcionalidad): necesidad de marcadores
Material:
40 no funcionantes: 22 invasivos y 18 no invasivos
19 adenomas (10 invasivos y 9 no invasivos), como serie independiente.
Caracterización:
Criterios histológicos, seguimiento radiológico, etc homogéneos para todos los pacientes.
Galland F, et al. Endocrine Related Cancer 17: 361-371, 2010.
35 genes seleccionados para validación.
Solo 4 confirmados en serie independiente: IGFB5, MYO5A, FLT3 y NFE2L1
IHC: fuerte tinción positiva de MYO5A entre los invasivos. Marcador de utilidad clínica
Correlación positiva entre MYO5A y PTTG.
Raverot G, et al. JCEM 95: 1708-1716, 2010.
94 pacientes con prolactinoma:
invasivos,
agresivos e
invasivos agresivos.
Diseño experimental:
1- Miden la expresión de 9 genes previamente seleccionados con perfiles de
expresión.
2- Siete de ellos muy correlacionados con progresión .
Controlados
por E2F y
E4F
S
G2
G0
G1
Quiescence Mitogenic
Cascades
pRB
INK4
(p15, p16, p18 y
p19)
p53
Cyclin D
p21Cip1
p27Kip1
CDK4
PTTG1/ Securin
Chromosome
segregation
Separase
CDK2
Cyclin A
CDK1
Cyclin B
M E2F
CDK6
Transcription
CDK1
Cyclin A CDK2
Cyclin E
CDK2
Cyclin E
Antimitogenic Signals
Antimitogenic Signals
Quereda V & Malumbres M, Journal of Molecular Endocrinology 42: 75-86, 2009
Adenomas hipofisarios:
Además de los marcadores que ya se conocen y están validados como de utilidad pronóstica, como PTTG1, VEGF, p27, AIP, p53, Ki67, etc...en los próximos años asistiremos a la identificación de una gran cantidad de marcadores siempre que existan proyectos de colaboración, en la que los tumores se caractericen de forma homogénea.
SDHA 2010
TMEM127 2010
SDHAF2 2009
KIF1B 2008
SDHB 2001
SDHC 2000
SDHD 2000
MEN1 1997
VHL 1993
RET 1993
NF1 1990
PCC/PGL
???
PCC/PGL
Otros signos
Heterogeneidad genética:
necesidad de marcadores diagnósticos
SDHB SDHD SDHC VHL RET NF1 SP FPCC VHL/ SDH RET/ NF1
López-Jiménez E, et al., Mol Endocrinol. 24(12):2382-91, 2010
Identificación de marcadores diagnósticos
- Los perfiles de expresión son específicos del background genético y no de la localización del tumor. - Los tumores clasificados como familiares sin mutación estaban distribuidos en dos subgrupos dentro del cluster 2: sugiere la existencia de más de un gen.
- VHL
- SDHB, SDHD, SDHC
- NF1
- RET
- FPCC y SP
84
PCC/PGL
VHL/SDH RET/NF1
- Ambas clases genéticas comparten un mismo perfil secretor de catecolaminas.
-Interesan las clases VHL y SDHB debido a su diferente pronóstico.
Secretores de
Norepinefrina
OH
HO OH
CH2 CH NH2
Resultados de Agrupamiento No Supervisado
Analisis Supervisado entre VHL y SDHB
• Se obtuvieron 782 genes diferencialmente expresados de forma significativa (FDR<0,05).
• Validación en muestras congeladas y parafinadas:
SD
H
B
SD
H
B
SD
H
B
SD
H
B
SD
H
B
SD
H
B
SD
H
B
SD
H
B V
HL
VH
L
VH
L
VH
L
VH
L
VH
L
VH
L
VH
L
VH
L
VH
L
VH
L
VH
L
VH
L
VH
L
VH
L
UBXD3 (<0.001)
DDIT4L3 (<0.001)
PNMA3 (<0.001)
KIAA0644 (<0.001)
SPAG4 (<0.001)
TFAP2C (<0.001)
MTP18 (<0.001)
PLCH2 (<0.001)
RGS22 (<0.001)
EGFL7 (<0.001)
SPOCK2 (<0.001)
EGLN3 (<0.001)
EYA1 (<0.001)
TCERG1L (<0.001)
PTHLH (<0.001)
MT3 (<0.001)
THC2412859 (<0.001)
MT3 (<0.001)
A_24_P50666 (<0.001)
RARRES2 (<0.001)
GPR30 (<0.001)
BX647543 (<0.001)
FLI46266 (<0.001)
ACTA1 (<0.001)
ENST000003824 (<0.001)
CB305813 (<0.001)
APOBEC2 (<0.001)
TNT (<0.001)
SLC16A3 (<0.001)
ACTL8 (<0.001)
SLC2A1 (<0.001)
CGNL1 (<0.001)
BC038245 (<0.001)
LOC198437 (<0.001)
AK125302 (<0.001)
THC2437822 (<0.001)
DRD1P (<0.001)
CRTAC1 (<0.001)
MT1F (<0.001)
CRYBA2 (<0.001)
HSPB7 (<0.001)
BC047230 (<0.001)
THC2404004 (<0.001)
POPDC3 (<0.001)
A_24_P365349 (<0.001)
GCGR(<0.001)
CDH10 (<0.001)
SHD (<0.001)
ELOVL7 (<0.001)
RBM11 (<0.001)
Código de Color
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
RU
SPOCK2 EglN3 SLC2A1 SLC16A3 BNIP3 CDH10
VHL casos
SDHB casos
López-Jiménez E, et al., Mol Endocrinol. 24(12):2382-91, 2010
Tinción con antiEglN3 en tumores VHL
En busca de marcadores diagnósticos de clase genética
EglN3 es un buen marcador para la clase de tumores VHL utilizando qPCR
Tumores no VHL VHL
EglN3
López-Jiménez E, et al., Mol Endocrinol. 24(12):2382-91, 2010
SDHA 2010
TMEM127 2010
SDHAF2 2009
KIF1B 2008
SDHB 2001
SDHC 2000
SDHD 2000
MEN1 1997
VHL 1993
RET 1993
NF1 1990
PCC/PGL
???
PCC/PGL
Otros signos
MAX 2011
Comino-Méndez, I., et al. Nat Genet. 2011 Jun 19;43(7):663-7
SDHA 2010 TMEM127
2010
SDHAF2 2009
KIF1B 2008
SDHB 2001
SDHC 2000
SDHD 2000
MEN1 1997
VHL 1993
RET 1993
NF1 1990
PCC/PGL
SDHB SDHD SDHC VHL RET NF1 SP TMEM127 FPCC
? López-Jiménez, E. et al, 2010.
Comino-Méndez, I., et al. Nat Genet. 2011.
Fenotipo similar
A_23_P90696_TRIB2
A_23_P420551_CIT
A_23_P52227_GDF10
A_24_P355464_GDF10
A_24_P343695_RET
A_23_P40217_DOK5
A_23_P65779_STRA6
A_32_P111565_FTH1
A_24_P58337_FTH1
A_23_P57836_A_23_P57836
A_32_P187704_DA237404
A_32_P210168_LOC388135
A_24_P272993_MEG3
A_23_P99141_GPR162
A_23_P153676_TLE2
A_23_P85008_MAOB
A_23_P85015_MAOB
A_23_P51986_MTMR11
A_23_P60146_PDGFRL
A_23_P79622_FKBP7
A_23_P71880_SPINK4
A_24_P95070_ENST00000222543
A_24_P174353_A_24_P174353
A_23_P301942_NPPC
A_23_P74059_NPPA
A_32_P102581_BG708379
A_24_P944973_EGFL11
A_23_P51718_PABPC4
A_23_P345692_IL17D
A_23_P80462_ENST00000295943
A_23_P49546_GRIN2C
A_32_P157208_AY343891
A_23_P48988_SH3GL3
A_23_P81392_WWC1
A_23_P60130_MAL2
A_32_P183718_SP5
A_23_P135381_SP5
A_23_P129133_OCA2
A_24_P347185_NPFF
A_23_P204079_NPFF
A_23_P45345_HTATSF1
A_23_P160214_C1orf34
A_32_P71675_ENST00000378266
A_23_P1102_ACTA1
A_32_P49616_EEF1B2
A_24_P152433_ENST00000312528
A_32_P37495_LOC388002
“Cluster 2” PCCs FPCCs
-2 0 2 4
Color key
47 clones significantly differentially expressed
(FDR<0.15) 15 clones significantly differentially expressed
FDR<0.05
MEG3
The most significant downregulated gene (n-fold change 29):
Maternally Expressed Gene 3, imprinted gene proposed as TSG
MEG3
ch.14
Supervised analysis FPCC (3) vs. cluster 2 PCCs (42)
hsa-miR-337-5p
hsa-miR-337-3p
hsa-miR-127-3p
hsa-miR-136
hsa-miR-136*
hsa-miR-379
hsa-miR-411
hsa-miR-758
hsa-miR-495
hsa-miR-376c
hsa-miR-376a
hsa-miR-654-3p
hsa-miR-381
hsa-miR-539
hsa-miR-487a
hsa-miR-382
hsa-miR-485-5p
hsa-miR-485-3p
hsa-miR-154
hsa-miR-154*
hsa-miR-377*
hsa-miR-377
hsa-miR-369-5p
hsa-miR-410
Chr. 17
FPCC1
Chr. 18
Chr. X
FPCC2
Chr. 22
Chr. 7
Chr. 12
FPCC3
Array-CGH analysis of the three FPCC tumors:
Patients’ germline
DNA
c.295+1G>A
c.223C>T
c.1A>G
Tumor DNA
Los 3 pacientes eran portadores de mutaciones que conducían a
proteína truncada
b
IHC: tinción negativa
MAX
RET
Comino-Méndez, I., et al. Nat Genet. 2011 Jun 19;43(7):663-7
Pacientes seleccionados (59): • Antecedentes familiares (5) • Feocromocitoma bilateral (22) • Edad de diagnóstico menor de 25 años (32)
REG
ISTRO
CLÍN
ICO
8 mutaciones diferentes (5 de proteína truncada y 3 missense)
Comino-Méndez, I., et al. Nat Genet. 2011 Jun 19;43(7):663-7
• Preferente transmisión paterna (explica la ausencia de antecedentes familiares en 3 pacientes).
• 3 de los 8 casos índice mostraron metástasis o antecedentes familiares.
Algoritmo
One tumour
If negative screening
SDHB
SDHD SDHC,
SDHAF2**
> 40y.
SDHB PCC
PGL Thoracic-abdominal
PGL Head & Neck
SDHD
SDHB
< 40y.
PCC/PGL patients without any syndromic feature
Multiple tumours
H&N PGL PCC Bilateral
Multiple PGL + PCC
SDHD
If negative screening
SDHB, SDHD SDHC*
VHL RET
SDHB TMEM127
MAX
If neg screening
VHL
RET
SDHB
TMEM127
MAX
SDHB SDHC SDHAF2
VHL RET
If negative screening
If negative screening
Modified from Horm Metab Res 41:672-5, 2009; J Clin Endocrinol Metab 94:1701-5, 2009; Comino-Méndez, I., et al. Nat Genet. 2011 Jun 19;43(7):663-7