Aplicación de técnicas microscópicas y moleculares para el análisis de las comunidades microbianas de un digestor anaerobio industrial como herramientas para su gestión   Humbert Salvadó 1, Francesc Prenafeta 2, Carme Arnabat 1, Belen Fernández 2, Miriam Guivernau 2, Oriol Canals 1 

1) Laboratorio de Protozoologia, Facultat de Biologia, Universitat de Barcelona. Av. Diagonal 645, 08028 Barcelona. e‐mail: hsalvado@ub.edu 

2) GIRO Centro Tecnológico – IRTA. Rambla de Pompeu Fabra 1, 08100 Mollet del Vallès (Barcelona) 

   

1. Introducción 

La  digestión  anaerobia  puede  ser  aplicada  como  un  proceso  de  estabilización  de  los  lodos primarios  y  secundarios  que  se  producen  en  una  depuradora  convencional  de  fangos activados. Los fangos activados están constituidos por una gran variedad de microorganismos, fundamentalmente  una  elevada  diversidad  de  bacterias,  y  en  un  segundo  orden  de importancia  protistas  y  metazoos  (Curds  1992).  Mediante  la  digestión  anaerobia,  los microorganismos  citados  y  la  materia  orgánica  contenida  en  la  mezcla  de  lodos  son transformados principalmente en metano y dióxido de carbono. En este proceso  intervienen diferentes grupos de microorganismos que actúan de forma sintrófica: eubacterias hidrolíticas, acidogénicas y acetogénicas, así como arqueobacterias metanogénicas. 

Existe  mucha  información  sobre  la  estructura  de  la  comunidad  biológica  en  digestores anaerobios a escala piloto. Gracias a la generalización de las técnicas de biología molecular, se han  ensayado  varias  técnicas  cualitativas,  como  DGGE  (Denaturing  Gradient  Gel Electrophoresis) o FISH  (Fluorescence  In Situ Hybridization), y cuantitativas, como qPCR  (Real Time  Quantitative  Polymerase  Chain  Reaction),  para  el  estudio  de  la  dinámica  de  las poblaciones  microbianas  en  relación  a  los  diversos  parámetros  de  operación  y  control (eficiencia  de  tratamiento,  producción  de  biogás,  etc.)  empleados  para  describir  el comportamiento  a  nivel  macroscópico  de  los  biorreactores.  Consecuentemente,  la caracterización microbiológica está  cambiando  la  visión paradigmática del biorreactor  como una  “caja  negra”  y  permite  establecer  un  diagnóstico  preciso  de  los  procesos  implicados  a escala microbiana (Palatsi et al. 2010).  Sin embargo, se ha encontrado muy poca información sobre  composición de  las  comunidades microbianas  en digestores  anaerobios  a  escala  real, sometidos a fluctuaciones derivadas de cambios de  la carga orgánica o de  la composición del agua  residual  o  del  fango  excedente,  como  por  ejemplo  la  existencia  de  distintas concentraciones  de  metales  tóxicos.  Entre  estos  cambios,  también  se  pueden  incluir  los efectos  de  fenómenos  climáticos  como  las  lluvias  torrenciales  que  se  presentan estacionalmente en la Comunidad de Murcia. 

 El uso de la microscopia tradicional nos aporta información tanto cualitativa como cuantitativa de una  importante diversidad de componentes del  fango activo que en el digestor están en 

proceso de degradación. Entre  los más estudiados se  incluyen  las bacterias filamentosas, por su  implicación en  las causas del  foaming, y  los protozoos, por su extendida utilización como bioindicadores.  La  comparación de  la estructura del  fango activo en pleno  rendimiento  y el estado  del  fango  en  el  digestor  puede  proveer  nuevas  herramientas  para  relacionar  los tiempos  de  retención  hidráulicos,  concentración  de  la  biomasa  u  obtención  de  parámetros cinéticos de desarrollo o destrucción de las bacterias filamentosas. El análisis microscópico se ha  utilizado  poco  como  herramienta  de  gestión  del  proceso  de  digestión.  La  aplicación  de nuevas técnicas microscópicas semicuantitativas, como el “Live/Dead” nos permite observar la abundancia  de  células  viables  y  células  muertas,  pero  mediante  la  cual  no  es  posible  la identificación de  los microorganismos  a nivel de  especie, ni  su discriminación en  categorías taxonómicas  superiores  (p.e.  eubacterias  versus  arqueobacterias).  Para  una  caracterización más detallada de  las poblaciones microbianas se pueden utilizar técnicas de FISH, aunque es precisa  la  realización  de  estudios  previos  de  la  microbiota  para  la  obtención  de  sondas específicas.  Esta  dificultad  puede  ser  superada  con  la  aplicación  de  la  DGGE,  técnica  que permite  obtener  una  visión  bastante  precisa  de  las  especies  predominantes,  así  como  su posterior identificación mediante la secuenciación del ADN. 

El objetivo del estudio es la caracterización de la estructura y dinámica de las comunidades de microorganismos que habitan los fangos de un digestor anaerobio real, mediante la adopción de una estrategia mixta que  integra técnicas de microscopía y de biología molecular. En este trabajo  se presentan  los  resultados preliminares  sobre  la  caracterización  cuantitativa de  los microorganismos  mediante  la  observación  microscópica  comparativa  de  las  bacterias filamentosas, protozoos y micrometazoos, así como mediante la aplicación de la qPCR para la determinación  del  ratio  entre  arqueobacterias metanogénicas  y  las  eubacterias  totales.  En base  a  los  resultados microbiológicos,  se han buscado  correlaciones  con  los parámetros de operación de la planta, que puedan facilitar la comprensión del comportamiento del proceso. 

 

2. Materiales y Métodos 

Se estableció un período de muestreo de ocho meses para considerar diferentes condiciones de  carga  y meteorológicas  que  puedan  afectar  al  proceso.  Se  han  recogido  un  total  de  12 muestras de febrero a septiembre de 2011. Cada toma consta de una muestra procedente de la  salida  del  digestor  y,  a  partir  de  abril,  se  añade  una muestra  de  fango  activo  (etapa  B). Posteriormente, una alícuota homogénea de cada muestra se conservó a ‐20ºC para extraer el ADN  a partir de  técnicas de bead‐beating  y determinar  los  grupos de procariotas mediante técnicas moleculares.  

Mediante microscopia  óptica  se  han  efectuado  recuentos  de  protozoos  ciliados,  protozoos flagelados  y  ameboideos,  metazoos  y  microorganismos  filamentosos,  huevos,  quistes  y estructuras  claramente  inidentificables.  La  estructura  del  flóculo  y  la  identificación  de  los principales  microorganismos  filamentosos  se  realiza  siguiendo  Jenkins  et  al.  (2004)  y Eikelboom (2000). El recuento de microorganismos filamentosos se realizó mediante la técnica  de Salvadó (1990). 

Para  la  determinación  de  protozoos  se  sigue  Lee  et  al.  (2000)  y  específicamente  para  los ciliados a Foissner et al.  (1991, 1992, 1994 y 1995). La determinación de metazoos  se  suele realizar a nivel de filo, aunque por su diversidad el filo de los rotíferos tiene un mayor interés y 

se  puede  identificar  siguiendo  Koste  (1978).  Se  han  realizado  tinciones  específicas  para determinar  los  distintos  taxones: Gram, Neisser,  PHB  y  detección  de  oxidación  de  sulfuros. Estas técnicas son útiles en el fango activo sin embargo los resultados en el digestor no fueron siempre  satisfactorios.  A  partir  del  muestreo  del  24/marzo/11,  se  utilizó  la  técnica  de Life&Dead  Baclight  Bacterial  Viability  Kit  (Invitrogen)  para  observar  la  viabilidad  celular  del fango activo y el digestor.  

Para el estudio de la dinámica del digestor se analizaron mediante cuantificación por qPCR los grandes grupos de procariotas: eubacterias y arqueas. Se determinó mediante PCR cuantitativa el análisis del ratio entre arqueas metanogénicas y eubacterias totales en base al número de copias  génicas  del  gen  codificante  para  la  subunidad  α  de  la  enzima  metil‐coenzima  M reductasa (mcrA) y el del fragmento ribosomal 16S rRNA, respectivamente. La metil‐coenzima M reductasa (MCR) es el enzima terminal que da lugar al paso final de la metanogénesis, que se emplea como marcador molecular por ser específico en las arqueas metanogénicas. Para la cuantificación del dominio Eubacteria  se han empleado primers universales específicos para dicho dominio que amplifican  la región v3‐v5 de  la región hipervariable del gen 16S rRNA. El análisis  se  realizó  a partir de 3  extractos de ADN  independientes en una  serie  temporal de muestras  de  biomasa  tomadas  del  biodigestor,  representativas  de  las  diferentes  fases  de operación caracterizadas en el apartado anterior. 

 3. Descripción de la EDAR 

El  estudio  se  realizó  en  la  EDAR  de  Alcantarilla,  en  la  Comunidad  de Murcia.  La  EDAR  de Alcantarilla consta de un sistema secundario de doble etapa (A y B). El sistema A de alta carga y  sin  tratamiento  primario  es  seguido  de  la  etapa  B.  La  etapa  B  consiste  en  un  sistema avanzado de fangos activos con eliminación de nitrógeno compuesto por un tanque anóxico de desnitrificación previo  al  reactor  aerobio.  Los  fangos biológicos de  la  etapa B  junto  con  los fangos procedentes de la etapa A son la fuente de alimentación del digestor anaerobio de alta carga, digestor que consta de un único tanque con bombeo interno. 

Los datos de proceso de  la EDAR Alcantarilla  fueron  facilitados por  la empresa explotadora ACCIONA AGUA. Se analizaron los datos de concentraciones de DQO, DBO, SST, SSV, pH, Ntotal, fosfatos y fósforo total a lo largo de la línea de agua, así como los parámetros de operación del proceso.  De  la  línea  de  fangos  se  analizaron  los  caudales,  el  pH,  la  temperatura  y  las concentraciones  de  SST,  SSV,  ST  y  SV  en  las  corrientes  de  entrada  y  salida  del  digestor anaerobio, así como  la concentración de  la alcalinidad total y de ácidos grasos volátiles en el digestor y el biogás producido (caudal y composición).  

En  general,  el  proceso  de  depuración  biológica  por  fangos  activos  del  agua  residual  ha presentado  buenos  rendimientos.  Durante  todo  el  período  estudiado  la  eliminación  de  la DBO5 ha sido de alrededor del 99%, así como  la eliminación de  la DQO ha sido del 95%. Por otra  parte,  la  eliminación  de  nutrientes  ha  sido  elevada  en  el  caso  del  nitrógeno,  con  un rendimiento global del 87%, y moderada en el caso del  fósforo con un  rendimiento del 53% (Tabla 1).  

 

 

Tabla 1. Entrada, rendimiento del reactor biológico etapa B y rendimiento global de la planta. 

  Entrada  Rendimiento reactor biológico  Rendimiento global planta 

  promedio (mg/L)  std  promedio (%)  std  promedio (%)  std 

SST  103,6  27,9  94,5  2,6  98,0  1,2 

DBO5  525,2  191,3  99,0  0,6  99,3  0,4 

DQO  703,4  139,4  93,4  3,0  95,7  1,4 

Nitrógeno Total  67,9  15,2  86,6  4,1  87,8  3,7 

Fósforo Total  9,2  2,1  48,3  27,2  53,2  25,1 

 Para  facilitar  la  evaluación  de  la  operación  del  digestor  en  relación  a  los  análisis microbiológicos, el período de muestreo (de febrero a septiembre de 2011) ha sido dividido en 3 intervalos: período 1 (P1) entre febrero y mayo;  período 2 (P2) entre mayo y junio; período 3 (P3) entre junio y septiembre. Durante este tiempo, el caudal de fango a digestión ha oscilado entre 72 y 349 m3/d, siendo el caudal medio 200, 133 y 176 m3/d en los períodos P1, P2 y P3, respectivamente (Tabla 2). El tiempo de residencia hidráulico (TRH) del digestor fue 20, 30 y 24 días para cada período, con un valor medio entre febrero y septiembre fue 24 días. Junto con la  variación del  caudal de  fangos,  también  se  registró una  variación en  la  concentración de materia  orgánica  de  dicha  corriente,  lo  que  en  conjunto  hizo  que  la  velocidad  de  carga orgánica  (VCO) del digestor  fuese 1,05 – 0,75 – 1,08 kgSV/m3∙d en  los períodos P1, P2 y P3, respectivamente (Tabla 2). En  la Figura 1 se muestra el seguimiento del TRH, de  la VCO y del caudal de biogás producido entre febrero‐septiembre de 2011. 

Además del caudal de biogás  (cuyo contenido en metano era 66% v/v), se han calculado  los parámetros de control: degradación de materia orgánica y productividades específicas de gas. En  la Tabla 3 se  recogen estos parámetros: cabe destacar que  tanto el  rendimiento como  la degradación en el digestor aumenta en el P2 en comparación con el P1, tras la disminución de la VCO y el aumento del TRH. Por otro lado, también se realizó el seguimiento en planta de la alcalinidad y del ratio de alcalinidades (RA). Dado que  la alcalinidad  intermedia y el RA (Tabla 3)  indican que no hubo acumulación de compuestos  intermedios  (ácidos grasos volátiles) en ninguno de  los períodos, el aumento del rendimiento podría relacionarse con el aumento de los microorganismos metanogénicos.  

Tabla 2. Parámetros de operación   días  m3/d  d  g/kg  kgSV/m3d 

períodos  intervalo  Q fango  TRH  SV  VCO 

P1  6‐95  200±61  20±4  17±1,16  1,05±0,29 

P2  95‐156  133±41  30±7  19±3,21  0,75±0,23 

P3  156‐218  176±55  24±5  21±2,32  1,08±0,38 

 

Tabla 3. Parámetros de control 

  m3/d  m3/m3d  m3/m3d  m3CH4/kgSV  m3CH4/t  %SV in  mgCaCO3/L  g/g  

períodos  Q biogás  Pv‐biogás  Pv‐CH4  Pm‐CH4  degradación Alc int  RA 

P1  1.401  0,40  0,24  0,32  4,46  34%  58  0,06 

P2  1.405  0,43  0,29  0,38  9,38  42%  54  0,05 

P3  1.061  0,36  0,23  0,24  5,11  42%  49  0,05 

 Figura 1. Seguimiento de los parámetros de operación: promedios semanales de la velocidad de carga orgánica (VCO; kgSV/m3d), el caudal de biogás (Qbg; m3/d) y el tiempo de residencia hidráulico (TRH; 

días).  

4. Resultados microbiológicos 

En conjunto,  los resultados de  la microbiota presentan una dinámica poco variable (Tabla 4): se presentan  los  resultados obtenidos  respecto  a  grupos de protozoos, metazoos, bacterias filamentosas y viabilidad celular. Se constata una concentración de estructuras como los tubos cribosos o polen de pino, que se acumulan con el tiempo, en el digestor pues en el fango activo se detectan en menor abundancia o no se detectan al estar por debajo del límite de detección.  

Es de interés constatar que se llegan a identificar grupos de protozoos y metazoos procedentes del  fango  activo  en  estado  de  latencia  o  cadáveres:  distintos  grupos  de  rotíferos,  ciliados peritricos  (quistes  o  pedúnculos)  y  tecas  de  tecamebas  de  los  géneros  Euglypha,  Arcella, Pyxidicula  o  Centropyxis.  El  conjunto  de  protozoos  y metazoos  identificados  indican  que  el fango origen  tenía un buen  rendimiento  y buena nitrificación.  Esta  apreciación  se  confirmó mediante  la  observación  microscópica  de  los  fangos  activos  a  partir  del  7/abril  y  con  la obtención de los análisis fisicoquímicos. Los fangos activos presentaron una elevada diversidad de grupos de microfauna, entre  los que destacan  las tecamebas Euglypha y Centropyxis, y  los ciliados  Trochilia minuta  y  Epistylis  plicatilis,  indicadores  de muy  buenos  rendimientos  de eliminación de DBO y de eliminación de nitrógeno.  

La  acumulación  de  estructuras,  quistes  y  tecas  en  el  digestor  es  el  resultado  de  la concentración del fango. Al comparar las muestras tomadas en el digestor, teniendo en cuenta la edad del fango en el digestor durante el período de estudio, que fué mayor a 15 dias,  con las  del  fango  activo  del muestreo  anterior,  se  obtuvo  una  correlación  de  la  abundancia  de tecas de la tecameba Arcella con un resultado estadísticamente significativo y muy elevado de r=0.9614 (R2=0.9243). Se obtiene que  las tecamebas se concentraron 8  ‐ 10 veces más en el digestor que  en  el  fango  activo.  Estos  resultados dan una  idea de  la permanencia de  estas tecas en el sistema, a la vez que aportan información sobre su baja biodegradabilidad.  

0

400

800

1.200

1.600

2.000

2.400

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

0 50 100 150 200 250

Qbiogas (m3/d)

VCO (kgSV/m3d

)

días

VCOin vco‐teor Qbg

0

20

40

60

0 50 100 150 200 250

TRH (d)

días

TRH‐prQin_Qef TRH teórico muestras

P1 P2 P3

P1 P2 P3

promedio std promedio stdMICROOR. FILAMENTOSOS, m/mlMicroor. Filamentosos Totales, m/ml 130 249,8 360 285,6

Microthrix parvicella 77 194,6 142 179,3Nocardioformes ( ACNO) 4 11,0 0 0,0Nostocoida limicola 3 2,3 30 30,7Tipo 0041 16 9,2 3 9,9

Espirilos, en  ind/ml 400 1200,0 0 0,0

Espiroquetas, en  m/ml 15 37,8 0 0,0

PROTOZOOS FLAGELADOS, ind./mlBodónidos 81923 83005,5 0 0,0

Otros flagelados 2286 6858,7 0 0,0

Peranema 692 605,2 0 0,0

Entosiphon 83 114,7 0 0,0

Petalomonas 4 13,3 0 0,0

Diplomonadinos (trepomonas) 0 0,0 1429 4949,8

PROTOZOOS RIZÓPODOS, ind./mlGimnamebas< 20  μm 6668 16003,6 289* 989,0

Gimnamebas entre 20 y 50  μm 402 437,8 13* 46,2

Gimnamebas > 50  μm 123 217,1 0 0,0

Tecamebas  10692 13325,0 21440* 24899,1

Euglypha 12 22,4 72* 108,4

Arcella 300 323,0 2022* 1419,6

Centropyxis 62 75,8 57* 87,4

Pyxidicula 10318 13102,0 19290* 24062,3

PROTOZOOS CILIADOS, ind./mlAmphileptus sp 9 17,6 0 0,0Acineria uncinata 40 72,1 0 0,0Aspidisca cicada 191 342,1 0 0,0Acineta tuberosa 57 51,3 2 5,8Calyptotrica lanuginosa 16 34,3 0 0,0Chaetospira muelleri 82 128,6 242* 228,7Chilodonella uncinata 84 195,1 0 0,0Coleps hirtus 73 115,0 0 0,0

Discophrya elongata 2 6,7 0 0,0Gastronauta membranaceus 116 346,7 0 0,0

Epistylis chrysemydis (balatonica) 227 327,0 3 11,5Epistylis plicatilis 142 306,7 0 0,0

Holophrya discolor 39 58,5 0 0,0

Litonotus lamella 13 28,3 0 0,0Metacystis sp. 7 20,0 3 11,5Plagiocampa rouxi 93 210,5 0 0,0Pseudochilodonopsis fluviatilis 102 167,8 0 0,0Pseudovorticella 4 13,3 0 0,0Tokophrya quadripartita 8 15,3 0 0,0

Tokophrya sp 16 27,9 0 0,0Trochilia minuta 50 86,3 0 0,0Uronema  nigricans 4 8,8 0 0,0Vorticella aquadulcis 398 1038,6 0 0,0Vorticella sp. 91 117,1 0 0,0

CILIADOS TOTALES 1903 1878,6 277* 280,5

DIVERSITDAD CILIADOS, bits/ind 2,28 0,54 0 0,00

METAZOOS, ind./mlRotíferos 616 559,8 450 289,7

Lecanidae 220 219,3 105* 133,0

Philodinidae 239 232,5 23* 39,8

Huevos rotíferos 157 179,1 321 181,4

Nematodos 9 17,6 12* 24,8

Gastrotricos 410 511,5 0 0,0

Otras estructurasPolen de pino 7 10,0 88 90,0

Restos vegetales (Tubos cribosos) 20 24,5 212 245,8

Otros quistes 18 53,3 18 37,6

AERÓBICO DIGESTOR

Tabla 4.   Microorganismos  filamentosos,   microfauna restos y hallados en  los  fangos activos y en el digestor. Los hallados en el digestor se consideran restos, cadáveres (*) o algunos quistes de los cuales sólo un porcentaje bajo fueron viables.  En el digestor sólo los flagelados diplomonadinos se hallaron vivos en un recuento. 

 

Dentro del digestor, los protozoos o metazoos hallados aparecían inactivos, en forma de quiste o huevo, sin poder determinar su viabilidad. El análisis de live/dead indica que algunos quistes y huevos podrían ser viables, aunque este dato sólo puede ser verificado mediante cultivos. Los primeros  resultados de cultivos muestran  la viabilidad de algunos gastrotricos y algunos ciliados. Tan  solo en el muestreo del 18/marzo  (primera mitad del P1),  se hallaron distintos grupos  de  protozoos  del  grupo  de  los  flagelados  diplomonadinos  vivos  y  activos  con movimiento en muy baja  concentración, pertenecientes por  lo menos a 2 especies distintas afines al género Trepomonas. Este grupo de  flagelados mayoritariamente son anaeróbicos, y por consiguiente podrían formar parte del proceso de la digestión anaerobia. 

Las bacterias filamentosas en el digestor, y en todas la muestras hasta abril (primera mitad del P1), parecen  indicar que  la bacteria predominante  se  trata de Microthrix parvicella, bacteria normalmente  Neisser  positiva.  En  segundo  lugar,  se  observaron  grupos  de  Nostocoida, claramente  Neisser  positivo.  Gracias  a  las muestras  de  fangos  activos  se  ha  confirmado  la presencia y dominancia de Microthrix, así como la presencia de Nostocoida. De todos modos, Nostocoida aparece en una proporción mucho menor en el fango activo que en el digestor, de modo que este grupo parece resistir mejor en el digestor que Microthrix (inicio del P2), ya que éste  aparece  en  el  digestor  muy  troceado  y  prácticamente  inviable.  A  partir  de  mayo, Microthrix va desapareciendo en el tanque aeróbico y es sucedido por el tipo 0041, aunque no se observan niveles de abundancia elevados. 

Respecto a  los procariotas, se determinó  la abundancia de células viables mediante  live/dead (Figura 2), que aparecen troceadas o en  largas cadenas, es decir, son  inviables y por  lo tanto, se encuentran en proceso de digestión. Las bacterias filamentosas sobreviven un cierto tiempo en el digestor y a medida que van muriendo  las células, el  filamento  se va acortando. En  la Figura 3  se observa una gran variación del  contenido de bacterias  filamentosas del digestor precedido por una reducción previa en el fango activo, aproximadamente con un  importante desfase. En cuanto a la abundancia de bacterias filamentosas, se compararon las muestras del digestor con las muestras anteriores del fango activo entre mayo y julio (período P2).  A partir de  estos  datos  se  realizó  un  análisis  simple  de  regresión  lineal  con  un  resultado estadísticamente significativo y también muy elevado de r=0.973 (R2=0.945). La concentración de bacterias filamentosas fue 6  ‐ 7 veces mayor en el digestor que en el fango activo,  lo que supone, comparado con  las tecamebas Arcella, una menor concentración durante el paso del fango al digestor. Por lo tanto, el contenido en filamentosas procede del tratamiento aeróbico y durante la digestión se van troceando paulatinamente. Si se toma como referencia la Arcella, se  puede  decir  que  permanecen  en  el  sistema  el  70%  de  los  organismos  filamentosos, filamentos que sí pueden contribuir al origen de espumas. También es importante señalar que el TRH medio no es suficiente para la degradación de las paredes celulares de dichas bacterias filamentosas. 

En relación con  la viabilidad celular, se constata que hay una gran variación de viabilidad en procariotas, normalmente en agregados celulares, en las muestras analizadas: desde el 95% de células  viables  (período  P2  ‐7/abril)  al  20%  (período  P3  ‐21/septiembre).  El  cálculo  de  las bacterias viables se realizó a partir del porcentaje de viabilidad aplicado a los sólidos volátiles del digestor:   Bacterias viables = [(viabilidad celular;  %)/100) ∙ (SSV; digestor kg/m3)] 

Estosrelacilos 10empl

 

Fig(izqu

Figu

s  resultados ión positiva 0 últimos díaeada de live/

ura 2. Epifluoierda) Fango 

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Organism

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están  relacentre la canas (Figura 4)/dead es sem

orescencia en activo; (derec

ración de la d

gura 4. Relaci

0

100

200

300

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25-2 18-3

Organism

os filamen

tosos m

/ml

0,0

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0 20

Bacterias v

iables en kg ssv/ m

3

cionados  contidad de bac). Esta relacimicuantitativ

los flóculos ycha) Digestor 

dinámica de lo

ión viabilidad

24-3 7-4

y = 0,0069x

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00 400 600

n  la  actividacterias viableón se puedeva. 

 

y bacterias filar (04/05/2011

 

os microorganconjuntos.

d celular y pro

Microorganismos filam

3-5 16-5 25-

Días

x ‐ 2,0119

,6527

800 1.000 1

Biogas m3/dia

ad  del  digeses y la produe considerar 

amentosas de1). Notación: e

nismos filame

oducción prom

mentosos

-5 8-6 22-6

.200 1.400 1.600

stor,  ya  queucción de biomuy elevad

etectadas meden verde vivos

entosos duran

medio de biog

12-7 8-9

Digestor, m/mlArerobico m/ml

1.800 2.000

e  se  obtieneogás promedda, pues  la té

diante live/des y naranja mu

 nte los muest

 gás 

21-9

e  una dio de écnica 

ead: uertos 

reos 

 

En  la Tabla 5 se presentan  los resultados de PCR cuantitativa correspondientes al análisis del ratio entre arqueas metanogénicas y eubacterias totales.  Si se comparan los resultados de los análisis microbiológicos (Tabla 5) en relación con  los parámetros de operación y control de  la planta,  se observa que durante el período P1, en el que  se mantuvo un TRH de 20 días,  se observa que el ratio arqueas/eubacterias oscila entre 2,1‐5,5% aunque con una tendencia a la baja al final del período (Figura 5). Este descenso se puede relacionar con el descenso del TRH y el aumento de la VCO al final del P1.  

 

Por  otro  lado,  el  incremento  del  ratio  arqueas/eubacterias  durante  el  P2  indicaría  que  las condiciones  de  operación  en  esta  fase  han  sido,  en  general, más  favorables  para  que  se produzca este enriquecimiento: el aumento del TRH hasta 30 días favorece la reproducción de las poblaciones metanogénicas, y por  tanto, aumenta el  ratio arqueas/eubacterias. Por otro lado,  es  importante  recalcar  que  el  aumento  relativo  de  la  abundancia  de  arqueas metanogénicos observado en el P2 coincide con una mayor rendimiento en  la producción de metano (Figura 5). 

Las últimas muestras se corresponden con el período P3, pero fueron tomadas tras una bajada abrupta  de  la  VCO.  Esta  anomalía  produce  una  caída  del  ratio  arqueas/eubacterias, coincidiendo  con  una  punta muy  elevada  en  el  tiempo  de  retención  hidráulico  durante  el período P3.  

 

 

Tabla 5. Relación entre el número de copias génicas del gen mcrA (arqueas metanogénicos) y el gen 16S rRNA (eubacterias) en diferentes muestras de biomasa del digestor. 

 Fecha  Reactor anaerobio  Períodos  Ratio mcrA/16S rRNA (%) 

24/02/2011  M896  Período P1 (6‐95d)  4,60% 17/03/2011  M897  5,36% 07/04/2011  M903  2,50% 03/05/2011  M1118  2,12% 16/05/2011  M1241  4,49% 25/05/2011  M1243  Período P2 (95‐156d)  1,56% 08/06/2011  M1119  3,34% 22/06/2011  M1263  4,32% 12/07/2011  M1239  10,43% 08/09/2011  M1261  Período P3 (156‐218d)  6,30% 22/09/2011  M1265  7,66% 

  

Figdigest

5 Podedigesestánviabilactivorelaciabuncon sensi

El anarquedel  dpermactuacaracde arlas eslo  quComoherra

gura 5. Seguimtor: (superior

 5. Observac

mos  conclustor, con excn  realizando lidad de alguos  nos  permionar éstos dancia de lalas  del  digblemente.  

álisis molecueas metagéndigestor,  en miten  detectalidad,  se  ecterización curqueas medispecies de bue  va  a  cono se apreciaamienta de d

miento de lasr) ratio arquea

ciones finale

ir  que  no  sepción de uestudios  de

unos. El anámite  conocecon el  tiemps bacterias fgestor,  don

ular de  las pnicas y eubaespecial  de ar  la  biomaestán  compualitativa deante  la técnacterias y artribuir  nota, estas metodiagnóstico c

0

2

4

6

8

10

12

0

RATIO mcrA/16SrRN

A

poblaciones as metanogén

es 

e  detecta  lan muestreo e  viabilidad lisis de  los reer  la  capacipo de  retenfilamentosasde  se  conc

poblaciones cterias totalla  producciasa  activa  yletando  este la estructurica del DGGrqueas que sblemente  a odologías puomplementa

R² = 0,3851

50

P1

 microbianas nicos/eubacte

ratio. 

a  presencia donde se hade  huevos estos de micidad  de  conción  celular s procedentecentran.  Sin

microbianases, aportan ión  de metay  relacionartos  ensayosra y biodiverE. Estos resuson dominanla  interpret

ueden ser deario sobre el

R² = 0,91

100

días

P2 P3

en relación a erias totales (

de  protozoallaron flagely  quistes  dcroorganismncentración del digesto

es del fango an  embargo, 

s del digestoinformaciónano.  Así misrla  con  la  p  cuantitativrsidad de lasultados futurntes en cadatación  del  ce gran utilid estado de b

159

150 20

mes

la producción(inferior) evol

os  y metazolados en bajadel  digestor, os procedendel  fango r. Se observactivo está ese  trocea

r, y en espe valiosa sobmo  las  técnproducción  dvos  conjuntapoblacionesros van a pe una de las fomportamiead a nivel pbiomasa anae

00 250

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n de metano lución tempo

oos  activos a abundanci  observándontes de  los fen  el  digesva  también qen relación dn  y  se  red

ecial el ratio bre el rendimnicas  de  live/de  biogás. amente  cons de eubacteermitir deterfases del proento  del  digpráctico comerobia.  

del ral del 

en  el as. Se ose  la fangos stor  y que  la directa ducen 

entre miento /dead En  la n  una erias y rminar oceso, gestor. o una 

 Agradecimientos  El estudio se ha realizado en colaboración con ACCIONA AGUA.  Queremos agradecer a la Dra Rosa Araujo y Tarik   Abzazou   del Departamento de microbiología, Universitat de Barcelona por su contribución en la implantación de la técnica de live/dead. 

  

 REFERENCES • Curds, C. R. 1992. Protozoa and the water industry.  Cambridge University Press. Cambridge 

122pp.  • Foissner  W.,  Berger  H.,  Blatterer  H.,  &  Kohmann  F.  (1991‐1995).  Taxonomische  un 

ökologische  revision  der  ciliaten  des  saprobiensysstems.  Band  I,  II,  III,  IV. Informationsberichte  des  Bayerischen  Landesamtes  für  Wasserwirtschaft.  Munchen, Germany. 

• Eikelboom,  D.  H.  2000.  Process  control  of  activated  sludge  plants  by  microscopìc investigation. IWA publishing 156pp 

• Jenkins,  D.,  Richard, M.G.  &  Daigger,  G.T.  2004.   Manual  on  the  causes  and  control  of activated  sludge  bulking  and  foaming  and  other  separation  problems.  IWA  Publishing. 193pp.  

• Koste W.  (1978) Rotatoria. DieRädertiere Mitteleuropas. Ein Bsetimmungswerk, begründet von Max Voigt. Überordnung Nonogononta. 2 Vols. Bonrtraeger, Stuttgart. 

• Lee J.J. Leedale G.F. & Bradbury P. Eds. 2000. An illustrated guide to the protozoa, 2n Ed, Dos volumenes I: 1‐689; II: 690‐1432. 

• Salvadó H. 1990. Método   rápido   para el control del Bulking, técnica   simple   y   rápida   de  contaje de microorganismos  filamentosos.  Tecnología del Agua. 67: 60‐63. 

• Palatsi  J.,  Illa  J., Prenafeta‐Boldú F. X., Laureni M., Fernandez B., Angelidaki  I., & Flotats X., (2010).  Long‐chain  fatty acids  inhibition and adaptation process  in anaerobic  thermophilic digestion:  Batch  tests,  microbial  community  structure  and  mathematical  modelling. Bioresource Technology 101:2243‐2251.