APISISTEMA DE IDENTIFICACION DE MICROORGANISMOS

CLINICA Y APLICACIN INDUSTRIALAPI 20 E es un sistema para la identificacin de las Enterobacterias y otros bacilos Gramnegativos no exigentes que utiliza 23 test bioqumicos estandarizados y miniaturizados, y una base de datos.

PRINCIPIOAPI 20 E consta de 20 microtubulos conteniendo substratos deshidratados. Estos test se inoculan con una suspensin bacteriana la cual hidrata el medio. Durante la incubacin, se producen cambios de color espontneos o revelados por adicin de reactivos.

La lectura de las reacciones se hace de acuerdo con la Tabla de lectura y la identificacin mediante el API20E Index o el Programa informtico para la identificacin.

LECTURA API 20 E

LECTURA API 20 E

LECTURA API 20 E

LECTURA API 20 E

LECTURA API 20 E

LECTURA API 20 E

LECTURA API 20 E

Orto-Nitrofenil--galactopiransido ONPGINTRODUCCIONEsta prueba se basa en la capacidad que tienen los microorganismos de fermentar la lactosa. Los microorganismos que fermentan la lactosa poseen dos enzimas especficos uno es la lactosa Permeasa que est en la membrana celular y es capaz de transportar la lactosa a travs de la membrana celular. La otra enzima es la B-D-Galactosidasa que est localizado en el interior de la clula y desdobla la lactosa en glucosa y galactosa.Los microorga nismos , segn fermente o no la lactosa, se pueden clasificar en :Fermentadores activos de lactosa en 24 horas, los cuales poseen ambas enzimas.No fermentadores de lactosa, carecen de ambas enzimas, no degradan la lactosa, no penetra en la clula la lactosa.Fermentadores tardos de lactosa, poseen la enzima B-D-Galactosidasa son capaces de permeabilizar ligeramente la lactosa con concentraciones altas de lactosa y fermentarla en 2 a 15 das.

Para detectar en los microorganismos la enzima B-D-Galactosidasa se utiliza un compuesto similar a la lactosa, pero en su formula molecular se ha sustituido la glucosa por el Orto-nitrofenol; ste, al liberarse al medio alcalino por accin de la enzima B-D-Galactosidasa, si lo hubiera en el microorganismo, produce un color amarillo.ONPG (+): A los 60 minutos se observa un color amarillo.ONPG (-): No se puede interpretar antes de las 24 horas.

Orto-Nitrofenil--galactopiransido ONPGTECNICA:Preparar una suspensin densa del microorganismo a partir de un cultivo puro en 0.5 ml Solucin Fisolgica. Liberar la B-D-Galactosidasa de las bacterias. Para ello se aade una gota de tolueno a la suspensin y mezclar vigorosamente durante unos segundos.Aadir 0.5 ml de la solucin ONPG, mezclar.Incubar a 37C y leer antes de 24 horas.

REACCION: Orto-Nitrofenil -galactosidasa Galactosa + OrtoniTrofenol -galactopiransido Hidrlisis Amarillo IncoloroDebe utilizarse un inculo concentrado para que exista una concentracin alta de enzima y aumentar la velocidad de reaccin.La solucin de ONPG debe ser incolora y por ello debe prepararse en el momento .La solucin debe guardarse en frascos de color topacio a una temperatura de 4C. pues es fcilmente desestabilizante.Antes de usarse se debe atemperar en un bao a 37C para que se disuelvan los fosfatos que cristalizan durante la conservacin.

DESCARBOXILASA DE MOELLER Lisina Arginina Ornitina La lisina descarboxilasa LDC es la enzima que acta sobre la L-lisina obtenindose cadaverina y CO2.La ornitina descarboxilasa ODC es la enzima que acta sobre la L-ornitina obtenindose putrescina y CO2.La arginina deshidrolasa es la enzima que cataliza una hidrlisis de la L-arginina obtenindose L-citrulina ms amonaco, para posteriormente sufrir una descarboxilacin en la L-citrulina formndose putrescina ms CO2.En todas estas reacciones se desprende CO2 y se alcaliniza el medio.

La liberacin de aminas se evidencia por un color rojo o prpura, en contraste con el color amarillo del control y de los tubos con reacciones negativas.Lisina (+), Arginina (-), Ornitina (+).Las descarboxilasas son enzimas que actan sobre el grupo carboxilo de los aminocidos Lisina, Ornitina, Arginina, para formar aminas y se desprende CO2, este proceso se realiza en anaerobiosis.Cada descarboxilasa acta sobre un aminocido.

Citrato de Simmons C.S.INTRODUCCIONEl citrato de sodio es una sal del cido ctrico, un compuesto simple que constituye uno de los metabolitos del ciclo de Krebs . Algunas bacterias pueden obtener energa por va distinta de la de fermentacin de hidratos de carbono, utilizando citrato como nica fuente de carbono. La determinacin de esta caracterstica importante para la identificacin de muchas enterobacterias.

TECNICA Tomar una colonia bien aislada de la superficie de un medio e inocular en una sola ,estra en el pico del agro citrato e incubar a 37C por 24 - 48 horas.

INTERPRETACIONEl desarrollo de un color azul intenso en 24 a 48 horas indica una prueba positiva y revela que el organismo en estudio ha sido capaz de utilizar el citrato contenido en el medio, con la formacin de productos alcalinos.

Agar S.I.M.

PRODUCCION DE H2SSe evidencia la formacin de cido sulfihidrico por la formacin de un precipitado negro. Esto se logra mediante las siguientes etapas:Liberacin de sulfuro a partir del tiosulfato por accin enzimtica de la bacteria.Acoplamiento del sulfuro (S-2) con el ion hidrogeno (H+) para formar gas H2S.Deteccin del gas H2S mediante sales de metales pesados como hierro, logrando la forma de sulfuro del hierro, que es un precipitado negro.Este medio de cultivo permite comprobar la formacin de sulfuro, la produccin de indol y observar la movilidad.

Agar Urea INTRODUCCIN:Esta prueba detecta la presencia de la enzima ureasa en los microorganismos a travs de una prueba en la que se observa la alcalinizacin del medio.La ureasa cataliza la hidrlisis de la urea dando lugar a carbonato amniaco, con lo que el medio se alcaliniza, a travs del cambio de color del indicador de pH, por accin de la ureasa sobre la urea.REACCION: Urea Ureasa Anhidrido + Amonaco + Carbonatocarbnico amnicoTECNICA:Sembrar, el microorganismo en un tubo con agar urea de Christensen inclinado. Incubar a 37C hasta detectar cambio de color del indicador.INTERPETACIONUrea positiva: color rojo rosado debido al cambio de color del indicador rojo fenol.Urea negativa: No se produce viraje de color.

FENILALANINA DESAMINASAINTRODUCCIONLa fenilalanina es un aminocido que por desaminacin forma un cetocido. El cido fenilpirvico. De las enterobacterias slo los miembros de los grupos Proteusy Providencia poseen la enzima fenilalanina desaminasa, necesaria para esta conversin.PRINCIPIOLa prueba de fenilalanina se basa en la deteccin de cido fenilpirvico en el medio, tras el desarrollo del organismo en estudio. La prueba es positiva si aparece un color verde visible por adicin de una solucin cloruro frrico al 10%.El agar se vuelca en un tubo y se deja solidificar en pico de flauta. No se pueden utilizar extractos de carne ni hidrolizados de protenas debido a su contenido natural variable de fenilalanina. El extracto de levadura sirve como fuente de carbono y nitrgeno.

Al aadir FeCl, un color verde en la superficie del medio, como puede verse en el tubo de la izquierda, indica la presencia de cido fenilpirvico (un producto de degradacin de la fenilalanina del medio) por accin de la fenilalanina desaminasa.

INDOLINTRODUCCION:El indol, un bencilpirrol, es uno de los productos de degradacin metablica del aminocido triptofno. Las bacterias que poseen la enzima triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofno con produccin de indol, cido pirvico y amoniaco. La prueba de indol esta basada en la formacin de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo del p-dimetilaminobenzaldehido. Este es el principio activo del reactivo de Kovac y Erlich. Debe emplearse un medio rico en triptofno.COMPOSICION:REACTIVO DE KOVACAlcohol amlico o isoamlico puro150 mlp-dimetilaminobenzaldehido10 gHCl concentrado50 mlTECNICA:Inocular el caldo peptonado e incubar a 37C por 24 horas. Luego aadir 5 gotas del reactivo por la pared del tubo.INTERPRETACION:Positivo: El desarrollo de un color rojo fucsia en la interfase del reactivo y el caldo, indica la presencia del indol.

Voges Proskauer V.P. INTRODUCCIONEl cido pirvico, componente fundamental formado en la degradacin fermentativa de la glucosa, es metabolizado luego a travs de varias vas, de acuerdo con los sistemas enzimticos que poseen las diferentes bacterias. Una de dichas vas lleva a la produccin de acetona (acetilmetilcarbinol), un subproducto de reaccin neutra de la va Butilenglicol. Los organismos que producen acetona como principal subproducto del metabolismo de la glucosa y forman cantidades menores de cidos mixtos. En presencia de oxgeno atmosfrico e KOH al 40% , la acetoina se convierte en diacetilo y el alfa naftol acta como catalizador para revelar un complejo de color rojo.COMPOSICIONALFA-NAFTOLKOHAlfa naftol5 gKOH40 gAlcohol etlico absoluto100 mlAgua100 mlTECNICAInocular caldo MRVP e incubar a 37C por 24 horas. Luego aadir alfa naftol e KOH al 40%. agitar el tubo y dejarlo en reposo por l0 minutos.INTERPRETACIONPositivo: desarrollo de un color rojo a los l0 minutos, revelando la presencia de diacetilo, producto de oxidacin de la acetona.

Hidrlisis de la GelatinaMedio con gelatina de KohnGelatina nutrienteCarbn inactivado en polvo finoAgua destilada

TRIPLE AZUCAR HIERROT.S.I.

A. INTRODUCCIONLa configuracin del medio en pico de flauta (Pico y Fondo) determina la existencia de 2 compartimientos : - La porcin inclinada, expuesta al oxgeno atmosfrico es aerobia.- La porcin inferior llamada fondo esta protegida del aire y es relativamente anaerobia.La porcin expuesta al oxigeno (INCLINADA), tiende a tornarse alcalina por la descarboxilacin oxidativa de protenas, y se desarrolla un pH alcalino y se vuelve rojo.En el fondo del tubo donde no hay oxgeno , la degradacin proteica es mnima y se pueden detectar incluso pequeas cantidades de cido por la aparicin de un color amarillo.

La produccin de H2S se manifiesta por la produccin de un color negro.La presencia de gas se manifiesta por el resquebrajamiento del medio.La acidez del medio se pone de manifiesto por un color amarillo y se representa por la letra A.La alcalinidad del medio se pone de manifiesto por un color rojo y se representa por la letra K

Manitol SaladoFermentacin del manitolLa fermentacin de manitol es producida por el S. aureus y es til para diferenciarlo del S. epidermidis.La utilizacin del Manitol formando cido es una caracterstica del S. Aureus.Esta propiedad puede evidenciarse convenientemente cultivando el microorganismo sobre un medio de cultivo que involucre manitol.Este medio es selectivo para el Staphylococus debido a la alta concentracin de ClNa 7.5%.El indicador es rojo de Fenol, a pH cido (amarillo) y pH alcalino (Rojo)

Los hidratos de carbono ms utilizados son:GlucosaSacarosaManosaMelibiosaInositolAmgdalianaSorbitolArabinosaRammnosaSe emplea caldo con indicador de pHMetabolismo de los hidratos de carbono son cidos orgnicos

HIDRATOS DE CARBONO

PRUEBA DE LA OXIDASA

A. INTRODUCCIONLa enzima citocromo oxidasa participa en la transferencia de electrones en la cadena respiratoria hacia el oxgeno. O2 -------------H2O O2 -------------H2O2Se detecta oxidasa en los microorganismos aerobios o anaerobios facultativos. Los anaerobios estrictos carecen de ella.Los microorganismos aerobios obtienen su energa por la respiracin y la almacenan en forma de ATP, el oxgeno es reducido a partir de un sustrato orgnico que procede de la nutricin con la intervencin de un sistema de transporte de electrones denominado cadena respiratoria, producindose agua o perxido de hidrogeno segn la especia microbiana.

PRUEBA DE LA OXIDASASe determina a travs de esta prueba la presencia o ausencia de la enzima Citocromo Oxidasa en el microorganismo, el cual cataliza el ltimo paso de transferencia de electrones desde un substrato inorgnico (azcares, polipeptidos, etc) al oxgeno.Para ello se observar el cambio de color de un indicador de pH incoloro cuando est reducido y coloreado cuando se oxida.Entre los indicadore ms utilizados se encuentra la p-fenilendiamina, que por accin de la enzima citocromo oxidasa da un compuesto qumico indofenol que tiene color.

PRUEBA DE LA OXIDASA TECNICA:Se cultiva en una placa petri con agar sangre el microorganismo problema. Los medios que contengan glucosa pueden inducir a falsos resultados negativos debido a que la fermentacin de la glucosa inhibe la actividad de la oxidasa.Sobre una placa petri vaca, colocar un trozo de papel de filtro. La tira de papel de filtro impregnada con el reactivo de Kovacs.Con una asa se toma una colonia de la placa con el cultivo del microorganismo y se extiende en el papel. Se lee el resultado a los 30 a 60 segundos.REACCION: p-fenilendiamina Oxidasa Indofenol coloreado O2 atmosfrico INTERPRETACION Oxidasa (+): aparece un color purpreo en el papel a lo s 30 - 60 seg. Oxidasa (-): No aparece un color.

CALDO NITRATOAGAR NITRATO1. COMPOSICIONPeptona 8.6 gExtracto de carne3 gCloruro de sodio6.4 gPeptona5 gAgua destilada1000 mlNitrato de potasio1 gNitrato de potasio10 gAgar12 gAgua destilada1000 ml

2. DESCRIPCION DEL MEDIOA. Requerimiento energtico:

B. Requerimiento no energtico

C. Segn su proporcin en agua

D. Segn su uso o utilizacin

E. Segn la composicin que presenta

F. Segn su presentacinNITRATO REDUCTASA

REDUCCION DE NITRATOSINTRODUCCINLa capacidad de un organismo para reducir nitratos a nitritos es una caracterstica importante utilizada para la identificacin de especies de muchos microorganismos. Estos microorganismos poseen la enzima nitrato reductasa o nitratasa.Todas la enterobacterias, excepto ciertos biotipos de Enterobacter agglomerans y Erwinia, reducen nitratos.Est presente en algunos microorganismos anaerobios o anaerobios facultativos los cuales utilizan nitrgeno como un ltimo aceptor de electrones en el proceso metabolicoPRINCIPIOLos microorganismos que reducen nitratos tienen la capacidad de obtener oxgeno de los nitratos para formar nitritos y otros productos de reduccin. La ecuacin qumica es:Nitrato (NO3-) +2e- + 2H ----- Nitrito (NO2-) + H2OLa presencia de nitritos en el medio se detecta aadiendo alfa-naftilamina y cido sulfnlico, con la formacin de un colorante rojo de diazonio p-sulfobenceno azo-alfa-naftilamania.

REDUCCION DE NITRATOS

INTERPRETACINEl desarrrollo de un color rojo a los 30 seg de aadir los reactivos indica la presencia de nitritos y representa una reaccin positiva para la reduccin de nitratos.

La ausencia de color tras el agregado de los reactivos puede indicar una reaccin negativa o que han sido reducidos a productos distintos de los nitritos, como amonaco, nitrgeno molecular (desnitrificacin), xido ntrico (NO) u xido nitroso (N2O), e hidroxilamina.La reduccin de nitratos ha sido llevada hasta la formacin de nitrgeno molecular; ste se observa en el interior de la campana de Durham si el medio es lquido o por la aparicin de grietas o burbujas en el caso de que el medio fuera slido.

En caso de ser negativo, debe agregarse una pequea cantidad de zinc. Los iones Zinc reducen los nitratos a nitritos y el desarrollo de un color rojo tras el agregado de Zinc indica la presencia de nitratos residuales y confirma la reaccin negativa.

REDUCCION DE NITRATOSINTERPRETACIN (MEDIO LIQUIDO)Hay tres casos en los que la prueba se considera positiva.Cuando aparece color rojo o rosado al aadir el reactivo A y B indica reduccin de nitratos a nitritos.Cuando aparece gas en la campana de Durham indica reduccin de nitratos a nitrgeno molecular.Cuando al aadir zinc en polvo no se desarrolla color indica formacin de otros productos nitrogenados como: xido ntrico, amonaco, hidroxilamina, etc.La prueba es negativa cuando:Se forma color rojo o rosado al aadir polvo zinc en menos de 30 segundos. No se ha reducido el nitrato. Para comprobarlo se aade polvo de Zinc que acta como reductor y se desencadena la reaccin colorimtrica.

Metodos computarizadosAPIPermite investigar la degradacin de hidratos de carbono, utilizacin de aminocidos, y la presencia de enzimas con lo cual se puede identificar el gnero y la especie.

Metodos computarizadosDADE SCANPermite investigar la degradacin de hidratos de carbono, utilizacin de aminocidos, y la presencia de enzimas con lo cual se puede identificar el gnero y la especie.Adems permite investigar la sensibilidad y resitencia antimicrobiana.