Aplicación de enzimas en química analítica y aprovechamiento

de residuos

Procesos de Química Sostenible utilizando enzimas

como  catalizadores

Curso PosgradoCiencias y Tecnologías Químicas

Curso Posgrado 2012

AA BB

CC DD

A’’A’’

CC DD

A’’’A’’’A’A’

BB

pH 7.0pH 7.0

1 atmmedio acuosoTª

ambiente

UNA ÚNICA MODIFICACIÓN DE UN ÚNICO SUBSTRATO

EN UNA MEZCLA MUY COMPLEJA DE SUBSTANCIAS QUÍMICAS SIMILARES

QUÍMICA ANALÍTICA

UTILIZACIÓN DE ENZIMAS EN QUIMICA ANALÍTICA

Curso Posgrado 2012

Necesidad de enzimas puras para evitar reacciones laterales

Enzimas estables

Inmovilizadas para poder ser reutilizadas

UTILIZACIÓN DE ENZIMAS EN QUÍMICA ANALÍTICA

Contaminante + B, C, D, E …

Producto

Ríos y océanosTanques de reacciónEfluentes industrialesToxinas ambientales ………………………

DETECCIÓN DE CONTAMINANTESMEDIANTE CATALIZADORES MUY ESPECIFICOS (ENZIMAS, ETC)

Detección

Curso Posgrado 2012

Curso Posgrado 2012

A, B, CD, E, F...

A’, B, CD, E, F...

EnzimaInmovilizada

Calorimetro

En2A A’ Calor+

continuo

pulso

ENZIMAS EN ANALISIS: BIOSENSORES, TERMISTOR

Analytica Chimica Acta. 2007. 599, 7-15

+

Creatinina : detección de fallos renales

metil-hidantoína

Detecciónpotenciométrica

NH3N NH

O

O

N NH

O

NH

CREATININA IMINOHIDROLASA

Curso Posgrado 2012

Biosensors and Bioelectronics. 2007. 23, 400-406

Muestra

Detector

BIODETECCIÓN DE ORGANOFOSFORADOS

Butiril-colinesterasa inmovilizada

-ON+

O

O

P

OO

O

Paraoxon

Curso Posgrado 2012

Curso Posgrado 2012

NH

OP

O

O

O

NH

O

3-indoxil fosfato Azul indigo

Ag+ Ag0

Fosfatasaalcalina

Oxidación

DETECCIÓN DE FOSFATASA ALCALINA

H

NH

HN

O

O

Proceso enzimático: Glucosa + Ferricianuro → Ácido glucónico + Ferrocianuro

Proceso faradaico: Ferrocianuro → Ferricianuro + 1 e–

Uso de GOX como enzima

Proceso enzimático: Glucosa + Mediador ox

→ Glucolactona + Mediador red

Proceso faradaico: Mediador red

→ Mediador ox

+ 1 e–

Usando GDH como enzima

Curso Posgrado 2012

ELECTRODO DE MEDIDA DE GLUCOSA

Curso Posgrado 2012

ELECTRODO DE MEDIDA DE GLUCOSA

Curso Posgrado 2012

S SS SS S

CH1

VH

VL

CL

CH 2

CH 3

Región Fc

Región Fab

Cadena pesada (H)Cadena ligera (L)Zona reconocimiento antígeno Cadena de polisacáridos

V: región variableC: región constante

Amino terminal

ESTRUCTURA DE ANTICUERPOS

Esquema elisa

Curso Posgrado 2012

Curso Posgrado 2012

APLICACIONES BIOTECNOLAPLICACIONES BIOTECNOLÓÓGICAS DE LOS GICAS DE LOS  ANTICUERPOS INMOVILIZADOSANTICUERPOS INMOVILIZADOS

Cromatografía de inmunoafinidad.

Detección de trazas de toxinas, proteínas y patógenos con nanopartículas 

magnéticas.

Detección “on‐line”

con nanotubos de carbono.

nanotubo

Test ELISA en placas multipocillo.

Curso Posgrado 2012

CROMATOGRAFCROMATOGRAFÍÍA DE INMUNOAFINIDADA DE INMUNOAFINIDAD

Adsorción selectiva (purificación) de proteínas.

Inmovilización de enzimas industriales.

Estabilización de enzimas industriales.

Orientación correcta + superficie inerte

Curso Posgrado 2012

CONCENTRACICONCENTRACIÓÓN Y PURIFICACIN Y PURIFICACIÓÓN DE N DE TRAZAS DE TOXINAS, PROTETRAZAS DE TOXINAS, PROTEÍÍNAS, PATNAS, PATÓÓGENOSGENOS

Anticuerpos inmovilizados sobre nanopartículas magnéticas.

Orientación correcta + superficie inerte

E F

Anticuerpo marcado bien con:‐ enzima‐ fluoróforo

Curso Posgrado 2012

DETECCIDETECCIÓÓN N ““ONON‐‐LINELINE””

DE PATDE PATÓÓGENOSGENOS(NANOTUBOS DE CARBONO, CNT)(NANOTUBOS DE CARBONO, CNT)

DEFINICIÓN NANOTUBOS: hojas de átomos de carbono con forma de cilindro y diámetro 

nanométrico.

Son SEMICONDUCTORES: la intensidad de señal varía cuando hay moléculas adsorbidas.

Orientación correcta + superficie inerte

Mejor señal

nanotubo

“Debye length”~ 3 nm

Sin adsorciones inespecíficas

Curso Posgrado 2012

INMOVILIZACIINMOVILIZACIÓÓN AL AZAR N AL AZAR SOBRE SUPERFICIES NO INERTESSOBRE SUPERFICIES NO INERTES

Menor sensibilidad del sistema  posibilidad de adsorciones inespecíficas.

Adsorción lenta del antígeno  porque las regiones Fab del anticuerpo pueden 

estar bloqueadas.

Serían necesarias incubaciones largas del antígeno que pueden derivar en 

problemas de adsorciones inespecíficas.

Podría ser adecuado para la detección de toxinas pequeñas, no tanto para 

proteínas mayores.

Curso Posgrado 2012

INMOVILIZACIINMOVILIZACIÓÓN ORIENTADA N ORIENTADA SOBRE SUPERFICIES INERTESSOBRE SUPERFICIES INERTES

Adsorción específica de proteínas grandes.

Procesos de concentración de trazas.

Permite escoger la orientación del anticuerpo en función de la aplicación 

deseada.

NANOPARTÍCULASCROMATOGRAFÍA INMUNOAFINIDAD

ELISAZona Fab expuesta

NANOTUBOSAnticuerpo muy cercano al soporte

Curso Posgrado 2012

prostate specific antigen

Curso Posgrado 2012

PSA total(tPSA) y PSA libre (fPSA).

Curso Posgrado 2012

Curso Posgrado 2012 Sondas adn esquema

Genosensor para la detección del virus del SARS (Severe Acute Respiratory Syndrome)

Curso Posgrado 2012

Biosensor

Curso Posgrado 2012

Curso Posgrado 2012

Nuevos materiales para biosensores.

A) SWCNT; B) MWCNT

Curso Posgrado 2012

OligosOligosdianadiana

OligosOligosno complementariosno complementarios

Muestra (1ml)Muestra (1ml)

++

Oligo sonda inmovilizadoOligo sonda inmovilizadosobre partsobre partíículas magnculas magnééticasticas

HibridaciHibridacióónn

GeneradorGeneradorcampocampo

magnmagnééticoticolavadoslavados

(10(10μμl)l)

PCRPCR InmunodetecciInmunodeteccióónn

Curso Posgrado 2012

Curso Posgrado 2012

UTILIZACIÓN DE ENZIMAS PARA EL APROVECHAMIENTO DE RESIDUOS

aceite proteínas

aceite Proteínasdesnaturalizadas

ExtracciExtraccióón con hexanon con hexano

Curso Posgrado 2012

APROVECHAMIENTO DE RESIDUOS EN LA INDUSTRIA AGROALIMENTARIA

Proteínas Desnaturalizadas

Oligopéptidos bioactivos

Hidrólisis catalizada porproteasas muy selectivas inmovilizadas y estabilizadas

APROVECHAMIENTO DE RESÍDUOS PROTEICOS

Karayaniddou A. 2007Limited proteolysis as a tool for the improvement of the functionality of sunflower (Helianthus annus L.) protein isolates produced by seeds or industrial by-products (solvent cake)Food Chemistry 104 (4), 1728-173

Conde et al, 2005Effect of enzymatic treatment of extracted sunflower proteins on solubility, amino acid composition, and surface activityJournal of Agricultural and Food Chemistry 53 (20), pp. 8038-8045

Curso Posgrado 2012

Digestión con tripsina

Digestión con quimotripsina

Hidrólisis con carboxipeptidasa A

Oligo-péptidos libres de aromáticos

ArgArg LysLys

ArAr ArgArg ArAr LysLys

LysLysArgArg Ar

HIDRÓLISIS A MEDIDA DE PROTEÍNAS DESNATURALIZADAS

Curso Posgrado 2012

BIO-REFINERÍA: APROVECHAMIENTO DE BIOMASA

Residuos agrícolas

Compuestos alto valor añadidoCerasEsteroles Alcanos Ácidos grasos

………

Extracción

Lignocelulosa

Celulosa/hemicelulosa >> GLUCOSA Lignina

Biomateriales

PapelPlásticos

Moléculasprecursoras

SuccínicoÁcido láctico

Biocombustibles

Bioetanol GasBiodiesel

CompuestosOrgánicos

Vainillas AromáticosDerivados

Bioenergía

Calor Bio-oil

Clark et al, 2006. Green Chem. 8, 853-60

scCO2

APROVECHAMIENTO INTEGRAL DE MATERIAS PRIMAS RENOVABLES

Curso Posgrado 2012

LA BIOREFINERÍA Y LA NECESIDAD DE TODO TIPO DE CATALIZADORES

CELULOSA

celulasas, catalizadores ácidos ……………glucosa

GLUCOSA

fermentación……..etanolbiocatalizadores…(células)….succínicobiocatalizadores…(enzimas) ….. Glucónico, sorbitol, manitol catalizadores metálicos, Au, Pd y Rh…

hidrogeno, intermedioscatalizadores ácidos (zeolita Y)…. Furfural, alcanos

LIGNINA

Peroxidasas, lacasa y polifenol oxidasasFeCl3

…………………………aroma de vainilla

Clark et al, 2006. Green chem. 8, 853-60

Huber y Dumesic. 2006. Catal. Today. 11, 119-132

Petrus y Noordermeer. 2006. Green Chem. 8, 861-867

Curso Posgrado 2012

OBTENCIÓN DE GLUCOSA POR HIDRÓLISIS DE POLÍMEROS NATURALES

Celulosa

Glucosa Necesidad de nuevas celulasas establesbaratas y activas hacia substratos insolublesBiochem. Engineer. J. 2005. 179-190

Almidón

O

CH2OH

OH

OH

O

O

CH2OH

OH

OH

O

O

CH2OH

OH

OH

O O

n

O

CH2OH

OH

OH

OO

CH2OH

OH

OH

OO

CH2OH

OH

OH

O O

n

O

CH2OH

OH

OH

OH

OH

Curso Posgrado 2012

COMPUESTOS QUÍMICOS A PARTIR DE GLUCOSA

Oxidación selectiva a ácido glucónico

1.-

Metales: oro soportado sobre alúminaBaatz et al, 2007 Journal of Catalysis 249 (1), 34-40

2.-

Enzimático: glucosa oxidasa + catalasa Baron et al, 2006, Angew. Che, Int. Engl. Ed. 45 (10), 1572-

1576

OCH2OH

HO

HO

OHOH

Acidulante alimentario, gluconato de calcio y hierro (farmacia),

aditivo para cemento

Curso Posgrado 2012

REDUCCION DE GLUCOSA: SORBITOL Y MANITOLBacterias, metales, enzimas

Hols P. et al 2007High-level production of the low-calorie sugar sorbitol by Lactobacillus plantarum through metabolic engineeringApplied and Environmental Microbiology 73 (6), pp. 1864-1872

Perrard A. et al, 2007 Highly efficient metal catalysts supported on activated carbon cloths: A catalytic application for the hydrogenation of d-glucoseto d-sorbitol

Applied Catalysis A: General 331 (1), pp. 100-104

Ceccaroli et al, 2007Identification and characterization of T. borchii d-mannitol dehydrogenase....Fungal Genetics and Biology 44, 564-

576

OCH2OH

HO

HO

OHOH

Glucosa Fructosa

Manitol

MD

Uso farmacéutico: diurético

Edulcorante bajo en calorías

GI

CH2OH

OHOH

OHCH2OH

COMPUESTOS QUÍMICOS A PARTIR DE GLUCOSA

Curso Posgrado 2012

compuestos de alto valor añadidoGlicerol

1,2 propanodioldihidroxiacetona

células

APROVECHAMIENTO DE GLICEROL

Gatgens C. et al., 2007. Biotransformation of glycerol to dihydroxyacetone by recombinantGluconobacter oxydans DSM 2343

Applied Microbiology and Biotechnology 76 (3), pp. 553-559

Cheng K.K. et al.2007 Pilot-scale production of 1,3-propanediol using Klebsiella pneumoniaeProcess Biochemistry 42 (4), pp. 740-744

Curso Posgrado 2012

OOMe

Catalizador MeOH Bioetanol

O

O

O

O

O

O

Aceites / Grasas

(biodiesel)

+OH

OH

OH

Glicerol

HO OH

OHGlicerol

HO OPO32-

OH

HO OPO32-

O

O

OPO32-

OHDHAP

H

OH

OPO32-

OOH

2-O3POOH

D-fructosa 1,6-difosfato

Gliceril-1-fosfato

Fructosa 1,6-dif osfatoaldolasa

DHAPdeshidrogenasa

Glicer ilquinasa

+

ATP

ADP

Acetatoquinasa

OPO32-

O

OH

O

Gliceraldehido-3-fosfato

gliceraldehidof osfatodeshidrogenasa

NAD+

NADHO2

H2O2

NADH oxidasa

catalasaH2O O2

NAD+

NADH O2

H2O2

NADH oxidasa

catalasaH2O

O2

APROVECHAMIENTO DE GLICEROL

Curso Posgrado 2012

N

NHSOH

Ph

H O

(OH)(H)

HOOH

HO

O

OH

O

O O

CH2OH

OEt

OEt

HOH2C

C OSME T IC SPHARMAC EUT IC AL S

N

NR

H

OH

METHOTRE XATE

APROVECHAMIENTO DE GLICEROL

Curso Posgrado 2012

Curso Posgrado 2012

Sustratos muy baratos

OH

OH

OH

+

O

OH OH

OH

O

O

Glicerol Ácido butirico Producto quirallipasas/PGA

Medio orgánico

1

2

3

Sustratos muy baratos

OH

OH

OH

+

O

OH OH

OH

O

O

Glicerol Ácido butirico Producto quirallipasas/PGA

Medio orgánico

1

2

3

APROVECHAMIENTO DE GLICEROL

Curso Posgrado 2012

HIDROLISIS DE LACTOSA PARA OBTENER AZÚCARES SENCILLOS

Curso Posgrado 2012

SINTESIS DE GALACTOOLIGOSACARIDOS PROCEDENTES DE LACTOSA

O

OH

H

H

HO

H

H

OHH

OH

O

H

O

H

HOH

H

OH

H

OH

O

OH

O

H

HOH

H

OH

H

OH

O

HO

H

HO

H

HO

HO

H

H

OH

n

O

OH

H

H

HO

H

H

OHH

OH

O

H

O

H

HOH

H

OH

H

OH

OH

Lactosa

Reducción enzimática del impacto ambiental de residuos industrialesCurso Posgrado 2012

Las plantas depuradoras pueden no degradar algunos componentes muy tóxicos Se pueden envenenar los lodos activos (bacterias)

Tratamiento previo y local de los efluentes muy tóxicos

Descontaminación ambiental

Curso Posgrado 2012

Kulkami M., & Chaudhari A, 2007Microbial remediation of nitro-aromatic compounds:

An overviewJournal of Environmental Management, 85 (2), 496-512.

Carias C.C., Novais J.M. & Martins-Dias S.2007Phragmites australis peroxidases role in the degradation of an azo dye

Water Science and Technology, 56 (3), 263-269

Rojo de metilo

N

COOH

N N(CH3)2

Hacer bien el ejemplo

Descontaminación ambiental

Peroxidasa y Mn-peroxidasa

Curso Posgrado 2012

CATALISIS Y MEDIO AMBIENTE Degradación de compuestos de vertidos de petróleo

Appl. Microb. Technol. 2007. 76, 1209-21Appl. Microb. Technol. 2007. 76, 1209-21

Fluoranteno

Micobacterium sp extracto KR20Micobacterium sp extracto KR20

O

HOH2C

O

COOH

COOH

CH2COOHCOOH

COOH

COOH

Monooxigenasa

Curso Posgrado 2012

O

O

OO

O

O

Lignino peroxidasaManganeso peroxidasaHemoglobinaCitocromo c

H2

O2

Oxidación biocatalítica de hidrocarburos aromáticos policiclicos por hemoproteínasCurso Posgrado 2012

CH3

NO2

NO2

CH3

NH2

NO2

O

O

NO2

OMe

OMe

NO2

OH

OH

NO2

O

OMe

O

O

OH

O

O

O

OH

OH

OMe

OH

OH

OH

OH

COOHCOOH

O

CO2

Degradación de 2,4-DNT por Phanerochaete chrysosporium

CH3

OH

CH3

OH

CH3

OHNO2

-

NO2-

MnP

MnP

MnP/LiP

LiP

Curso Posgrado 2012

Lignino peroxidasa

Manganeso peroxidasa

Lacasa

Citocromo P450

Veratril alcoholoxidasa

Hongos ligninolíticos

OCH3

OHHO

OLignin

O

OH

OCH3

OHO

HO

O

OH

OH

CH3OO O

HO

OCH3

OHOH

O

CH3OOH

O OH

CH3O

O

O

OCH3OOH

Lignin

OCH3

O

OHHO

OCH3O

OHHO

OCH3

O

CHO

HO

Curso Posgrado 2012

Plaguicidas, un problema ambientalPlaguicidas, un problema ambiental2.5 millones de toneladas usadas anualmente en 19905 millones de intoxicados anuales45,000 muertes anualmente1% de los fallecimientos en los países desarrollados (80% del consumo)20% de los intoxicados mueren en los países subdesarrollados

Curso Posgrado 2012

Terbufos

Phosmet Azinphos methyl

ParathionDEF

NN

N

OCN

C

O

O

PS

CH3O

CH3OCH2P

SCH3O

CH3OS CH2

P

SCH3CH2O

CH3CH2OS CH2 S C(CH3)3

OPS

CH3O

CH3ONO2P

SS

OS

P

SCH3OCH3O

S CCOOCH2CH3

HCOOCH2CH3

Malathion

Plaguicidas organofosforadosPlaguicidas organofosforadosCurso Posgrado 2012

3-M ethylen-4-ketobenzotriazine

PCH3O

CH3OS

S

CH2 N

O

NN

PCH3O

CH3OS

O

CH2 N

O

NN

PCH3O

CH3OS

S

CH2

N

O

NN

CH2

+

+

PCH3O

CH3OS

S

CH2 NC

O

C

O

P

S

SCH3CH2O

CH3CH2OCH2 S C(CH3)3

PCH3O

CH3O

OCHOH

C ClCl

Cl

NC

O

C

O

H

PCH3O

CH3O

S

S CCOOCH2CH3

HC

O

OH

+ PCH3O

CH3OS

S

CH2

P

SCH3CH2O

CH3CH2OSH + S C(CH3)3CH3

PCH3O

CH3O

OC

O

CCl

ClH

Phosmet

M alathion

Terbufos

Trichlorfon

N

O

NN

H

4-Ketobenzotriazine

Azinphos-methyl oxon O,O,S- Trimethyl dithiophosphate

Phthalimide

2,2-Dichloro-1-ketone ethyl,phosphoric acid dimethyl ester

Butanedioic acid,[(dimethoxyphosphinothioyl)]-4-ethyl ester

O,O ,S- Trimethyl dithiophosphate

3,3-Dimethyl-2-thiabutaneD iethyl phosphorodithioic acid

HCOOCH2CH3

COOCH2CH3

CS

S

CH3O

CH3OP

Azinphos-methyl

Productos de la degradación enzimática de plaguicidas organofosforados con

citocromo P450 de Bjerkandera adusta Curso Posgrado 2012

Murexida. Polimetino del grupo deoxonoles.Bixin. Derivadode- caroteno.

Compuestos azo.Compuestos azo.

Polimetinos y polienos.Polimetinos y polienos.

Clasificación de los colorantesClasificación de los colorantesCurso Posgrado 2012

HN

HN

NNH

HN

O

OO OO

O

O2N

CN

N

N

OCH3

N(C2H5)2

H3COCHN

CN

HOOC

COOCH3

Di- y triarilmetanos.Di- y triarilmetanos.

Verde de malaquita (C. I. Verde básico 4)Auramina O (C. I. Amarillo básico 2)

Heterocíclicos nitrados y azufrados.Heterocíclicos nitrados y azufrados.

Amarillo Amido E (C. I. Anaranjado ácido 3) Anaranjado Brillante Dicolita 3G (C. I. Anaranjado azufre condensado 2)

Curso Posgrado 2012

HN

HN

HO2S

O2N

NO2

HO3S

HOOC N N

N

N

HO

CH3

C6H5

Anulenos.Anulenos.

Estructura general de un tetra aza anuleno. Estructura general de un octa aza anuleno.

Antraquinonas.Antraquinonas.

Primer colorante “a la cuba”

basado en antraquinonaIndantrona.

Colorante natural.Indigo.

N

NN

N

M

M = Zn, Cu, Fe

N

N

N

N

N

N

N

M

N

M = Zn, Cu, Fe

NH

HNO

O

O

ONH

HN

O

O

Curso Posgrado 2012

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

350 400 450 500 550 600 650 700 750 800

(nm)

Abs

orba

nce 0 min

2 min

4 min

Decolorization of Reactive blue 198 by purified laccase from C. gallica

Decolorization of Reactive blue 198 by purified Decolorization of Reactive blue 198 by purified laccase from laccase from C. gallicaC. gallica

Curso Posgrado 2012

00.20.40.60.81

1.21.41.61.82

350 450 550 650 750(nm)

Abs

orba

nce Without laccaseUnder N2

Air

Decolorization of Reactive blue 198 by laccase in the presence and in tha absence of oxygen

Decolorization of Reactive blue 198 by laccase in the Decolorization of Reactive blue 198 by laccase in the presence and in tha absence of oxygenpresence and in tha absence of oxygen

Curso Posgrado 2012

(nm)

Abs

orba

ncia

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

350 450 550 650 750

0 min

5 min

Decoloración del azul reactivo 198 con lacasa de C. gallica

Curso Posgrado 2012

0

20

40

60

80

100

0 200 400 600 800 1000

Tiempo (min)

Lacasacontrol

% c

olor

Decoloración del azul reactivo 198 en una columna con lacasa inmovilizada

Reyes et al. 1999 Biotechnol. Lett. 21: 875-880

Curso Posgrado 2012

C42

H30

I4

N14

Na4

O14

S4

0204060

80100120

0 200 400 600 800 1000 1200Time (min)

LaccaseControl

% c

olor

Reyes et al. 1999 Biotechnol. Lett. 21: 875-880

Decolorization of a real industrial effluent by immobilized laccase

Curso Posgrado 2012

N

SN

CH2CH3

HO3S S

NN

CH2CH3

SO3H

NN

N

OH

ABTS HBT

O2

H2

O

Laccase (Cu+)

Laccase (Cu++)

Mediator(Ox)

Mediator(Red)

Substrate

Product

Free Radical MediatorsFree Radical Mediators

Bourbonnais and Paice (1992) Appl. Environ. Biotechnol. 36: 823-827

Curso Posgrado 2012

0

20

40

60

80

100

0 2 4 6 8 10

1 mM HBT

1 mM ABTS

1 mM ABTS + 1 mM HBT

Pickard et al. (1999) Appl. Environ. Microbiol. 65: 3805-3809

Anthracene oxidation by purified laccase

from Coriolopsis gallica

Anthracene oxidation by purified laccase

from Coriolopsis gallica

Time (h)

Ant

hrac

ene

(% re

mai

ning

)

Curso Posgrado 2012