“mecanismos de interacción entre la microcina 24 y su...

UNIVERSIDAD DE CHILE

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS Y FARMACEUTICAS

“Mecanismos de interacción entre la microcina 24 y su célula bacteriana blanco”

Memoria para optar al título de Bioquímico

JOSÉ MIGUEL SAAVEDRA NORIEGA

Santiago de Chile, 2009

Patrocinante. Dra. Daniela Seelenfreund H.

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular,

Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas,

Universidad de Chile

Director. Dr. Gino Corsini A.

Laboratorio de Bacteriología Molecular

Centro de Investigación Biomédica

Facultad de Medicina

Universidad Diego Portales.

Co-Director. Dr. Mario Tello R.

Laboratorio de Compuestos Bioactivos

Departamento de Biología

Facultad de Química y Biología

Universidad de Santiago de Chile

Nothing in the world can take the place of

PERSISTENCE. Talent will not; nothing is more common

than unsuccessful men with talent. Genius will not;

unrewarded genius is almost a proverb. Education will

not; the world is full of educated derelicts.

PERSISTENCE and determination alone are omnipotent.

The slogan “Press On” has solved and always will solve,

all problems

Calvin Coolidge

“Dedicada a todas las personas que

observaron el desarrollo de esta tesis y

para aquellos que contribuyeron…”

Tabla de contenidos i

ÍNDICE DE MATERIAS

Pag

ÍNDICE DE MATERIAS i

ÍNDICE DE FIGURAS iv

ÍNDICE DE TABLAS v

ABREVIATURAS vi

RESUMEN vii

ABSTRACT x

1. INTRODUCCIÓN 1

1.1. Clasificación de Bacteriocinas 1

1.2. Microcinas 2

1.3. Organización génica de las microcinas 3

1.4. Rol de la maquinaria de captura de hierro dependiente de TonB 4

1.5. Receptor de sideróforos hidroxamatos FhuA 6

1.6. Receptores de sideróforos catecólicos FepA, Fiu y Cir 9

1.7. Mecanismos de acción de las microcinas 9

1.7.1. Microcinas bacteriostáticas 9

1.7.2. Microcinas bactericidas 10

1.8. Microcina 24 y su mecanismo de acción 10

2. HIPÓTESIS 13

3. OBJETIVOS 13

4. MATERIALES Y MÉTODOS 14

4.1. Materiales 14

4.1.1. Reactivos 14

4.1.2. Cepas bacterianas 15

4.1.3. Plasmidios 15

4.1.4. Partidores 16

4.2. Métodos 16

4.2.1. Medios de cultivo 16

4.2.2. Purificación de la microcina 24 20

4.2.3. Purificación de microcina 24 mediante HPLC 20

4.3. Ensayo de detección de actividad antimicrobiana en placa 21

4.3.1. Preparación del césped sensible a la microcina 24 21

4.3.2. Detección de la microcina 24 en sobrenadantes de cultivos 21

4.3.3. Detección de la actividad de la microcina 24 purificada 22

4.3.4. Ensayo de actividad antimicrobiana con cepa productora de

microcina 24

22

Tabla de contenidos ii

4.4. Electroforesis de proteínas 22

4.4.1. Electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) para

la microcina 24 22

4.4.2. Marcación y preparación de las proteínas con

fluorescamina para electroforesis en geles de

poliacrilamida 23

4.5. Aislamiento y purificación de ácidos nucleicos 23

4.5.1. Aislamiento de DNA plasmidial bacteriano (miniprep) 23

4.5.2. Aislamiento de RNA bacteriano 24

4.6. Electroforesis de ácidos nucleicos 25

4.6.1. Separación de DNA 25

4.6.2. Separación de RNA 25

4.6.3. Purificación de DNA de un gel de agarosa 26

4.7. Electrotransformación 26

4.7.1. Preparación de células electrocompetentes 26

4.7.2. Transformación por electroporación 26

4.8. Amplificación de fragmentos de DNA por PCR 27

4.8.1. PCR de DNA plasmidial 27

4.8.2. Transcripción inversa acoplada a PCR (RT-PCR) 27

4.8.3. Purificación de productos PCR 28

4.9. Ensayo de actividad β-galactosidasa en bacterias

permeabilizadas 28

4.10. Obtención de la cepa E. coli S100 mutante en fhuCBD 29

4.10.1. Obtención del producto PCR 31

4.10.2. Transformación de la cepa de E. coli BW25113 con el

plasmidio pKD46 31

4.10.3. Transformación de la cepa E. coli BW25113pKD46

con el producto PCR 32

4.11. Análisis de la microcina 24 mediante espectrometría de masa. 32

4.12. Clonamiento en el vector pGEM®

-T easy 32

4.13. Secuenciación del sistema productor de la microcina 24 33

4.14. Ensayo de viabilidad celular mediante fluorescencia 34

4.15. Análisis estadístico 35

5 RESULTADOS 36

5.1. Caracterización del péptido antimicrobiano microcina 24 36

5.1.1.1. La microcina 24 comienza a exportarse en fase exponencial

de crecimiento 36

5.1.1.2. El gen estructural de la microcina 24 y el gen que

codifica para su proteína de inmunidad forman una

unidad transcripcional, que

se expresa en fase exponencial de crecimiento 37

5.1.2. Purificación de la microcina 24 38

Tabla de contenidos iii

5.1.2.1. Purificación mediante cromatografía en columna

hidrofóbica C18

38

5.1.2.2. Purificación de la microcina 24 mediante HPLC 40

5.1.3. Espectrometría de masa de la microcina 24 41

5.1.4. Secuenciación del sistema microcina 24 41

5.1.4.1. Secuenciación del gen mtfS 41

5.1.4.2. Análisis informático del motivo de corte proteolítico de la

microcina 24 42

5.1.4.3. Secuenciación de los genes mdbA, mtfI, mtfA y mtfB 45

5.2. Mecanismo de acción del péptido antimicrobiano

microcina 24 49

5.2.1. La microcina 24 permeabiliza la membrana interna

de las bacterias sensibles 49

5.2.2. La microcina 24 genera disminución del número de

células viables 50

5.2.3. La permeabilización realizada por la microcina 24

genera un gran daño en la membrana citoplasmática 51

5.3. Relación entre el sistema de transporte del ferricromo

hidroxamato y la microcina 24 53

5.3.1. La microcina 24 utiliza el receptor fhuA 53

5.3.2. Participación del sistema FhuCDB 54

5.3.3. Mutaciones en el sistema de transporte del

ferricromo diminuye la acción de la microcina 24 54

5.3.4. Sólo FhuB y FhuD están implicados en el

mecanismo de acción de la microcina 24 56

5.3.5. La complementación de las mutantes revierte el

fenotipo de resistencia a la microcina 24 58

6 DISCUSIÓN 61

6.1 Caracterización del péptido antimicrobiano microcina 24 61

6.2 Mecanismo de acción del péptido antimicrobiano microcina 24 66

7 CONCLUSIONES 72

8 REFERENCIAS 73

Tabla de contenidos iv

INDICE DE FIGURAS

Figura 1 Organización génica de los cluster de genes de las microcinas. 4

Figura 2 Representación en cinta del tapón de FhuA. 7

Figura 3 Cambio conformacional inducido por la unión del ferricromo

hidroxamato. 8

Figura 4 Estrategia para la mutagenesis de los genes cromosomales del

sistema fhu. 30

Figura 5 Producción de microcina 24 durante el crecimiento de E. coli

MC1061pGOB18. 37

Figura 6 Expresión transcripcional de los genes mtfI y mtfS mediante RT-PCR. 38

Figura 7 Purificación de la microcina 24 mediante cromatografía en columna

hidrofóbica Sep-Pak C18. 39

Figura 8 Purificación de la microcina 24 mediante HPLC. 40

Figura 9 Espectrometría de masa MALDI-TOF de la microcina 24. 41

Figura 10 Alineamiento de secuencias publicada en Genbank U47048 y

FJ895580. 43

Figura 11 Análisis de la región próxima al codón de inicio de la traducción de la

microcina 24. 44

Figura 12 Alineamiento múltiple entre secuencias de microcinas tipo II sin

procesar. 44

Figura 13 Alineamiento múltiple entre los dominio peptidasa C39 de las

proteínas exportadoras de las microcinas tipo II. 45

Figura 14 Alineamiento entre las secuencias del gen mdbA y mcnR. 47

Figura 15 Alternativas de traducción de la secuencia mdba y la re-secuenciación

mcnR. 47

Figura 16 Alineamiento entre la proteína McnR y el dominio PRK10947. 48

Figura 17 Ubicación de los motivos de unión de proteínas H-NS sobre el sistema

productor de la microcina 24. 48

Figura 18 Ensayos de permeabilidad de células de E. coli HB101 con

microcina 24. 50

Figura 19 Ensayos de viabilidad Celular. 51

Figura 20 Microscopía de fluorescencia de E. coli tratada con microcina 24. 52

Figura 21 Sensibilidad de cepas de E. coli mutantes en fhuA. 53

Figura 22 Operón fhu. 54

Figura 23 Mutante carente de los genes fhuCDB realizada mediante la técnica de

Wanner. 55

Figura 24 Sensibilidad de las mutantes a la microcina 24. 57

Figura 25 Sensibilidad de las mutantes del sistema fhu a la microcina 24. 58

Figura 26 Sensibilidad a la microcina 24 de las mutantes del sistema fhu

complementadas en trans. 59

Figura 27 Sensibilidad de las mutantes del sistema fhu a la microcina 24 al ser

complementadas con sus respectivos genes. 60

Figura 28 Esquematización del modelo de resistencia a la microcina 24

propuesto. 71

Tabla de contenidos v

INDICE DE TABLAS

Tabla I Cepas bacterianas utilizadas. 17

Tabla II Plasmidios utilizados. 18

Tabla III Secuencias de los partidores empleados. 19

Tabla IV Motivos de unión a DNA para las proteínas H-NS 48

Tabla de contenidos vi

ABREVIATURAS

Amp: Ampicilina

Cm: Cloramfenicol

FRT: Secuencia blanco de la recombinasa FLP

IPTG: Isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido

Kan: Kanamicina

LB: Luria Bertani

Mcc: Microcina

Mcc24: Microcina 24

ONPG: Orto-nitrofenilgalactopiranósido

PCR: Reacción en cadena de la polimerasa

RT-PCR: Transcripción inversa acoplada a la reacción en cadena de la polimerasa

Tet: Tetraciclina

Resumen. vii

RESUMEN

Las microcinas son un grupo de bacteriocinas de bajo peso molecular (inferior a

10 kDa), producidas principalmente por miembros de la familia Enterobacteriaceae,

que inhiben el crecimiento de otras bacterias estrechamente relacionadas con la cepa

productora. Estas proteínas son resistentes a condiciones adversas como temperatura

y pH extremos, resisten incluso a ciertas proteasas, son solubles en metanol y no son

inducibles por el sistema SOS. De todas las microcinas conocidas, la microcina 24 es

una de las menos estudiadas. Según la secuencia publicada en GenBank, la microcina

24 se sintetiza como una pre-proteína de 90 aminoácidos que contiene en su extremo

amino terminal una señal de exportación, que es cortado en un motivo de doble

glicina al ser exportada. La proteína madura (exportada) contiene 74 residuos y posee

una masa teórica de 7527 Da. El mecanismo de acción de la microcina 24 no se

conoce bien. Carlson y cols. en 2001 publicaron que posiblemente el blanco de

acción de esta bacteriocina se encuentra en el citoplasma, sin embargo estudios

preliminares de nuestro grupo revelan que el blanco de acción de la microcina 24 es

la membrana citoplasmática. En este trabajo se planteó como objetivo caracterizar la

expresión de la microcina 24 e identificar el mecanismo de acción por el cual genera

la muerte bacteriana.

Para caracterizar la expresión de la microcina 24 se analizó el sobrenadante de un

cultivo de E. coli MC1061pGOB18, en diferentes etapas de crecimiento, en búsqueda

de actividad antimicrobiana. Se determinó que la microcina 24 comienza a producirse

en fase exponencial de crecimiento. Un análisis transcripcional mediante RT-PCR

permitió observar que la microcina 24 se transcribe junto con su inmunidad en una

sola unidad bicistrónica, lo que le permite a la cepa productora regular la expresión

de la microcina 24, de manera tal que no resulte tóxica para sí misma. La purificación

de esta microcina se realizó a partir del sobrenadante de un cultivo productor de

microcina 24, en un sistema de cromatografía hidrofóbica en fase inversa utilizando

como matriz sólida una columna de Sed-Pack C18 y diferentes concentraciones de

metanol como eluyente. Las diferentes fracciones obtenidas fueron evaluadas en

Resumen. viii

búsqueda de actividad antimicrobiana mediante ensayos de actividad en placa. La

microcina presente en las fracciones que exhibieron actividad fueron re-purificadas

mediante HPLC con columna Sed-Pack C8 como matriz sólida y acetonitrilo 40%

como eluyente. Esta microcina purificada se sometió a un análisis mediante

espectrometría de masa, encontrándose que la microcina 24 posee una masa

experimental de 7274 Da, presentando una diferencia de 253 Da menos que la masa

teórica deducida. Esta diferencia se debe a un error en la secuencia publicada en

Genbank, la que fue detectada al secuenciar el sistema productor completo. La

corrección de la secuencia permite deducir una masa teórica de 7293 Da, que se

asemeja más al valor experimental. No sólo en la secuencia de la microcina se

descubrió errores, también se observó una discrepancia en el gen mdbA que

originalmente contenía un dominio incompleto de unión a DNA, pero luego de la

corrección se observó que la proteína codificada contiene el dominio completo. Este

dominio es común en proteínas de la familia H-NS que se unen a secuencias ricas en

timinas y adeninas silenciando genes. En función a estas diferencias, los genes del

sistema fueron renombrados como sigue: mcnR (antiguamente llamado mdbA), mcnI

(mtfI), mcnN (mtfS), mcnA (mtfA) y mcnB (mtfB).

Para determinar el mecanismo de acción de la microcina 24 se propuso como

hipótesis que esta microcina genera poros en la membrana (en función a la alta

identidad con la microcina E492, una microcina formadora de poros), ergo, siendo su

mecanismo bactericida. Para demostrar esto se realizaron ensayos de actividad β-

galactosidasa en E. coli DH5a y E. coli HB101, recuento de células viables y

microscopía de fluorescencia. En todos estos experimentos se concluyó que la

microcina 24 permeabiliza la membrana interna de las bacterias sensibles.

Considerando que todas las microcinas conocidas utilizan el sistema de transporte de

hierro para ingresar a la bacteria, y que las mutantes carentes de los receptores Fep,

Fiu y Cir siguen siendo sensibles a la microcina 24, se propuso que el receptor de la

microcina 24 es FhuA. Analizando la sensibilidad de las cepas de E. coli C600,

JM110 y P8, se demostró experimentalmente que el receptor para esta microcina es

efectivamente la proteína FhuA (receptor del ferricromo hidroxamato). FhuA

Resumen. ix

pertenece a un sistema de 4 miembros (FhuA, FhuC, FhuD, FhuB) encargados de la

internalización del hierro, por medio del sideróforo ferricromo hidroxamato.

Generando una mutante en los genes fhuCDB por el método de Wanner, se determinó

que estos elementos participan en el mecanismo de acción y empleando mutantes

individuales para fhuCDB se determinó que la microcina 24, al ingresar al periplasma

por medio de FhuA, emplea las proteínas FhuD y FhuB para permeabilizar la

membrana interna.

Abstract.

x

ABSTRACT

Mechanism of interaction between microcin 24 and its bacterial target cell

Microcins are a kind of bacteriocins of low molecular weight (below 10 kDa),

produced mainly by members of the Enterobacteriaceae family, which are capable of

inhibiting growth of other closely related bacteria to the strain that produces them.

These proteins are resistant to adverse conditions such as temperature and extreme

pH, they also resist certain proteases, are soluble in methanol and are not inducible by

the SOS system. From all known microcins, microcin 24 is one of the least studied.

According to the published sequence in GenBank, microcin 24 is synthesized as a

pre-protein containing 90 aminoacids, with an export signal at the N terminus, that is

cut in a double-glycine motive. The mature protein (exported) contains 74 residues

and has a theoretical mass of 7527 Da. The mechanism of action of microcin 24 is

still unclear. However, in 2001 Carlson et al. reported that the possible target of this

bacteriocin is in the cytoplasm. Nevertheless, preliminary studies from our group

reveal that the target of microcin 24 is the cytoplasmic membrane.

In this thesis, the main objective was to characterize the expression of microcin 24

and to identify its mechanism of action, which generates bacterial death. With the aim

of characterizing microcin 24 expression, the supernatants of E. coli

MC1061pGOB18 were analyzed at different growth stages, in search of antimicrobial

activity. We observed that microcin 24 synthesis begins at the exponential phase of

growth. By means of transcriptional analysis by RT-PCR, the results suggest that

microcin 24 is transcribed together with its immunity gene in one bicistronic unit,

which allows the producing strain to regulate microcin 24 expression, and therefore it

is not toxic to itself. Microcin 24 was purified from the supernatant of a producing

culture by using a hydrophobic chromatography system (column of Sed-PackC18

reverse phase solid matrix and different concentrations of methanol as eluent). The

different eluted fractions were tested searching for antimicrobial activity by plate

activity assays. The fractions with antimicrobial activity were re-purified by HPLC

using a Sed-Pack C8 column as solid matrix and 40% acetonitrile as eluent. The

Abstract.

xi

purified microcin 24 was analyzed by mass spectrometry. An experimental mass of

7274 Da was obtained, exhibiting a difference of 253 Da less than the deduced

theoretical mass. This difference is due to a mistake in the published sequence in

GenBank, that was detected by sequencing the complete producing system. The

correction of the sequence originates a theoretical mass of 7293 Da, which is closer to

the experimental value. By means of these results we also discovered an error in the

sequence of microcin 24, and also a discrepancy in the mdbA gene sequence, which

originally contained an incomplete DNA binding domain. After corrections, it was

observed that the encoded protein contains the entire domain. This domain is

common in H-NS proteins families that bind to thymine and adenine rich sequences

that silence genes. Based on these differences, the genes were renamed as follows:

mcnR (formerly called mdbA), mcnI (mtfI), mcnN (mtfS), mcnA (mtfA) and mcnB

(mtfB).

With the purpose of determining the mechanism of action of microcin 24, the

following hypothesis was proposed: microcin 24 generates pores in the membrane

(according to the high identity with microcin E492, a pore-forming microcin), ergo it

presents a bactericidal mechanism. By using a β-galactosidase activity assay in E. coli

DH5α and E. coli HB101, viable cell counts and fluorescence microscopy were

performed to test this hypothesis. In all these experiments we found that microcin 24

permeates the inner membrane of sensitive bacteria. Since all known microcins use

iron transport systems to enter bacteria, and the fact that mutants lacking Fep, Fiu and

Cir receptors remain sensitive to microcin 24, we propose that the microcin 24

receptor is FhuA. Analyzing the sensitivity of E. coli strains C600, JM110 and P8, it

was shown experimentally that the receptor for this microcin is indeed FhuA

(Ferrichrome hydroxamate receptor protein). FhuA belongs to a system of 4 members

(FhuA, FhuC, FhuD, FhuB) responsible for the internalization of iron through a

hydroxamate ferrichrome siderophore. We generated a mutant lacking the fhuCDB

machinery, using the Wanner method and determined that these elements participate

in the mechanism of action. Besides, by using individual mutants of fhuCDB we

determined that microcin 24 enters the periplasm through FhuA, using proteins FhuD

and FhuB to permeate the inner membrane of sensitive bacteria.

Introducción

1

1.- INTRODUCCIÓN

A través de la evolución, los microorganismos han desarrollado la capacidad de

competir por los nutrientes de su medio. Algunos microorganismos han desarrollado

sistemas de captación de nutrientes muy eficientes, otros han desarrollado un sistema

de quimiotaxis, que les permite acercarse a la fuente de nutrientes, mientras que otros

han desarrollado un complejo arsenal de compuestos antimicrobianos para inhibir el

crecimiento y desarrollo de otros miembros del ecosistema bacteriano. Un ejemplo de

ello son las bacteriocinas, proteínas con actividad biológica antibacteriana (Riley y

cols., 2002), producidas por microorganismos pertenecientes al dominio Bacteria.

También se ha descrito este tipo de proteínas en arqueas halófilas, las que se han

denominado halocinas (Rodriguez-Valera y cols., 1982) y se ha determinado que

esta clase de antagonismo también es común dentro del dominio Arquea

(Torreblanca y cols., 1986).

Debido a su capacidad de inhibir el crecimiento bacteriano, las bacteriocinas

pueden ser utilizadas como una eficaz herramienta de control microbiológico. Por

ejemplo, la Nisina se ha empleado para el desarrollo de preservantes de alimentos,

que se utilizan en la actualidad en la industria alimenticia (Ross y cols., 2002).

1.1.- Clasificación de Bacteriocinas

Las bacteriocinas han sido clasificadas históricamente en base al organismo que la

produce, la masa molecular que presentan, la estructura química que poseen o en su

modo de acción. Estas diversas clasificaciones han producido diferentes

denominaciones como microcinas, colicinas, lantibióticos, tiolantibióticos,

cistiobióticos, etc. (Riley y cols., 2002). En general las bacteriocinas, dependiendo

del organismo que la produce, pueden ser clasificadas en dos grupos principales: las

producidas por bacterias Gram negativas y las producidas por bacterias Gram

positivas. A su vez, las bacteriocinas producidas por bacterias Gram negativas, se

subclasifican en base a la masa que presentan. Las bacteriocinas con una masa

inferior a 10 kDa se denominan microcinas, en cambio las que poseen una masa

superior a 10 kDa se denominan colicinas (Baquero y cols., 1984).

Introducción

2

1.2.- Microcinas

Como se señaló anteriormente, las microcinas son bacteriocinas de masa

molecular inferior a 10 kDa. Son producidas principalmente por bacterias

pertenecientes al género Escherichia, con excepción de la microcina E492 que es

producida por Klebsiella pneumoniae RYC492 (de Lorenzo, 1984) y la microcina

SF608 producida por la cianobacteria Microcystis (Banker y Carmeli, 1999). Estas

bacteriocinas presentan actividad bacteriostática o bactericida sobre especies

estrechamente relacionadas con la bacteria que la produce.

Las microcinas son resistentes a condiciones adversas como temperatura y pH

extremos, son resistentes a ciertas proteasas, son solubles en metanol y no son

inducibles por el sistema SOS (Kolter y Moreno, 1992). La mayoría de las

microcinas son producidas en fase estacionaria de crecimiento (Riley y Wertz, 2002),

a excepción de la microcina E492 que se produce en fase exponencial (de Lorenzo,

1984).

Las microcinas están codificadas en un “cluster” de genes presentes en plasmidios

o en el cromosoma bacteriano. Estos “clusters” de genes codifican para el precursor

de la microcina, el factor de autoinmunidad, las proteínas encargadas de la secreción

y en algunos casos, las enzimas necesarias para la modificación postraduccional de

las microcinas (Thomas y cols., 2004).

La primera clasificación formal de las microcinas fue realizada en el 2002 (Pons

y cols., 2002). Pons propuso dividirlas en dos clases de acuerdo a la presencia o

ausencia de modificaciones postraduccionales. Sin embargo, esta clasificación no se

ajusta para la microcina E492, que puede ser exportada en su forma modificada o no

modificada (Thomas y cols., 2004).

En respuesta a este problema, en 2007 se propuso una nueva forma de

clasificación (Duquesne y cols., 2007). Esta clasificación incluye los siguientes

criterios: (i) la presencia, la naturaleza y localización de modificaciones

postraduccionales, (ii) la organización del cluster de genes, y (iii) la secuencia del

péptido líder. En esta clasificación, las microcinas clase I son todas aquellas que

presentan un masa inferior a 5 kDa, con una vasta modificación postraduccional

Introducción

3

(MccB17, MccC7/C51, MccJ25). La clase II incluye a todas las microcinas entre 5 y

10 kDa. La clase II se divide en dos subgrupos, IIa para aquellas que no presentan

modificación postraduccional (MccL, MccV y Mcc24), y IIb para aquellas que

pueden presentar modificación postraduccional en el extremo C-terminal (MccE492,

MccM y presumiblemente MccH47 y MccI47) (Duquesne y cols., 2007).

1.3.- Organización génica de las microcinas

La mínima estructura que presenta el sistema génico de una microcina es: i) gen

que codifica para el precursor de la microcina, ii) gen que codifica para el factor de

autoinmunidad para la propia microcina, y iii) genes que codifican para el sistema de

exportación necesarios para la secreción de estos compuestos al medio (Duquesne y

cols., 2007). Adicionalmente, pueden presentar genes que codifican para enzimas que

generan modificaciones postraduccionales (Figura 1).

Las microcinas de clase I (MccB17, MccC7/C51 y MccJ25) son codificadas por

un “cluster” de genes, donde el gen de autoinmunidad se encuentra lejano al gen

estructural de la microcina. Adyacente al gen de la microcina se encuentran dos o tres

genes involucrados en la modificación postraduccional y un gen involucrado tanto en

la exportación, como en la autoinmunidad (Duquesne y cols., 2007).

Las microcinas de clase II se caracterizan por presentar al menos dos genes

involucrados en la exportación. Estos genes, que son homólogos dentro de esta clase

de microcinas requieren de TolC, que es aportado por el hospedero, para ser

funcionales. El sistema genético de las microcinas de clase IIa está compuesto por

cuatro genes, organizados en dos operones, uno para el sistema de microcina e

inmunidad y el otro para el sistema de exportación (Duquesne y cols., 2007) (Figura

1). El sistema genético de las microcinas de clase IIb se encuentra codificado en el

cromosoma bacteriano, presentan una compleja organización transcripcional y poseen

además, genes involucrados en la modificación postraduccional (Duquesne y cols.,

2007) (Figura 1).

Introducción

4

Figura 1. Organización génica de los cluster de genes de las microcinas. Los genes están representados

por flechas, cuya dirección indica el sentido de la transcripción. Los genes que codifican para precursores de

microcinas son mostrados en amarillo. Los genes requeridos para la inmunidad, exportación y modificación

post-traduccional son mostrados en rojo, azul y verde respectivamente. Las microcinas clase I se muestran

en A. Los genes requeridos tanto para la inmunidad como para la exportación se muestran en púrpura. El

gen mccE, el cual se requiere tanto para la modificación post-traduccional (extremo N-terminal) como para

la inmunidad (extremo C-terminal) se muestra en degradación verde-rojo. Las microcinas clase IIa y IIb

están agrupadas en B y C respectivamente. Los genes que codifican para proteínas con función desconocida

se muestran en gris. Los genes tra5, insC e insE, coloreados en café, codifican para transposasas para la

inserción de secuencias IS2 e IS3. (Adaptado de Duquesne y cols., 2007)

1.4.- Rol de la maquinaria de captura de hierro dependiente de TonB

La existencia de bacterias mutantes en receptores de membrana externa

resistentes a la acción de determinadas microcinas, indica que las microcinas utilizan

Introducción

5

estos receptores para su ingreso a la célula (Pugsley y cols., 1986). Estos receptores

están normalmente involucrados en la importación de iones metálicos como el hierro

(Patzer y cols., 2003). El hierro es un metal importante para el desarrollo de la vida,

pues es el principal cofactor de las enzimas redox. A pesar de su enorme importancia,

en la naturaleza el hierro biodisponible se encuentra en muy bajas concentraciones

(Chipperfield y Ratledge, 2000). Es por esto que las bacterias han desarrollado un

sistema muy eficiente de captura del hierro soluble, atrapándolo en moléculas

quelantes (sideróforos). Estos sideróforos tienen receptores específicos que

transfieren el complejo hierro-sideróforo hacia el espacio periplásmico, donde es

captado por un segundo sistema de transporte que lo lleva al citoplasma donde el

hierro es liberado del quelante.

En Enterobacterias estos receptores son de tres tipos: i) tipo hidroxamato, como

FhuA que une todos los sideróforos hidroxamatos como el ferricromo hidroxamato

(Coulton y cols., 1983), ii) tipo catecoles, como FepA (Annamalai y cols., 2004),

Fiu y Cir (Nikaido y Rosenberg, 1990) que unen sideróforos con estructura de

catecol como la enterobactina, y iii) tipo citrato, como FecA que une a los

hidroxicarboxilados como el citrato (Härle y cols., 1995; Kim y cols., 1997). Para la

importación del sideróforo, los receptores necesitan del sistema TonB-ExbBD

(Braun, 1995). ExbB y ExbD son proteínas de membrana interna, que forman un

complejo heteromultimérico de aproximadamente 500 kDa (Higgs y cols., 2002),

homólogo al sistema MotAB que energiza el movimiento del flagelo (Blair, 2003),

por lo tanto, se cree que ExbBD utiliza la gradiente de protones para energizar al

sistema y generar el transporte. Por otra parte, TonB es una proteína de 26 kDa. que

posee tres regiones claramente definidas, denominadas región amino terminal, región

intermedia rica en prolina y la región carboxilo terminal (Postle y Good., 1983). La

región amino terminal de TonB es altamente hidrofóbica, contiene una señal de

exportación a periplasma reconocida por el sistema sec, la cual no es procesada

proteolíticamente. Esta señal proporciona el anclaje de TonB a la membrana interna

(Karlsson y cols., 1993), permitiendo así interactuar con ExbBD (Jaskula y cols.,

1994). La región intermedia presenta una alta proporción de residuos de prolina

Introducción

6

(Postle y Good, 1983) y se extiende por el periplasma permitiendo a la región

carboxilo terminal interactuar con la región periplasmática de los receptores de

sideróforos (Evans y cols., 1986). Estos receptores presentan en su región amino

terminal una secuencia conservada que participa en la interacción con la región

carboxilo terminal de TonB. Esta secuencia se denomina TonB-box y también se

encuentra presente en colicinas del grupo B, las cuales utilizan los receptores

dependientes de TonB para su internalización (Cascales y cols., 2007).

1.5.- Receptor de sideróforos hidroxamatos FhuA.

FhuA es el receptor del ferricromo hidroxamato (Coulton, 1982) y de microcinas

J25 (Salomon y Farías 1993). FhuA es una proteína de 747 aminoácidos en forma de

barril β con un tapón que bloquea el paso de solutos entre el medio externo y el

periplasma. En la disposición tridimensional sólo se han resuelto 723 aminoácidos

mediante difracción de rayos X, que corresponden al tapón y a la estructura de barril

β (Ferguson y cols., 1998). El tapón está formado por los primeros 160 residuos de

FhuA. El barril de FhuA está formado por 22 hebras β antiparalelas conectadas entre

sí por 10 vueltas (T1 a T10) en el periplasma y 11 “loops” (L1 a L11) o asas en el

exterior (Figura 2) (Ferguson y cols., 1998). Los “loops” contienen varios residuos

que sobresalen de la superficie de la membrana externa y ayudan al reconocimiento

del ferricromo hidroxamato, como se ha demostrado mediante la deleción de los

residuos 236 a 248 que forman el “loop” L3, el cual resulta en la pérdida de la captura

del ferricromo hidroxamato (Killmann, 1998). Aunque ninguno de los residuos de

L4 (318-339) contribuyen directamente con la unión al ferricromo, su conformación

resulta de vital importancia para la interacción del ferricromo a su sitio de unión

(Killmann y Braun, 1992). El tapón de FhuA consiste en una lámina β de 5 hebras

(βA a βD), 5 hélices α y 3 “loops” (ápice A, B y C) (Figura 2). La lámina β se

encuentra inclinada en 45° con respecto a la membrana externa, ocupando gran parte

del lumen de FhuA y delimitando dos bolsillos dentro de ella (Figura 2) (Ferguson y

cols., 1998).

El bolsillo superior se encuentra abierto hacia el medio exterior, está delimitado

por las hebras β y los “loops” externos del barril, y por los ápices A, B y C del tapón.

Introducción

7

(Figura 3) (Ferguson y cols., 1998). Este bolsillo es importante para la adquisición

del complejo hierro-sideróforo, pues en él ocurre la unión del ferricromo

hidroxamato.

Figura 2. Representación en cinta del tapón de FhuA. En esta representación, el barril de FhuA

está coloreado azul y el tapón de rojo. I) FhuA es una proteína de membrana externa con forma de

barril de 22 hebras β conectadas por 11 “loops” en el medio exterior y por 10 vueltas en el lado

periplasmático. Los residuos comprendidos entre las hebras β18 y β 22 del barril han sido eliminados

para observar el tapón de FhuA. El tapón está formado por cuatro hebras β inclinadas en 45° con

respecto al plano de la membrana. Los ápices A, B y C delimitan el bolsillo externo de FhuA. II) Vista

superior de FhuA. En esta representación se observa la obstrucción del canal generada por el tapón, se

observa además la base del bolsillo generado por los ápices. III) Vista inferior de FhuA. Imágenes

realizadas con el programa VMD a partir de la estructura 2fcp (Ferguson y cols., 1998)

Comparando las estructuras del receptor FhuA cristalizadas con y sin ferricromo,

se ha determinado que la unión del ferricromo no produce un gran cambio en el

barril, a excepción de las vueltas 8 y 9 (Figura 3) (Ferguson y cols., 1998).

A diferencia de lo que ocurre en el barril, la unión del ferricromo produce un gran

cambio conformacional en el tapón. El ápice B (residuos 98 a 100) se traslada 1,7 Å,

mientras que la primera hélice del tapón, llamada “switch helix” (residuos 24 a 29),

en presencia de ferricromo hidroxamato, se desenrolla completamente trasladando en

I II

III

βA

βB

βC βD

Asas (“Loop”)

Switch helix

A

B

C

Vueltas (Turns)

Barril β

Introducción

8

180° los residuos que originalmente la conformaban (Figura 3) (Ferguson y cols.,

1998). Esta hélice hidrofóbica, en ausencia de ferricromo, se encuentra estabilizada

en un pequeño bolsillo hidrofóbico conformado por las vueltas 8 y 9. En presencia de

ferricromo se produce un traslado de T8 y T9, lo cual expone al medio la hélice,

desestabilizando completamente la estructura y desplazando sus aminoácidos 17,3 Å

en 180° (Butcher y cols., 1995). Este movimiento traslada el residuo Trp22

generando una oclusión total del poro y la exposición de los residuos 7 a 11 de FhuA

que conforman una secuencia consenso denominada caja TonB (Figura 3). La

exposición de la caja TonB permitiría la interacción entre FhuA y la proteína

transductora de energía TonB (Ferguson y cols., 1998).

Figura 3. Cambio conformacional inducido por la unión del ferricromo hidroxamato. I) La unión

del ferricromo hidroxamato al receptor FhuA genera un cambio en los ápices A, B y C del tapón. Este

cambio no distorsiona la estructura del barril, sin embargo desplaza ligeramente las vueltas T8 y T9.

Este ligero desplazamiento de las vueltas expone los residuos de la “switch helix” desestabilizando la

estructura de hélice. II) y III) La desestabilización de la hélice produciría un desenrollamiento de ésta,

trasladando el residuo Trp22 17,3 Å desde su posición original (residuo W22 azul) hasta su posición

final (residuo W22 rojo). Esto generaría una completa obstrucción del lumen de FhuA.

Luego que el ferricromo es translocado al periplasma, por medio de FhuA, es

recibido por FhuD (Carter y cols., 2006). FhuD cumple el rol de transporte del

W22

W22

I II

III

T8

T9 T10

Introducción

9

ferricromo a través del periplasma, trasladando el ferricromo desde FhuA hasta FhuB

(Carter y cols., 2006). FhuB es un importador que transloca al ferricromo hacia el

citoplasma (Rohrbach y cols., 1995), en un proceso dependiente de ATP. FhuC es la

ATPasa que entrega la energía para abrir el translocador FhuB (Schultz-Hauser y

cols., 1992).

1.6.- Receptores de sideróforos catecólicos FepA, Fiu y Cir

Estos tres receptores son muy similares a FhuA, en cuanto a la estructura de barril

y al tapón que obstruye la difusión de partículas a través de él. Se ha demostrado que

la microcina E492 puede utilizar cualquiera de estos tres receptores para entrar al

periplasma de las células sensibles, ya que sólo mutantes triples en estos receptores

son completamente resistentes a esta microcina, pero no así las mutantes individuales

(Strahsburger y cols., 2005). Estas triples mutantes también son insensibles a la

microcina M y la H47 (Patzer y cols., 2003), indicando que la MccM y la MccH47,

también utilizan estos receptores.

1.7.- Mecanismos de acción de las microcinas

La gran variedad de microcinas se correlaciona con la variedad de mecanismos de

acción que presentan. Con el fin de organizar todas estas microcinas, en base al

mecanismo de acción, se han agrupado según el blanco final. De esta forma, las

microcinas pueden ser clasificadas en dos clases. Aquellas que tienen como blanco la

membrana interna (bactericidas) y aquellas que tienen como blanco proteínas

citoplasmáticas (bacteriostáticas).

1.7.1.- Microcinas bacteriostáticas

Todas las microcinas de clase I tienen como blanco proteínas del citoplasma, en

enzimas relacionadas con la replicación, transcripción o traducción.

La microcina B17 es un inhibidor de la DNA girasa, se une a los complejos de

DNA-girasa atrapándolos irreversiblemente, inhibiendo así la replicación del DNA

(Vizán y cols., 1991). Mutaciones puntuales en la subunidad β de la DNA girasa son

Introducción

10

suficientes para disminuir o eliminar por completo la actividad de la MccB17 (del

Castillo y cols., 2001).

La microcina C7/C51 es sintetizada y exportada en su forma precursora

(Metlitskaya y cols., 2006). Esta microcina ingresa a la bacteria sensible en su forma

inactiva y es procesada proteolíticamente por una peptidasa citoplasmática

desconocida (Metlitskaya y cols., 2006). Esta forma procesada es la forma activa e

inhibe la síntesis del tRNAAsp

aminoacilado.

El mecanismo de acción de la microcina J25 fue descubierto debido a una

mutante espontánea que desarrolló resistencia a ésta. Esta cepa contenía una mutación

puntual en el gen rpoC que codifica para la subunidad β´ de la RNA polimerasa

(Delgado y cols., 2001). Posteriormente se determinó que la MccJ25 es capaz de

inhibir, in vitro, la RNA polimerasa de bacterias Gram negativas (Yuzenkova y cols.,

2002).

1.7.2.- Microcinas bactericidas.

La modificación de la permeabilidad de la membrana ha sido reportada sólo para

tres microcinas: microcina E492 (Lagos y cols., 1993), microcina H47 (Rodriguez y

Laviña, 1998) y microcina V (Yang y Konisky, 1984). Sin embargo, la microcina V

sólo se ha reportado como formadora de poros en ensayos in vivo, ya que en ensayos

sobre bicapas lipídicas no se evidencia la formación de poros (Yang y Konisky,

1984).

1.8.- Microcina 24 y su mecanismo de acción

La microcina 24 es producida, originalmente, por la cepa uropatogénica de E. coli

2424 (O`Brien y cols., 1994). En esta cepa, los determinantes génicos involucrados

en la producción de la microcina 24 están codificados en un plasmidio conjugativo de

43 kb. A partir de este plasmidio se aisló una región de 8,7 kb que contenía los genes

del sistema microcina 24 (O`Brien y cols., 1994). Posteriormente, mediante digestión

enzimática, se determinó que estos genes están contenidos en un fragmento de DNA

de 5,25 kb, el cual se clonó en el plasmidio pBR322 (O`Brien y cols., 1994).

Introducción

11

Este fragmento contiene 5 ORFs, mdbA, mtfI, mtfS, mtfA y mtfB (GenBank

U47048). El gen mdbA codifica para una proteína cuya función no se ha determinado.

Un análisis bioinformático de esta proteína revela que posee un dominio incompleto

de unión a DNA, por lo que podría poseer actividad reguladora. Los genes mtfA y

mtfB codifican para el sistema de exportación de la microcina 24, el gen mtfI codifica

para la inmunidad, en tanto, mtfS codifica para la microcina 24, generando una

proteína de 90 aminoácidos que posee un péptido señal de 16 residuos con un motivo

de doble glicinas característico de las microcinas secretadas por el sistema de

exportación ABC (Kolter y Moreno, 1992). La masa de la microcina 24, deducida a

partir de la secuencia publicada en Genbank (U47048), es de 9424 Da. Después del

corte proteolítico, predicho según la secuencia, la masa final de la microcina es de

7527 Da.

El mecanismo de acción de la microcina 24 es, hasta ahora, desconocido. Estudios

realizados con cepas de E. coli mutantes en los genes fep, fiu y cir no muestran

disminución en la sensibilidad a la microcina 24, sin embargo cepas mutantes en tonB

son completamente resistentes (Patzer y cols., 2003). Por este motivo se cree que la

microcina 24 actúa empleando la proteína FhuA como receptor (Patzer y cols.,

2003), sin embargo no se ha demostrado experimentalmente. Por otra parte, tampoco

se ha evaluado si la microcina 24 emplea receptores tipo citrato, analizando la

sensibilidad de cepas mutantes en fecA a ésta, ya que también estos receptores

requieren del sistema TonB-ExbBD para el transporte del sideróforo citrato. Por otro

lado y en base a la identidad que presenta la microcina 24 con la microcina E492

(55% de identidad), se pensó por varios años que su blanco de acción era la

membrana citoplasmática, pero Carlson y cols. (2001) postularon que la acción de la

microcina podría estar en el citoplasma. Carlson observó que Salmonella enterica

serovar Typhimurium luego de una exposición prolongada a la microcina 24,

generaba un fenotipo de resistencia a ésta. El grupo de Carlson encontró que esta

resistencia a Mcc24 generaba, además, resistencia a múltiples antibióticos. Para

entender el mecanismo por el cual la Mcc24 estaba generando resistencia a

antibióticos, estudiaron la expresión del operón mar (de multiple-antibiotic

Introducción

12

resistance) presente en Salmonella. El operón mar regula un sistema de flujo que

facilita la expulsión de antibióticos y solventes orgánicos (Alekshun y Levy, 1999).

Consta de 4 genes: marR, que codifica para el represor MarR; marA, que regula la

expresión del sistema de flujo, entre otros; y por último marB y marC cuya función es

desconocida (Cohen y cols., 1993). La expresión del operón mar está comandada por

la región operadora marO (Martin y Rosner, 1995). En condiciones normales, MarR

se encuentra unido a marO e inhibe la expresión de marA, generando un fenotipo de

sensibilidad a los antibióticos. Cuando MarR abandona la región marO, se activa la

expresión de marA. El producto de este gen, MarA, es capaz de regular la expresión

del sistema de flujo generando de esta forma un fenotipo de múltiple resistencia a

antibióticos. Carlson demostró que la expresión de MarA en Salmonellas también

induce resistencia a la Mcc24 y que la Salmonella expuesta reiteradamente a la

Mcc24 induce resistencia a los mismos antibióticos que MarA, proponiendo que la

microcina 24 al ingresar al citoplasma baja los niveles del represor MarR sin alterar la

expresión del gen marR.

Sin embargo, experimentos preliminares realizados por nuestro grupo indican que

la microcina 24 al ser inoculada sobre un césped de bacterias sensibles en estado de

inducción del sistema β-galactosidasa genera un halo de inhibición de crecimiento de

color azul, más intenso que el azul del césped. Es más, el mismo ensayo se realizó

sobre una cepa sensible a la microcina 24, como la bacteria Escherichia coli HB101,

que carece de la permeasa para β-galactosidos y se generó un anillo azul sobre el

borde del halo de inhibición, lo que nos sugiere que la microcina 24 genera

permeabilidad de la membrana citoplasmática de la bacteria expuesta. En función a

los datos expuestos y considerando que la microcina 24 presenta una similitud del 57

% con la microcina E492, una microcina que se expresa en fase exponencial y cuyo

mecanismo de acción es mediante la formación de poros generando la muerte celular,

proponemos que la microcina 24 se expresa en fase exponencial de crecimiento

bacteriano y su mecanismo de acción ocurre mediante la permeabilización de la

membrana citoplasmática de las bacterias sensibles. Además, como el receptor de la

microcina 24 no ha sido identificado experimentalmente, proponemos que la

Introducción

13

microcina utiliza el receptor FhuA para ingresar en el periplasma. Finalmente, dada la

disposición del resto del sistema de captura e internalización de ferricromo

hidroxamato, postulamos que la microcina 24 utiliza el sistema completo de

transporte del ferricromo hidroxamato.

2.- HIPÓTESIS

En base a los antecedentes reunidos y a los resultados preliminares obtenidos por

nuestro grupo, postulamos como hipótesis que la microcina 24 se expresa en fase

exponencial de crecimiento bacteriano y su mecanismo de acción es dependiente del

sistema de adquisición del ferricromo hidroxamato, que depende a su vez de la

proteína TonB y actuaría en la célula blanco mediante la permeabilización de la

membrana citoplasmática, generando la muerte celular.

3.- OBJETIVOS

Para desarrollar la hipótesis proponemos los siguientes objetivos generales y

específicos.

3.1.- Objetivo general

Caracterizar la expresión e identificar el mecanismo de acción de la microcina 24

3.2.- Objetivos específicos

Para llevar a cabo el objetivo general se plantean los siguientes objetivos

específicos:

1. Caracterizar la expresión del péptido antimicrobiano microcina 24

2. Purificar y caracterizar el péptido antimicrobiano microcina 24

3. Determinar la acción de la microcina 24 como un agente bactericida o

bacteriostático sobre la célula blanco.

4. Determinar el o los componentes involucrados en el mecanismo de

acción de la microcina 24 en la célula blanco

Materiales y Métodos. 14

4.- Materiales y métodos

4.1 Materiales

4.1.1.- Reactivos

De Winkler Ltda, Santiago Chile se obtuvo: Cloruro de magnesio hexahidratado,

dimetilformamida, glicina, glicerol, EDTA, fenol, acrilamida, bis-acrilamida, 1 kb

DNA ladder, fosfato ácido de sodio, β-mercaptoetanol, citrato de sodio, TEMED, 100

bp DNA ladder, cloroformo, ampicilina, alcohol isoamílico, isopropanol, etanol,

metanol, acetonitrilo, glucosa, L-arabinosa, cloruro de calcio, cloruro de sodio,

hidróxido de sodio, cloruro de calcio, cloruro de potasio, sulfato de magnesio,

ampicilina y Tris Base.

De BioRad Laboratorios, Inc., Hercules, CA, E.E.U.U. se obtuvo: Cubetas de

electroporación y el estándar kaleidoscopio de bajo peso molecular.

De Omega Bio-Tek Inc., Doraville, GA, E.E.U.U. se obtuvo: Los sistemas E.Z.N.A.

TM PCR Purification System, E.Z.N.A TM Plasmid Miniprep Kit I y E.Z.N.A. Gel

Extraction Kit.

De DIFCO Laboratorios, Detroit, MI, E.E.U.U. se obtuvo: Bacto-agar, caldo-

Nutrient, agar-Nutrient y Bacto-Casaminoácidos.

De MOBIO Laboratories Inc., Solana Beach, CA, E.E.U.U. se obtuvo: Caldo Luria

Bertani.


De Invitrogen Co., Carlsbad, CA, E.E.U.U. se obtuvo: Las enzimas de restricción

EcoRI y DpnI, la DNA polimerasa Taq y se sistema comercial de viabilidad

bacteriana LIVE/DEAD®

BacLight

De Fermentas Inc., Hanover, MD, E.E.U.U. se obtuvo: DNA ligasa de fago T4

De Promega Corporation, Madison, WI, E.E.U.U. se obtuvo: Transcriptasa inversa

M-MLV y pGEM– T Easy Vector®

System I.

De Millipore, Billerica, MA, E.E.U.U. se obtuvo: Membranas de nitrocelulosa

VSWP02500 para microdiálisis de ácidos nucleicos.

De TCL, Santiago, Chile se obtuvo: Solventes y reactivos grado técnico (ácido

acético, etanol, metanol, acetona, ácido clorhídrico).

De Waters, Milford, MA E.E.U.U. se obtuvo: Cartuchos Sep-Pak C18.

De Flamingo Pharmaceuticals Ltda. Chembur, Mumbai, India se obtuvo:

Cloranfenicol.

De Laboratorio Benguerel, Ltda, Santiago, Chile se obtuvo: Tetraciclina.

De Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, E.E.U.U.) se obtuvo: ONPG e IPTG.

4.1.2.- Cepas bacterianas

Las cepas utilizadas se resumen en la Tabla I.

4.1.3.- Plasmidios

Los plasmidios utilizados se resumen en la Tabla II.


4.1.4.- Partidores

En la Tabla III se detallan los partidores utilizados en los experimentos de PCR, Los

cuales se mandaron a sintetizar a BioScan.

4.2.- Métodos

4.2.1.- Medios de cultivo

Caldo LB. Extracto de levadura 5 g/L, peptona de caseína 10 g/L, NaCl 10 g/L

Caldo nutritivo. Extracto de res 3 g/L, peptona de caseína 5 g/L.

Medio mínimo (M9). Na2HPO4 6 g/L, KH2PO4 3 g/L, NaCl 0,5 g/L, NH4Cl 1 g/L.

Se suplementó con CaCl2 0,1 mM, MgSO4 2 mM, citrato de sodio 0,2 % p/v tiamina

1 µg/mL, casaminoácidos 1 mg/mL y glucosa 0,2 % p/v como fuente de carbono.

Placas de agar LB. Se prepararon las placas con el medio caldo Luria suplementado

con 1,5 % ó 1,0 % de Bacto-agar.

Placas de agar nutritivo. Se prepararon las placas con el medio caldo nutritivo

suplementado con 1,5 % ó 1,0 % de agar.

Placas de medio mínimo M9. Se prepararon las placas con el medio mínimo M9

suplementado con 1,5 % ó 1,0 % de Bacto-agar.

Césped de bacterias sensibles a microcina 24. Sobre placas de agar LB, agar medio

mínimo M9 o agar medio nutritivo se esparcieron 3 a 5 mL del respectivo agar blando

(0,7 % de agar) en el que se incluyó 100 µL de un cultivo de bacterias sensibles,

previamente crecido hasta fase exponencial.

Cultivo Bacteriano. Las células bacterianas que portan plasmidos recombinantes se

cultivaron en placas o en medio líquido suplementado con antibióticos, cuya

concentración final es la siguiente: ampicilina 100 µg/mL, cloranfenicol 50 µg/mL,

tetraciclina 10 µg/mL, y kanamicina 50 µg/mL. Estos antibióticos se prepararon como

describen Sambrock y cols. (1989).


Tabla I. Cepas bacterianas utilizadas en la tesis.

Cepa de E. coli Genotipo Fuente

DH5α

F’/endA1 hsdR17(rk-mk

+) glnV44 thi-1 recA1

gyrA(Nalr) relA1 (lacIZYA-argF) U169

deoR (φ80dlac∆(lacZ)M15)

Stratagene

HB101 F- mcrB mrr hsdS20(rB

- mB

-) recA13 leuB6

ara-14 proA2 lacY1 galK2 xyl-5 mtl-1

rpsL20(SmR) glnV44 λ

-

Stratagene

MC1061 hsdR2 hsdM+ hsdS+ araD139 ∆(ara-

leu)7697 ∆(lac)X74 galE15 galK16 rpsL

(StrR) mcrA mcrB1

S. Maloy

C600 F- tonA21 thi-1 thr-1 leuB6 lacY1 glnV44

rfbC1 fhuA1 λ-

Appleyard, R.,

1954

P8 Cepa fhuA- derivada de la cepa de E. coli

AB2047

Braun, V. y

cols., 1976

JM110 rpsL thr leu thi lacY galK galT ara tonA tsx

dam dcm glnV44 ∆(lac-proAB) e14- [F'

traD36 proAB+ lacI

q lacZ∆M15] hsdR17(rK

-

mK+)

Stratagene

BW25113pKD46 rrnB DElacZ4787 HsdR514

DE(araBAD)567 DE(rhaBAD)568 rph-1

lac1q rrnBT14 DlacZWJ16 hsdR514

DaraBADAH33 DrhaBADLD78.

Cepa portadora del plasmidio pKD46.

Datsenko y

Wanner, 2000

BW25141pKD4 lacIq, rrnB3, del(lacZ)4787, hsdR514,

DE(araBAD)567,DE(rhaBAD)568,

del(phoBR)580, rhp-1, galU95,

del(endA)9,uidA(delMluI)::pir(wt), recA1.

Cepa portadora del plasmidio pKD4.

Datsenko y

Wanner, 2000

S100

E. coli BW25113 ∆fhuCDB, KanR Este trabajo


JW0146 E. coli BW25113 ∆fhuA, KanR

Baba y cols.,

2006

JW0147 E. coli BW25113 ∆fhuC, KanR Baba y cols.,

2006

JW0148 E. coli BW25113 ∆fhuD, KanR Baba y cols.,

2006

JW0149 E. coli BW25113 ∆fhuB, KanR Baba y cols.,

2006

Tabla II. Plasmidios utilizados en esta tesis.

Plasmidio Característica Referencia

pACYC184

Plasmidio con origen de replicación p15A de

propósito general, CmR, Tet

R

Chang y

Cohen, 1978

pBR322 Plasmidio con origen de replicación pMB1 de

propósito general, AmpR, Tet

R

Bolivar y

cols., 1977

pGOB18 pBR322 con fragmento de 5,85 Kb que lleva el

sistema completo de la microcina 24, AmpR

O´Brien y

Mahanty, (no

publicado)

pBluescript

KSII Plasmidio ColE1, de propósito general. Amp

R Alting-Mees

y Short, 1986

pGEM-T Vector de clonamiento. AmpR Promega

pKAR pGEM-T con fragmento de 687 pb que lleva los

genes de la inmunidad y la microcina 24. AmpR

Este trabajo

pIN pGEM-T con fragmento de 424 pb que lleva el

gene de la inmunidad a la microcina 24. AmpR

Este trabajo

pKD46

bla PBAD gam bet exo pSC101 oriTS.

AmpR

Datsenko y

Wanner,

2000


pKD4 bla FRT aph FRT PS1 PS2 ori R6K.

AmpR, Kan

R

Datsenko y

Wanner,

2000

pJW0146 pCA24N que lleva el gen fhuA inserto en el

sitio StuI. CmR

Kitagawa y

cols., 2005

pJW0147 pCA24N que lleva el gen fhuC inserto en el

sitio StuI. CmR

Kitagawa y

cols., 2005

pJW0148 pCA24N que lleva el gen fhuD inserto en el

sitio StuI. CmR

Kitagawa y

cols., 2005

pJW0149 pCA24N que lleva el gen fhuB inserto en el

sitio StuI. CmR

Kitagawa y

cols., 2005

Tabla III. Secuencias de los partidores empleados en esta Tesis.

Nombre Secuencia

IN1 CAA CAG ATT TAT CTG CTG GCC AGT

IN2 TCC TCT CTA TCT AAC TCT CTC ATA

S2 TAT TCT ACC TTA ATG AAT CTT ATC CT

A1 CCA GTC TAA CGA CCA ATT GTC TA

B2 CAT TAT TTT AGT TAT ATC CTC GCA G

T7 ATT TAG GTG ACA CTA TAG AA

SP6 ATT TAG GTG ACA CTA TAG AA

F-fhuC-P1 TTT TGG GGC ACG GAT TTC CGT GCC CAT TTC ACA AGT TGG CTG TTA GTG

TAG GCT GGA GCT GCT TC

R-fhuB-P2 AAC GGC TCT GCT TTC TCA ACA AAT AGA TAA AAT ATG GCG CGC CGA

ATG GGA ATT AGC CAT GGT CC


R-K1 GGG CAC AAC AGA CAA TCG GC

F-K2 CGG TGC CCT GAA TGA ACT GC

F-fhuC TGC AAC CGC AAC CTT CCG TT

R-fhuB AGC GTT TAC GCG ACA ACG GA

AMP1 GAG TAT GAG TAT TCA ACA TTT CCG T

AMP2 ACC AAT GCT TAA TCA GTG AGG CA

Las secuencias que aparean con zonas del plasmidio pKD4 están subrayadas

(Ver más adelante).

4.2.2.- Purificación de la microcina 24

Sobre 2 L de medio M9 se agregó una alícuota de 20 µL de un cultivo de E. coli

MC1061pGOB18 en fase estacionaria y se incubó a 37 °C con una agitación de 200

rpm, hasta una densidad óptica a 600 nm de 0,7. El cultivo se centrifugó a 14.000 x g

durante 10 minutos. El sobrenadante se filtro a través de una columna Sep-Pack C18.

La columna se lavó con 5 mL de metanol 60 % y luego con H2Od. Posteriormente, la

microcina 24 se eluyó con 3 mL de diferentes concentraciones de metanol (70 - 95

%). Se realizó ensayos de actividad antimicrobiana en placa a cada una de las

fracciones colectadas.

4.2.3.- Purificación de microcina 24 mediante HPLC

La purificación de la microcina mediante HPLC se realizó a partir de la microcina

prepurificada mediante cartuchos Sep-Pak C18. Se tomó 1 mL de microcina

prepurificada mediante cartuchos Sep-Pak C18 y se concentró a sequedad mediante

Speed-Vac. El concentrado obtenido se resuspendió en 50 µL de una solución de

acetonitrilo 40 %. La microcina concentrada se cargó en un HPLC Beckman System

Gold y se separó mediante cromatografía isocrática en una columna Beckman ODS

(5µ X 4,6 mm X 25 cm) usando acetonitrilo al 40 % con un flujo de 1 mL/minuto. La


microcina se detectó a 215 nm usando un detector Beckman System Gold 166. Para

identificar qué pico del cromatograma correspondía a la microcina, se colectaron

fracciones de 0,5 mL. La presencia de la microcina en las fracciones se detectó

realizando ensayos de actividad antibacteriana en placa usando un césped de bacteria

sensible.

4.3.- Ensayo de detección de actividad antimicrobiana en placa

4.3.1.- Preparación del césped sensible a la microcina 24

Se mezclaron alícuotas de 100 µL de cultivo de la cepa indicadora sensible a la

acción antimicrobiana de la microcina 24 (E. coli DH5α) con 4 mL de agar blando

(0,7 % p/v) y se esparcieron sobre placas de agar LB. Las cepas indicadoras sensibles

a la acción de la microcina 24 presentaron halos de inhibición de crecimiento.

4.3.2.- Detección de la microcina 24 en sobrenadantes de cultivos

Se inoculó un cultivo de E. coli MC1061pGOB18 productor de microcina 24 en

medio LB hasta la fase estacionaria de crecimiento. Se inoculó una alícuota de 1 mL

este cultivo a 100 mL de medio de cultivo líquido y se incubó a 37 °C durante 24

horas. Se extrajo 1 mL de este cultivo cada una hora, a partir del inóculo inicial y se

centrifugó a 14.000 x g durante 10 minutos. El sobrenadante de cada muestra se

concentró 10 veces por evaporación. Se le realizó una dilución seriada en base 2, en

medio de cultivo pertinente (LB, Nutritivo, Müeller-Hilton o M63), para medir la

actividad de los sobrenadantes concentrados. Se agregó, posteriormente, 10 µL de

cada una de estas diluciones sobre un césped sensible. Se definió como Unidades

arbitrarias de actividad por mL (UA/mL) a la máxima dilución realizada al

concentrado a la cual se generó un halo de inhibición de crecimiento de la bacteria

sensible. Este ensayo se realizó en triplicado.


4.3.3.- Detección de la actividad de la microcina 24 purificada

La actividad antibacteriana de la microcina 24 purificada se detectó depositando

alícuotas de la fracción purificada sobre un césped de una cepa bacteriana sensible E.

coli DH5α. Las placas se incubaron a 37 °C durante toda la noche. La actividad de la

microcina 24 se visualizó por la presencia de halos de inhibición de crecimiento.

4.3.4.- Ensayo de actividad antimicrobiana con cepa productora de microcina 24

La cepa de E. coli MC1061pGOB18 productora de microcina 24 se cultivó durante

12 horas en medio LB con ampicilina 100 µg/mL. Se tomaron alícuotas de 10 µL del

cultivo y se inocularon sobre 2 mL de medio LB con ampicilina, incubando hasta

alcanzar una densidad óptica de 0,4 (OD600). Posteriormente, se tomaron 10 µL de

cultivo y se agregaron a discos de 7 mm de papel filtro. Estos discos se depositaron

sobre un césped de bacterias sensibles, por quintuplicado. Se incubó a 37 °C durante

12 horas y la actividad se registró midiendo el diámetro el halo de inhibición de

crecimiento generado en la cepa sensible. Posteriormente el promedio de los

diámetros de inhibición de crecimiento se graficaron con su respectiva desviación

estándar.

4.4 Electroforesis de proteínas

4.4.1.- Electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) para la microcina

24

Los geles se prepararon según lo descrito por Schägger y von Jagow (1987), método

que permite separar proteínas de un rango de masa molecular de 1 a 100 kDa. El gel

separador se preparó con: 16,5 % de acrilamida (3 % de entrecruzamiento); Tris-HCl

1,0 M pH 8,5; SDS 0,1 % y glicerol al 10 %. El gel espaciador se preparó con: 10 %

de acrilamida (3 % de entrecruzamiento); Tris-HCl 1,0 M pH 8,5; SDS 0,1 %. El gel

concentrador se preparó con: 3 % de acrilamida (3 % de entrecruzamiento); Tris-HCl

1,0 M pH 8,5; SDS 0,1 %. A cada una de estas soluciones se le agregó 0,033 % de


persulfato de amonio y 2,2 mM de TEMED. Los geles se sometieron a un campo

eléctrico de 20 a 200 V, empleando un amortiguador catódico (Tris-HCl 0,1 M pH

8,5, Tricina 0,1 M y SDS 0,1 %) y un amortiguador anódico (Tris-HCl 0,2 M pH

8,9). La diferencia de potencial se aplicó con una fuente de poder CBS SCIENTIFIC

modelo EPS-300 IIV.

Se empleó el marcador de masa molecular Sigma Marker Low Range que posee

fragmentos con las siguientes masas moleculares aparentes: 66; 45; 36; 29; 24; 20,1;

14,2 y 6,5 kDa.

4.4.2.- Marcación y preparación de las proteínas con fluorescamina para

electroforesis en geles de poliacrilamida

Se empleó el método de marcación de péptidos con fluorescamina descrito por

Ragland y cols. (1974). Para ello se concentró por evaporación al vacío 300 µL del

eluído de la columna Sep-Pak hasta 10 µL. Al concentrado se agregó 4 µL de

solución borato 0,4 M pH 9,0, 8 µL de fluorescamina 2 mg/mL en DMSO y 7 µL de

amortiguador de carga 4X (glicerol 40 %; Tris-HCl 50 mM pH 7,6; SDS 10 %; β-

mercaptoetanol 20 %; azul de bromofenol 0,04 % p/v). La mezcla se calentó a baño

maría por 3 minutos y las proteínas se separaron mediante SDS-PAGE. Las bandas de

proteínas se visualizaron en un transiluminador UV y fueron registrados mediante un

sistema de captura UVP modelo 4912-2110

4.5 Aislamiento y purificación de ácidos nucleicos

4.5.1.- Aislamiento de DNA plasmidial bacteriano (miniprep)

El DNA plasmidial se extrajo según el método de lisis alcalina descrito por

Sambrook y cols., 1989. Se centrifugaron 5 mL de un cultivo bacteriano crecido

durante toda la noche en medio LB o medio mínimo. El precipitado bacteriano se

resuspendió en 200 µL de amortiguador de lisis (glucosa 50 mM; Tris-HCl 25 mM

pH 8,0; EDTA 10 mM). Se incubó 5 minutos a temperatura ambiente, se agregó 400


µL de una solución fresca de SDS/NaOH (SDS 1 % y NaOH 0,2 M) y se mezcló

invirtiendo los tubos 10 veces. A continuación se agregó 300 µL de acetato de potasio

7,5 M pH 5,2 y se mezcló suavemente por inversión. Esta solución se incubó a -20 ºC

durante 5 minutos, y se centrifugó a 14.000 x g. El sobrenadante se traspasó a un tubo

nuevo previamente rotulado, y se agregó 250 µL de fenol:cloroformo:alcohol-

isoamílico (25:24:1) para eliminar proteínas contaminantes. La muestra se agitó en el

vortex por 10 segundos y se centrifugó durante 5 minutos a 14.000 x g. Luego se

extrajo la fase acuosa (superior) y se sometió a una extracción con 250 µL de

cloroformo:alcohol-isoamílico (24:1) para remover los restos de proteínas y fenol. A

la fase superior que contiene el DNA se adicionó 0,6 volúmenes de isopropanol y se

dejó a -20 ºC durante 15 minutos para precipitar el DNA. El DNA precipitado se

separó por centrifugación, se lavó con etanol al 70 % y posteriormente se secó en una

estufa a 37 ºC. El precipitado de DNA se resuspendió en 50 µL de agua nanopura y se

agregó 5 µL de ribonucleasa A (10 mg/mL).

4.5.2.- Aislamiento de RNA bacteriano

El RNA bacteriano se aisló a partir de cultivos crecidos toda la noche o hasta DO600

0,5. El cultivo se centrifugó, se eliminó el sobrenadante y las bacterias se

suspendieron en solución Z6 (clorhidrato de guanidina 8 M; Tris-HCl 50 mM pH 7,0;

EDTA 20 mM) complementada con β-mercaptoetanol frío (al 10 %). A la mezcla se

agregó fenol:cloroformo saturado en agua y después de agitar fuertemente en un

vortex se dejó en hielo durante 20 minutos. Las proteínas y el DNA se separaron

centrifugando la solución a 14.000 x g durante 30 minutos en una microcentrífuga. La

fase acuosa se trasladó a un tubo nuevo y se agregó 1/20 del volumen de ácido

acético 1 M (en agua DEPC) y 0,7 volúmenes de etanol al 95 % frío. Se dejó a -20 ºC

durante 15 a 20 minutos. El RNA se sedimentó por centrifugación a 14.000 x g a 4 ºC

y se lavó con etanol frío al 70 % (con agua DEPC). Luego de secarlo al aire se

disolvió en agua tratada con DEPC y se calentó a 65 ºC durante 10 minutos.

Inmediatamente después se enfrió en hielo y se guardó hasta su uso.


4.6 Electroforesis de ácidos nucleicos

4.6.1.- Separación de DNA

Los ácidos desoxirribonucleicos, como el DNA genómico, el DNA plasmidial,

fragmentos de restricción, productos de PCR y productos de RT-PCR, se analizaron

mediante electroforesis en geles de agarosa. Esta electroforesis se llevó a cabo en una

cámara horizontal, usando el amortiguador TEA (Tris-HCl 40 mM pH 8,1; ácido

acético glacial 20 mM; EDTA 2 mM). La concentración de agarosa fluctuó entre 1,0

y 2,0 % dependiendo del tamaño de los fragmentos de DNA a separar. Para la

preparación de la muestra se empleó el amortiguador de carga (glicerol 50 %, EDTA

50 mM, xiléncianol 1 mg/mL, azul de bromofenol 1,5 mg/mL) antes de su

incorporación a los pocillos del gel. La electroforesis se realizó con una diferencia de

potencial de 80-100 V. Una vez finalizada la electroforesis, el gel se tiñó con

bromuro de etidio (10 µg/mL) y se puso sobre un transiluminador UV para observar

las bandas de DNA.

4.6.2.- Separación de RNA

El RNA bacteriano se separó mediante electroforesis horizontal en geles de agarosa-

formaldehído, utilizando amortiguador MOPS (ácido 3-N-morfolinopropanosulfónico

20 mM, acetato de sodio 50 mM, EDTA 10 mM pH 8,0 y formaldehído 2,2 M). Se

disolvió 1 g de agarosa en 90 mL de agua DEPC y se agregó 10 mL de MOPS 10X.

La preparación de la muestra consistió en resuspender el RNA en formamida

desionizada (12,5 µL ), MOPS 10X (2,5 µL) y agua DEPC (10 µL). Las muestras se

calentaron a 65 ºC durante 10 minutos y se agregó amortiguador de carga (2,5 µL de

glicerol al 50 %, EDTA 50 mM, xiléncianol 1 mg/mL, azul de bromofenol 1,5

mg/mL). Se utilizó MOPS 1X como amortiguador de corrida. La electroforesis se

realizó a 100 V durante 1 h y luego se tiñó el RNA con bromuro de etidio. Los geles

se observaron en un transiluminador UV.


4.6.3.- Purificación de DNA de un gel de agarosa

Se cortó la banda de interés desde un gel de agarosa y se traspasó a un tubo

Eppendorf de 1,5 mL. Posteriormente, se utilizó el sistema comercial “Gel

Extraction” de Omega Bio-Tek Ltda. siguiendo las instrucciones dadas por el

fabricante, obteniéndose el DNA de la banda en un volumen final de 50 µL.

4.7 Electrotransformación

4.7.1.- Preparación de células electrocompetentes

Las células electrocompetentes se prepararon a partir de un cultivo de crecimiento

exponencial. Para ello se inoculó 100 mL de medio LB con 1 mL de un cultivo

crecido hasta fase estacionaria. Las células se colectaron a una OD600 de 0,6 en tubos

de centrífuga fríos y se centrifugó durante 10 minutos a 2.000 x g. El precipitado

bacteriano obtenido se resuspendió en 40 mL de glicerol 10 % frío y se centrifugó

durante 10 minutos a 2.000 x g. Este procedimiento se repitió dos veces más.

Después de los lavados, las células se resuspendieron en el glicerol 10 % remanente

del tubo después de la última centrifugación. Se midió el volumen de la suspensión

celular y se determinó la OD600 diluyendo una pequeña porción de ella en glicerol al

10 %. Se ajustó el volumen del precipitado celular con glicerol al 10 % para llegar a

una OD600 final de 200-250/mL. Las células se alicuotaron y se usaron directamente

para la electroporación o se almacenaron a -80 °C.

4.7.2.- Transformación por electroporación

Se utilizó un equipo Eppendorf modelo Electroporator 2510 acoplado a un

controlador de pulso, para realizar la transformación de las células competentes. El

aparato se configuró colocando el voltaje a 2.500 V, la resistencia de 200 Ω y una

capacitancia de 25 µF. Las células, las cubetas y el portacubetas se dejaron a -20 °C

antes de proceder a la transformación. Se mezclaron 40 µL de células

electrocompetentes con 1-2 µL de DNA plasmidial en un tubo y se electroporó la


mezcla en una cubeta de electroporación de 0,2 cm de separación entre los electrodos.

Inmediatamente después se resuspendieron las células en 1 mL de medio LB estéril y

se las incubó a 37 °C durante 1 h. Las células transformadas se sembraron en placas

de agar nutritivo con los antibióticos apropiados y se incubaron durante 24 h a 37 °C

o 30 °C, según las caracteristicas del experimento.

4.8 Amplificación de fragmentos de DNA por PCR

4.8.1.- PCR de DNA plasmidial

La reacción de amplificación se realizó mezclando DNA plasmidial (0,1-10 ng) con

2,5 ó 5,0 µL de amortiguador de PCR (Tris-HCl 200 mM pH 8,4; KCl 500 mM), 0,5-

1,0 µL de MgCl2 50 mM, 1,0 µL de dNTPs 10 mM, 1,0-2,0 µL de cada partidor a una

concentración de 25 pmol/ µL y 2,5 U de DNA polimerasa Taq para un volumen final

de 25 ó 50 µL. Las condiciones estándares de la reacción fueron: 30 a 33 ciclos de 45

segundos a 94 °C para la desnaturación, 30 segundos a 54 °C para el apareamiento y

90 segundos a 72 °C para la elongación, seguidas por una elongación final a 72 °C

durante 10 minutos. Los partidores empleados para la amplificación de los distintos

segmentos están detallados en la Tabla III.

4.8.2.- Transcripción inversa acoplada a PCR (RT-PCR)

Se realizó un tratamiento con DNAsa I (libre de RNAsa) para retirar completamente

todo el DNA que pudo haber co-purificado mediante el procedimiento de purificación

de RNA total. Se trataron varias alícuotas de RNA con 10 U de DNAsa I en una

solución de MgCl2 2,5 mM durante 30 minutos a 25 °C. La reacción se detuvo por

calentamiento a 65 °C durante 15 minutos. La mezcla resultante se incubó con el

partidor S2 durante 5 minutos a 75 °C y luego se realizó la transcripción inversa

empleando 200 U de transcriptasa inversa M-MLV de Promega y dNTPs 400 µM

durante 1 h a 42 °C.


La mezcla de reacción se calentó 10 minutos a 65 °C para desnaturar la enzima. La

etapa de PCR se realizó empleando como templado una alícuota de 5 µL de la

reacción de transcripción inversa, MgCl2 1 mM, dNTPs 200 µM, amortiguador de

PCR 1X, 25 pmoles de las parejas de partidores IN1 e IN2 o IN1 y S2, 2,5 U de DNA

polimerasa Taq utilizando el siguiente programa: un ciclo de 94 °C durante 6

minutos, 54 °C durante 2 minutos y 72 °C durante 30 minutos, seguido de 25 ciclos

rápidos de 94 °C durante 45 segundos, 55 °C durante 30 segundos y 72 °C durante 90

segundos y una extensión final de 10 minutos a 72 °C.

4.8.3.- Purificación de productos PCR

Los productos PCR se purificaron para ligación mediante el sistema E.Z.N.A. Cycle

Pure Kit de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Los productos de PCR se

resuspendieron en un volumen final de 50 µL de agua destilada y desionizada estéril.

4.9 Ensayo de actividad β-galactosidasa en bacterias permeabilizadas

La permeabilización de la membrana se realizó usando un protocolo adaptado del

establecido por Lehrer y cols. (1988). La bacteria E. coli HB101, la cual carece sólo

de la permeasa para la lactosa (codificada por el gen lacY), presenta un fenotipo lac-.

Esta bacteria puede hidrolizar la lactosa sólo cuando presenta daños en la membrana

interna que la permeabilizan, de esta manera la lactosa puede ingresar a la bacteria sin

requerir de la permeasa LacY. La bacteria E. coli HB101 se cultivó hasta fase

estacionaria. Se inoculó 500 µL de un cultivo en fase estacionaria sobre 5 mL de

caldo de cultivo LB hasta alcanzar una OD600 0,5 en presencia de IPTG (0,1 mM

final). Las bacterias se centrifugaron a 14.000 x g y se lavaron dos veces en medio

M63 (sin glucosa). Luego de los lavados, las bacterias se resuspendieron en 1 mL del

mismo medio y se incubaron durante 1 hora a 37 ° C. El ensayo de permeabilización

se realizó en cubetas de espectrofotómetro agregando 100 µL de bacterias, 625 µM

de ONPG, 1 µL de IPTG (1 M) y completando 1 mL con M63. La reacción se inició


agregando 50 µL de microcina 24. Paralelamente, se realizó un ensayo blanco

agregando 50 de metanol 70 %, 100 µL de bacterias 625 µM de ONPG, 1 µL de

IPTG (1 M) y completando 1 mL con M63. La concentración de o-nitrofenol se

registró cada 15 minutos midiendo la absorbancia de la muestra a 420 nm.

4.10.- Obtención de la cepa E. coli S100 mutante en fhuCBD

El sistema desarrollado por Datsenko y Wanner, 2000 permite el reemplazo

alélico de un gen específico por un cassette génico compuesto por el gen cat

(cloranfenicol acetiltransferasa, gen que confiere resistencia a cloranfenicol), o bien

por el gen aph (aminoglicosido fosfotransferasa, gen que confiere resistencia a

kanamicina). Para realizar esto, es necesario expresar el sistema de recombinación del

fago lambda red y simultáneamente transformar con un producto de PCR que lleva el

gen cat o bien el gen aph. Este método puede ser resumido en 3 etapas (Figura 1). La

primera etapa consiste en generar un amplicón con el gen de resistencia a la

kanamicina presente en el plasmidio pKD4 (Figura 1 A). Los partidores utilizados en

esta etapa contienen en su extremo 3´ homología con las regiones P1 (forward) y P2

(reverse) del plasmidio pKD4 y en su extremo 5´ contiene regiones de homología con

el gen a mutar (H1 y H2) (Figura 1 B). En la segunda etapa, las células competentes

de E. coli BW25113pKD46 en estado de inducción del sistema de recombinación

Lambda Red (arabinosa 0,02 %), son transformadas con el producto PCR generado

en la primera etapa. En esta etapa, la proteína Gam, proveniente del gen γ, se

encargará de inhibir el sistema RecBCD de manera tal que Bet y Exo puedan acceder

al fragmento de PCR, una vez que este ingrese a la bacteria, y promover la

recombinación. En la última etapa, las células transformantes que recombinaron el

fragmento de PCR son seleccionadas por resistencia a kanamicina (Figura 1 C).


Figura 4. Estrategia para la mutagenesis de los genes cromosomales del sistema fhu. En este

diagrama se resume el procedimiento de Wanner para la deleción de los genes del sistema. A) El

partidor F-fhuC-P1 hibrida en su extramo 3´ con la región P1 de pKD4, dejando su extremo 5´ sin

hibridar (H1). El partidor R-fhuB-P2 hibrida en su extremo 3´ con la región P2 de pKD4, dejando su

extremo 5´ sin hibridar (H2). El amplicón generado en esta etapa contiene en sus extremos las zonas

H1 y H2 de homología con la región del cromosoma a mutar. B) El amplicón es introducido en E. coli

BW25113pKD46 con el sistema de recombinasa inducido. Este sistema recombina las regiones H1 y

H2 con las correspondientes regiones homólogas en operón fhu, intercambiando los genes fhuCDB

por el gen de resistencia a kanamicina. C) Las bacterias recombinantes poseen una copia cromosomal

del gen de resistencia a la kanamicina, por lo que pueden ser seleccionadas con este antibiótico.


4.10.1.- Obtención del Producto PCR

Para la mutagénesis se diseñaron dos partidores de 65 nt cada uno, los partidores F-

fhuC-P1 y R-fhuB-P2, en cuyos extremos 5´ contienen 45 nt homólogos a la región

que flanquea al sistema fhuCDB a eliminar. Por otra parte, en sus extremos 3’

contienen la secuencia de los sitios P1 y P3 del plasmidio pKD4 (Tabla III). Estos

partidores se utilizaron para amplificar el gen aph del plasmidio pKD4. El programa

de amplificación empleado consistió en una etapa de desnaturación (94 °C x 2

minutos), 33 ciclos de amplificación (94 °C x 30 segundos de desnaturación; 55ºC x

30 segundos de apareamiento; 72 °C x 90 segundos de elongación) y una etapa de

elongación final (72 °C x 10 minutos). Se obtuvo un producto de amplificación de 1,6

Kpb correspondiente al gen aph flanqueado por zonas homólogas a fhuCBD. El

producto de PCR obtenido se purificó desde geles de agarosa como se describe en

4.6.3 y se digirió con la enzima DpnI, que reconoce secuencias GATC y corta sólo

cuando esta secuencia se encuentra metilada. El producto de digestión se purificó

utilizando el sistema E.Z.N.A. Cycle Pure Kit y se eluyó en 20 µL de H2O

desionizada estéril.

4.10.2.- Transformación de la cepa de E. coli BW25113 con el plasmidio pKD46

Como blanco para producir la eliminación de los genes fhuCDB se escogió la cepa de

E. coli BW25113. Para generar la mutación se prepararon células electrocompetentes

de la cepa de E. coli BW25113 como se describió en 4.7.1. Se introdujo el plasmidio

pKD46 dentro de la cepa de E. coli BW25113 por electroporación (4.7.2). Las

bacterias transformantes se seleccionaron a 30 °C (el plasmidio pKD46 es

termosensible) por resistencia a ampicilina utilizando agar nutritivo con ampicilina 25

µg/mL. Se seleccionó uno de los clones y se cultivó en medio LB con ampicilina 25

µg/mL suplementado con L-Arabinosa 0,2 % para inducir la expresión del sistema

del fago lambda (genes gamma, beta y exo) presente en el plasmidio pKD46 bajo el

control del promotor inducible por arabinosa Para. A partir de este cultivo se

prepararon células electrocompetentes en estado de inducción del sistema de

recombinasa del fago lambda como se describió en 4.7.1, con la diferencia que la


incubación se realizó a 30 °C en presencia de L-arabinosa 0,2 % y ampicilina 25

µg/mL.

4.10.3.- Transformación de la cepa E. coli BW25113pKD46 con el producto PCR

Las células electrocompetentes preparadas como se describió anteriormente fueron

utilizadas para la electroporación del producto PCR. Para esto, se mezclaron 50 µL de

bacterias con 10 µL de producto de PCR digerido. El producto de la electroporación

se incubó en caldo LB a 37 ºC durante 1 h para la recuperación fenotípica. Posterior a

la recuperación, las bacterias transformantes se seleccionaron a 37 ºC en placas de

agar nutritivo suplementadas con kanamicina 20 µg/mL. El plasmidio pKD46 se

eliminó sembrando reiteradamente las bacterias transformantes en placas de agar

nutritivo con kanamicina 20 µg/mL a 42 ºC. Finalmente se seleccionaron las colonias

resistentes a kanamicina y sensibles a ampicilina.

4.11.- Análisis de la microcina 24 mediante espectrometría de masa

Se sometió la microcina 24 purificada por HPLC a un análisis mediante

espectrometría de masa. Los espectros de masa se obtuvieron en un equipo Microflex

MALDI-TOF (Bruker Daltonics, Inc., MA-E.E.U.U.). Para la obtención de espectros

se trabajó en modo ión positivo y detección lineal. Los espectros finales corresponden

a espectros sumados de 10 barridos de 40 “shots” de láser aplicados en diferentes

puntos tomados al azar.

4.12.- Clonamiento en el vector pGEM®-T easy

Se amplificaron las regiones correspondientes al sistema productor de microcina 24

del plasmidio pGOB18 mediante PCR, utilizando la enzima DNA polimerasa Taq. Se

utilizó la pareja de partidores IN1 - S2 para amplificar los genes de inmunidad y


microcina 24, mientras que la pareja de partidores IN1 - IN2 se utilizó para amplificar

el gen de inmunidad (Tabla III). El programa de amplificación consistió en una etapa

de desnaturación (94 °C x 1 minutos), 33 ciclos de amplificación (94 °C x 30

segundos; 55 ºC x 30 segundos; 72 °C x 30 segundos) y una etapa de elongación final

(72 °C x 5 minutos). El amplicón generado con la pareja de partidores IN1 - S2, que

contiene el gen de la inmunidad y el gen de la microcina 24, posee un tamaño de 687

pb. El amplicón generado con la pareja de partidores IN1 - IN2, que contiene el gen

de la inmunidad a la microcina 24, posee un tamaño de 424 pb. Los productos de la

reacción de PCR se purificaron de acuerdo a lo descrito en 4.8.3. Cada uno de los

amplicones generados se ligaron en el vector de clonamiento pGEM®

-T easy según lo

recomendado por el fabricante. Los dos productos de ligación generados se dializaron

en forma independiente y se introdujeron por electroporación en E. coli DH5α y se

sembraron en placas de agar nutritivo con ampicilina 100 µg/mL y X-gal 20 µg/mL.

Se seleccionaron las colonias blancas y se realizó una reacción de PCR con sus

respectivas parejas de partidores. A las colonias que dieron positivo para el análisis

de PCR se les realizó un ensayo de tolerancia a la microcina 24, puesto que poseen el

gen de la inmunidad a ésta. El ensayo se realizó según lo descrito en 4.3.1 y 4.3.4

utilizando las colonias blancas que dieron positivo para el análisis de PCR y como

control de sensibilidad positiva a la cepa E. coli DH5α.

4.13.- Secuenciación del sistema productor de la microcina 24

La secuenciación del sistema se realizó sobre los plasmidios pKAR, pIN y pGOB18.

La secuenciación de estos plasmidios se realizó por Macrogen Inc. (Korea) usando la

técnica “Walking Primer”. Esta técnica consta de tres etapas; Primero, una pareja de

partidores (suministrados por los usuarios) se aparean en la región que franquean al

gen a secuenciar, en una reacción de PCR. Segundo, los pequeños fragmentos

generados en la etapa anterior son secuenciados mediante el método de terminación

de cadenas. Por último, los resultados de las secuencias del paso anterior se utilizan


para generar nuevos partidores para continuar secuenciando el DNA. Debido a que

los genes se clonaron en pGEM-T, para la primera etapa de amplificación se

emplearon los partidores SP6 y T7. Los resultados de las secuencias fueron

analizados con el programa ContigExpress de Vector NTI.

4.14.- Ensayo de viabilidad celular mediante fluorescencia

El ensayo de viabilidad celular se realizó utilizando el sistema comercial de

viabilidad bacteriana LIVE/DEAD®

BacLight. Este sistema comercial contiene dos

fluoróforos, que poseen la habilidad de unirse al DNA; SYTO 9®

que ingresa a la

bacteria por un receptor específico y Yoduro de propidio que no puede ingresa a la

bacteria, a menos que ésta pierda la integridad de su membrana interna. El ensayo se

realizó según las recomendaciones del fabricante. Se cultivó una cepa de E. coli

DH5α en 30 mL de caldo LB hasta una DO600 de 0,6. Posteriormente las bacterias se

centrifugaron y se lavaron en una solución 0,85 % NaCl, concentrándolas finalmente

a 2 mL. Se trató 1 mL de esta suspensión con microcina 24 durante 1 hora y 1 mL

restante fue usado como control utilizando las mismas diluciones. Se preparó la

tinción fluorescente mezclando los colorantes Yoduro de Propidio y SYTO 9

suministrado por el proveedor, en partes iguales y agregando 3 µL de esta mezcla por

cada 1 mL de suspensión de bacterias. Esta mezcla se dejó incubar durante 15

minutos en oscuridad y finalmente se observó una alícuota de 5 µL de ésta en el

microscopio de fluorescencia. La medición fluorescente se realizó excitando la

muestra a una longitud de onda de 470 nm y midiendo la emisión a longitudes de

onda de 530 nm para la fluorescencia verde del SYTO 9 y 640 nm para la

fluorescencia roja del Yoduro de Propidio.

La superposición de imágenes se realizó con el programa ImageJ (Image Processing

and Analysis in Java) desarrollado en National Institute of Health (Collins, 2007).


4.15.- Análisis estadístico

Los experimentos de medición de la sensibilidad de las mutantes se realizaron por

quintuplicado. El análisis estadístico se realizó aplicando la Prueba-T al valor medio

y a la desviación estándar de las medidas de sensibilidad, empleando el programa

para análisis estadísticos ON-Line SISA (Simple Interactive Statistical Analysis),

desarrollado por Daan Uitenbroek (www.quantitativeskills.com/sisa/). El intervalo de

confianza utilizado para validación de la prueba fue de un 95 % y un 99 % (con un p

< 0,05 y p < 0,01 respectivamente).

Resultados. 36

5.- RESULTADOS

5.1.- Caracterización del péptido antimicrobiano Microcina 24

Como se describió anteriormente, todas las microcinas conocidas se producen en

fase estacionaria de crecimiento, a excepción de la microcina E492 que comienza a

producirse en fase exponencial (de Lorenzo y cols., 1984) y cuyo mRNA se

transcribe tanto en fase exponencial como estacionaria de crecimiento (Corsini y

cols., 2002).

Con el objetivo de caracterizar la expresión de la microcina 24, se realizaron

experimentos de transcripción inversa acoplados a PCR y ensayos de actividad de

sobrenadantes de E. coli MC1061pGOB18, en distintas etapas de crecimiento, sobre

un césped sensible de E. coli DH5α.

5.1.1.1.- La microcina 24 se produce en fase exponencial de crecimiento

Para determinar en qué fase del crecimiento bacteriano se produce la microcina

24 activa, se analizaron extractos del sobrenadante de un cultivo bacteriano productor

de microcina 24, E. coli MC1061pGOB18, mediante ensayos de actividad

antimicrobiana en placa, empleando un césped de E. coli DH5α.

Se analizaron sobrenadantes de E. coli MC1061pGOB18 cultivada en medio

nutritivo, Mueller-Hinton, LB y M63 suplementada con glucosa a diferentes etapas

de la curva de crecimiento (Figura 5). En todos los casos, los resultados mostraron

que las alícuotas tomadas durante la fase exponencial de crecimiento del cultivo

presentaron actividad antimicrobiana, lo que indica que la microcina 24 se comienza

a producir durante la fase exponencial de crecimiento.

Resultados. 37

Figura 5: Producción de Microcina 24 durante el crecimiento de E. coli MC1061pGOB18. Se determinó la actividad de la microcina 24 mediante ensayos de actividad de sobrenadantes de

cultivos productores de microcina 24 sobre un césped indicador. (A) Ensayo en medio nutritivo. (B)

Ensayo en medio Mueller-Hilton. (C) Ensayo en medio LB. (D) Ensayo en medio M63. La línea

continua indica la densidad óptica del cultivo, mientras que la línea discontinua indica la actividad de

los sobrenadantes del cultivo productor de la microcina 24.

5.1.1.2.- El gen estructural de la microcina 24 y el gen que codifica para su

proteína de inmunidad forman una unidad transcripcional, que se expresa en

fase exponencial de crecimiento

Debido a que el gen de la microcina 24 (mtfS) y el de su inmunidad (mtfI) se

encuentran sobrepuestos en 7 pb, es muy probable que formen una sola unidad

transcripcional. Para probar si estos genes están acoplados transcripcionalmente se

realizaron estudios de RT-PCR. Para esto, en la etapa de transcripción inversa, se

utilizó un partidor ubicado río abajo del gen mtfS (partidor S2, Figura 6 A, Tabla

III). El cDNA obtenido en esta etapa se utilizó como templado para una reacción de

PCR, utilizando la pareja de partidores que amplificarían ambos genes (pareja de

partidores IN1 y S2, Figura 6 A, Tabla III). Los resultados obtenidos utilizando el

RNA extraído a partir de la cepa productora de microcina 24, E. coli

MC1061pGOB18 en etapa exponencial y en etapa estacionaria de crecimiento

(Figura 6 B), indican que ambos genes se transcriben juntos en una sola unidad

transcripcional bicistrónica, tanto en fase exponencial como en fase estacionaria de

A B

C D

Resultados. 38

crecimiento, a diferencia de la gran mayoría de microcinas que se expresan sólo en

fase estacionaría de crecimiento bacteriano.

Para poder comparar las reacciones de RT-PCR realizadas con RNA extraído de

cultivos crecidos hasta fase exponencial y fase estacionaria se utilizó como estándar

interno la expresión del gen de la β-lactamasa presente en el plasmidio pGOB18

(Figura 6 C).

Figura 6: Expresión transcripcional de los genes mtfI y mtfS mediante RT-PCR. RNA total extraído en fase exponencial y estacionaria de crecimiento de E. coli MC1061pGOB18. El

panel (A) muestra la disposición de los partidores sobre el sistema génico de la microcina 24. El panel

(B) muestra la expresión de gen mtfI (carriles 1 y 3) y de la unidad mtfSI (carriles 2 y 4) en fase

exponencial y estacionaria de crecimiento. El panel (C) muestra la expresión del gen bla en fase

exponencial (carriles 1 y 3) y estacionaria de crecimiento (carriles 2 y 4) en cultivos de E. coli

MC1061pGOB18. Para la etapa de transcripción inversa se utilizó el partidor AMP2. Para la etapa de

PCR se utilizó la pareja de partidores AMP1 y AMP2. La electroforesis se efectuó en un gel de agarosa

1,5 %, utilizando como marcador de tamaño de bandas el ladder 1 Kb de Winkler Ltda.

5.1.2.- Purificación de la microcina 24

5.1.2.1.- Purificación mediante cromatografía en columna hidrofóbica C18

Las características generales de las microcinas indican que éstas son resistentes a

condiciones adversas como temperatura y pH extremos, presentan resistencia a ciertas

proteasas y son solubles en solventes orgánicos como metanol o acetonitrilo (Kolter

y cols., 1992).

A

B

C

Resultados. 39

Basado en estas características, se desarrolló un esquema de purificación de la

microcina 24 a partir de sobrenadantes de un cultivo de E. coli MC1061pGOB18

crecido hasta fase exponencial tardía de crecimiento. Este sobrenadante se cargó

sobre una columna hidrofóbica Sep-Pack C18 y posteriormente se eluyó la microcina

24 con concentraciones crecientes de metanol, según lo descrito en materiales y

métodos. Se analizó la actividad de las fracciones obtenidas de la columna,

determinando su capacidad de generar halos de inhibición (zonas mas claras en el

césped) de crecimiento sobre un césped de E. coli sensible a la acción de la microcina

24 (Figura 7 A). Posteriormente se realizó una electroforesis desnaturante en geles de

poliacrilamida (SDS-PAGE) para comprobar la presencia de la proteína en las

fracciones que presentaron actividad (Figura 7 B).

Los resultados muestran que la microcina 24 es un péptido con una

hidrofobicidad elevada, puesto que comienza a eluír a partir de la fracción que

contiene un 70 % de metanol. La masa deducida por el SDS-PAGE indica que la

microcina 24 es un péptido de aproximadamente de 7 kDa.

Figura 7. Purificación de la microcina 24 mediante cromatografía en columna hidrofóbica Sep-Pak C18. El sobrenadante de cultivos de E. coli MC1061pGOB18 se cargó en una columna hidrofóbica

Sed-Pack C18 y se eluyó posteriormente con metanol a concentraciones crecientes; 20, 50, 60, 70, 80 y

95 %. (A) Detección de actividad de la microcina 24 mediante ensayos de actividad en placa,

representada por halos de inhibición de crecimiento. Alícuotas de 10 µL de cada fracción se

adicionaron sobre un césped sensible de E. coli DH5α. El control corresponde a una colonia de E. coli

MC1061pGOB18 generando un halo de inhibición. (B) Electroforesis desnaturante en geles de

poliacrilamida (SDS-PAGE) de eluídos de columna Sed-Pack C18 teñidos con fluorescamina. La flecha

indica la microcina 24 purificada. Carril 1, estándar de masa molecular; Carril 2, fracción eluída a 70

% de metanol; Carril 3, fracción eluída al 80 % de metanol; Carril 4, fracción eluída al 95 % de

metanol.

Resultados. 40

5.1.2.2.- Purificación de la microcina 24 mediante HPLC

La purificación de la microcina 24 mediante HPLC se realizó a partir de la

fracción que contiene 95 % de metanol eluída de la columna Sep-Pak C18. La

microcina 24 se eluyó desde la columna con una fracción de acetonitrilo al 40 % y se

recolectaron fracciones del eluído de la columna cada un minuto. El perfil de elución

indica que a partir del minuto 15 comienza a eluír un compuesto (Figura 8 A). Para

vincular al compuesto eluído desde la columna a partir del minuto 15 con la

microcina 24, cada una de las fracciones eluídas fueron ensayadas por su capacidad

de formar halos de inhibición de crecimiento sobre un césped sensible (Figura 8 B).

Se determinó que es la microcina 24 quien comienza a eluír a partir del minuto 15 y

se mantiene hasta el minuto 21. Por último, a cada una de estas fracciones se le

realizó un SDS-PAGE, teñidas posteriormente con fluorescamina según lo descrito en

Materiales y Métodos, para verificar la presencia de proteína (Figura 8 C). Los

resultados del SDS-PAGE muestran a la microcina a partir del minuto 15, y su masa

no presenta mayor diferencia a la determinada anteriormente.

Figura 8. Purificación de la microcina 24 mediante HPLC. (A) Perfil de elución de la fracción 95

% metanol de la columna Sed-Pack C18. Se empleó una columna C8 y una elución isocrática de

acetonitrilo 40 %. (B) Detección de la actividad microcina 24 mediante ensayos en placa de diferentes

fracciones recolectadas de la cromatografía HPLC, representada por halos de inhibición de

crecimiento. (C) Electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS de las fracciones del minuto 14 a 22

recolectadas de la cromatografía HPLC. Las muestras se tiñeron con fluorescamina.

Resultados. 41

5.1.3.- Espectrometría de masa de la microcina 24

Según lo publicado en GenBank, la microcina 24 se sintetiza como una

preproteína de 90 aminoácidos. Esta proteína sufre un corte proteolítico en el

momento de ser exportada, generando una proteína de 74 aminoácidos, con una masa

teórica de 7527,36 Da. La microcina 24 purificada mediante HPLC fue sometida a

espectrometría de masa. Los resultados indicaron que la microcina 24 posee una masa

molecular de 7274 Da (Figura 9). Esta masa experimental obtenida no concuerda con

los datos teóricos deducidos a partir de la secuencia génica de la microcina 24

publicados en el GenBank. Basados en la secuencia publicada, la masa molecular de

la microcina 24 determinada experimentalmente es de 253,13 Da menos que la masa

teórica deducida.

Figura 9. Espectrometría de masa MALDI-TOF de la microcina 24. El espectro equivale a

espectros sumados correspondientes a 10 barridos de 40 shots de láser aplicados en diferentes puntos

tomados al azar.

5.1.4.- Secuenciación del sistema microcina 24

5.1.4.1.- Secuenciación del gen mtfS

La masa experimental obtenida mediante espectrometría de masa es menor por

253,13 Da a la esperada según los datos de la secuencia obtenidas en la base de datos

Genbank (U47048). Para determinar la razón de esta divergencia se decidió volver a

secuenciar completamente el sistema productor de la microcina 24.

Los resultados de la secuenciación revelan tres diferencias correspondientes a tres

guaninas en el gen estructural de la microcina 24, que no estaban presentes en la

secuencia publicada originalmente en Genbank. La primera diferencia se observó

después del nucleótido de citosina118

(posición 118 de la zona codificante del gen

Resultados. 42

mtfS), afectando el triplete que codificaba originalmente para el aminoácido prolina

(C118

C119

C120

), modificándolo por C118G119

C120

, triplete codificante para el

aminoácido arginina (Figura 10 A). La segunda diferencia se observó 18 nucleótidos

río abajo de la primera y, finalmente, la tercera discrepancia se observó 11

nucleótidos río abajo de la segunda (Figura 10 A). Estas tres discrepancias producen

un corrimiento del marco de lectura en una región de 30 pares de bases, entre la

primera y la última, correspondientes a 10 aminoácidos de la región central de la

microcina 24 (Figura 10 B). Esto genera una proteína diferente con 91 aminoácidos y

un 89 % de identidad a la publicada en el GenBank, la cual, al ser procesada

proteolíticamente se forma una proteína madura de 75 aminoácidos con una masa

teórica de 7293 Da. El gen que codifica para esta microcina de 75 residuos fue

renombrado como mcnN (GenBank FJ895580).

Este valor se asemeja al valor experimental de 7274 Da obtenido por

espectrometría de masa (una diferencia de sólo 18,79 Da menos comparados con el

valor teórico de la nueva microcina 24).

5.1.4.2.- Análisis informático del motivo de corte proteolítico de la microcina 24

La microcina 24 es sintetizada como una pre-proteína de 91 aminoácidos como se

indica en la Figura 10 B. Esta proteína presenta un péptido señal con un motivo de

doble glicina típico de las microcinas que son procesadas y exportadas por

transportadores tipo ABC; sin embargo, adyacente presenta también el motivo

glicina-alanina que permite el procesamiento y la exportación de la microcina E492.

Esta característica de poseer ambos motivos conservados de corte (GG y GA) es

compartida también por la microcina V (CvaC), sin embargo su transportador CvaB

reconoce el motivo GG y realiza el corte proteolítico luego de este. Debido a esto, se

cree que la microcina 24 es procesada por su transportador McnB en el motivo GG a

pesar de poseer la alternativa GA. Para descubrir el lugar de procesamiento de la

microcina se propuso un análisis informático, alineando las microcinas del grupo II y

los dominios peptidasa C39 de sus transportadores.

Resultados. 43

Figura 10. Alineamiento de secuencias publicada en Genbank U47048 y FJ895580. En (A), se presenta un alineamiento entre la secuencia nucleotídica de la microcina 24 publicada en

Genbank U47048 y la microcina 24 secuenciada Genbank FJ895580. Se señalan tres guaninas

presentes en la secuencia del gen mcnN. En (B) muestra un alineamiento de secuencia primaria de la

microcina 24 publicada en GenBank con la secuencia aminoacídica de la microcina 24 deducida a

partir del DNA secuenciado. Se destaca la región central de la microcina 24 que presenta cambio. Se

destaca en (B) con un rectángulo el motivo doble glicina del péptido señal.

El resultado del alineamiento de las secuencias de las microcinas del grupo II

indicó una diferencia en el tamaño del péptido líder de la microcina 24, con respecto

al resto de las microcinas del tipo II, pero un análisis de la región próxima al codón

de inicio de la traducción reveló que existe un segundo codón de inicio de la

traducción que presenta una mejor secuencia Shine-Dalgarno (Figura 11).

Esto sugiere que la microcina comienza a traducirse a partir del segundo ATG,

generando una pre-proteína de 89 aminoácidos y no a partir del primero como está

descrito en Genbak para la microcina 24 (código de acceso Q46971).

A

B

Resultados. 44

Figura 11. Análisis de la región próxima al codón de inicio de la traducción de la microcina 24. La figura ilustra los dos posibles codones de inicio de la traducción presentes en la microcina 24. Se

destaca además una secuencia Shine-Dalgarno consenso para el segundo codón de inicio.

El inicio de la traducción a partir del segundo ATG permite un mejor

alineamiento con la secuencia consenso de la señal de exportación de las microcinas

tipo II (Figura 12).

Figura 12. Alineamiento múltiple entre secuencias de Microcinas tipo II sin procesar.

Alineamiento múltiple entre las secuencias amino terminal de las microcinas tipo II. McmA

corresponde a la microcina M (acceso N° Q83TS1), MchS2 corresponde a la microcina I47 (acceso N°

Q712Q0), CvaC corresponde a la microcina V (acceso N° P22522), MceA corresponde a la microcina

E492 (acceso N° Q9Z4N4), MchB corresponde a la microcina H47 (acceso N° P62530), MclC

corresponde a la microcina L (acceso N° Q841V4) y McnN corresponde a la microcina 24 (acceso N°

C3VUZ5). Se destaca además el sitio de corte proteolítico en diferentes microcinas exportadas por el

sistema ABC.

Analizando los sitios de corte de las microcinas tipo II es posible encontrar un

patrón de corte en el residuo 15 que se repite en todas las microcinas tipo II (Figura

12). A pesar que la microcina V (CvaC) posee ambos motivos de corte (GG y GA) la

posición 15 corresponde a un corte en GG. Este patrón de corte en el residuo 15 del

alineamiento se debe probablemente a la elevada similitud que presentan los

dominios C39 peptidasa de los transportadores de las microcinas tipo II (Figura 13).

Como indica la Figura 13 existe conservación en la región próxima a los residuos

catalíticos de los dominios C39, incluyendo dicho dominio del transportador McnB

de la microcina 24.

Procesamiento

proteolítico

Resultados. 45

En función a esto, es posible estimar que el sitio de corte proteolítico de la

microcina 24 ocurre en el residuo 15 (al igual que el resto de las microcinas tipo II)

que corresponde al motivo GA.

Figura 13. Alineamiento múltiple entre los dominios peptidasa C39 de las proteínas exportadoras de las microcinas tipo II. Se destaca con un asterisco rojo los residuos catalíticos

involucrados en el corte proteolítico y con un rectángulo la cisteína que genera el corte. McnB

corresponde al exportador de la microcina 24, MceG corresponde al exportador de la microcina E492,

CvaB corresponde al exportador de la microcina V y MchF corresponde al exportador de la microcina

H47.

5.1.4.3.- Secuenciación de los genes mdbA, mtfI, mtfA y mtfB

La secuenciación del sistema productor de microcina arrojó dos diferencias en el

gen mdbA como indica la Figura 14. La primera de ellas ocurrió luego del nucleótido

adenina A302

del alineamiento, en ella se observa un nucleótido de adenina que no

estaba presente originalmente en la secuencia publicada en Genbank (Figura 14). La

presencia de esta adenina adicional en la secuencia generó un corrimiento del marco

de lectura que afectó la secuencia aminoacídica a partir del aminoácido Lisina K101

de

la proteína codificada por mdbA, generando además un codón de término temprano

T433

G434

A435

, produciendo una proteína de 144 (Figura 15) a diferencia de los 171

*

*

*

Resultados. 46

aminoácidos descritos para la proteína MdbA (GenBank acceso AAA88770.1). Este

gen fue renombrado como mcnR. La secuencia del gen mcnR generaría la proteína

McnR de 144 aminoácidos con un 99 % de identidad con la proteína ACA51174 de

Salmonella enterica subs. Enterica serovar Dublin y con la proteína codificada por el

ORF 16 del plasmidio pOLA52. Esta proteína McnR presenta un dominio

conservado PRK10947 entre los residuos 19 y 142 que corresponde a un dominio de

unión a DNA regulador transcripcional presente en la familia de reguladores H-NS

(Figura 16). La segunda diferencia se observó luego del nucleótido Citosina C304

en

el gen mdbA, el residuo en posición 305 cambió de Citosina a Guanina. Este cambio

produce una secuencia GCG, originalmente GCC, que en el gen mcnR no implicaría

un cambio de aminoácido, ya que ambos codones codifican para alanina. Las

proteínas H-NS pueden unirse a motivos de DNA cuyo consenso es TCGATAAATT

(Lang y cols., 2007). Analizando la secuencia del sistema productor de la microcina

24 en busca de motivos de unión a H-NS, se encontró 7 posibles regiones de unión,

como se indica en la tabla IV y la Figura 17. La posición de los motivos encontrados

en la secuencia de la microcina 24 corresponde a la ubicación según la secuencia

publicada en GenBank FJ895580.

Los resultados de la secuenciación de los genes mtfI y mtfB no arrojaron

diferencias con la secuencia U47048. Sin embargo, fueron renombrados como mcnI y

mcnB respectivamente, en función al nombre de la secuencia de la microcina y de la

proteína reguladora (mcnN y mcnR). Los resultados de la secuenciación del gen mtfA

arrojaron una diferencia en el nucleótido Guanina G944

del gen, cambiando a Adenina

A944

. Este cambio genera una modificación de la proteína de ácido glutámico E315

a

glicina G315

.

Resultados. 47

Figura 14. Alineamiento entre las secuencias del gen mdbA y mcnR. Se presenta un alineamiento entre la secuencia del gen mdbA Genbank U47048 y el gen mcnR

Genbank FJ895580. Se indica el nucleótido de Adenina presente luego del nucleótido adenina A302

y el

cambio de Citosina por Guanina.

Figura 15. Alternativas de traducción de la secuencia mdba y la re-secuenciación mcnR. La figura

ilustra las dos alternativas de traducción que generó la diferencia entre los genes mdbA y mcnR. Se

indica el codón TGA generado en la secuencia del gen mcnR

Resultados. 48

Figura 16. Alineamiento entre la proteína McnR y el dominio PRK10947. Alineamiento entre la

secuencia primaria de la proteína McnR y el dominio PRK10947, con un E-value de 5e-12

.

Tabla IV. Motivos de unión a DNA para las proteínas H-NS

Secuencia Ubicación

TCGATAAATT Consenso

I CAGATAAATC 0742 – 0733

II AAGATAAAAC 1054 – 1045

III ACGATAAAAA 1070 – 1061

IV CTGATAAACA 1691 – 1700

V CAGATAAATT 2124 – 2115

VI CTGATAAACA 2541 – 2550

VII GCGATAAAGC 5126 – 5135

Figura 17. Ubicación de los motivos de unión de proteínas H-NS sobre el sistema productor de la microcina 24. Las barras perpendiculares en azul corresponden a los motivos de unión de H-NS sobre

el sistema productor de la microcina 24. La barra perpendicular azul ubicada en el gen mcnI

corresponde a dos motivos de unión muy próximos.

Resultados. 49

5.2.- Mecanismo de acción del péptido antimicrobiano microcina 24

Debido al alto porcentaje de identidad entre la microcina 24 y la microcina E492,

correspondiente a un 48,1 %, la microcina 24 se clasifica entre las microcinas

formadoras de poros, pero no existe evidencias que avalen dicho mecanismo. A fin de

esclarecer el mecanismo de acción de la microcina 24, se realizaron ensayos de

actividad β-galactosidasa y recuento de células viables.

5.2.1.- La microcina 24 permeabiliza la membrana interna de las bacterias

sensibles

Como primer paso en la determinación del mecanismo de acción de la microcina

24, se realizaron ensayos de actividad β-galactosidasa sobre E. coli HB101. Esta cepa

contiene intacto el gen de la β-galactosidasa pero carece del transportador de los

galactosidos por lo tanto, esta bacteria no es capaz de utilizar la lactosa como única

fuente de carbono, ni internalizar derivados galactósidos como el 5-bromo-4-cloro-3-

indoyl-β-D-galactosido (X-gal) o el o-nitrofenilgalactopiranosido (ONPG). El ensayo

se realizó midiendo la formación del o-nitrofenol, a partir del ONPG, cada 15

minutos después de la adición de la microcina 24 a la cubeta que contiene la E. coli

HB101 y el sustrato ONPG, según lo descrito en Materiales y Métodos.

Los resultados muestran que las células de E. coli HB101 tratadas con Microcina

24 son capaces de hidrolizar el ONPG, lo que revela que la microcina 24

permeabiliza la membrana interna de la bacteria indicadora, permitiendo el ingreso

del sustrato al interior de la célula (Figura 18). La figura muestra además un rápido

efecto en la permeabilización de la membrana, siendo este efecto significativo a partir

de los 30 minutos al comparar la bacteria tratada con microcina 24 y la bacteria

control incubada sin microcina 24. Este efecto aumenta con el tiempo, lo que indica

que no hay recuperación del daño en la membrana interna, puesto que el ONPG sigue

siendo hidrolizado.

La permeabilización de la membrana interna no implica necesariamente la muerte

de la bacteria, a pesar que el daño se mantiene en el tiempo.

Resultados. 50

Figura 18. Ensayos de permeabilidad de células de E. coli HB101 con microcina 24. Células de E.

coli HB101 se incubaron con microcina 24 (línea continua) y sin microcina 24 (línea segmentada). Se

midió la actividad β-galactosidasa a distintos tiempos, empleando como sustrato ONPG. La diferencia

es significativa a partir del minuto 30 con un p < 0,05.

5.2.2.- La microcina 24 genera disminución del número de células viables

Como segundo paso a la determinación del mecanismo de acción de la microcina

24, se determinó si la permeabilización generada en la membrana interna afecta la

viabilidad de las bacterias en cultivo. Para medir la muerte bacteriana se realizaron

ensayos de viabilidad celular sobre E. coli DH5α. El recuento de células viables se

realizó por medio de diluciones seriadas, según lo descrito en Materiales y Métodos, a

partir de la inoculación de la microcina 24 a un cultivo planctónico. Los resultados

muestran que la microcina 24 disminuye el recuento de células viables del cultivo

(Figura 19). La muerte generada por la microcina 24 a las 3 horas de incubación,

disminuye en un 40 % el recuento de bacterias con respecto al número de células

iniciales (tiempo 0). En contraste, el cultivo no tratado aumentó 300 % el número de

bacterias con respecto al número de células iniciales (tiempo 0).

Los resultados obtenidos hasta el momento indican que la microcina 24

permeabiliza la membrana interna de la bacteria sensible generando la muerte de

éstas.

Resultados. 51

Figura 19. Ensayos de viabilidad Celular. El gráfico indica el porcentaje de bacterias vivas

luego de incubarlas 3 horas con la microcina 24 (barra segmentada), comparadas con un control

tratado solo con amortiguador (barra negra). Los resultados al cabo de tres horas se contrastan con el

número de células viables presentes al inicio del ensayo. Los análisis estadísticos se realizaron sobre el

número de células viables a las tres horas de incubación, en relación con el número de células viables a

tiempo 0. * p < 0,05; ** p < 0,01.

5.2.3.- La permeabilización realizada por la microcina 24 genera un gran daño

en la membrana citoplasmática

El daño en la membrana generado por la acción de la microcina 24 fue evaluado

mediante microscopía de fluorescencia utilizando los fluoróforos SYTO 9 y Yoduro

de Propidio (PI) incluidos en el sistema comercial de viabilidad bacteriana

LIVE/DEAD BacLight. Estos compuestos fluorecen cuando se unen al DNA. Los

resultados se observan en la Figura 20. En el panel A se muestran los resultados de la

incubación de la cepa de E. coli DH5α, tratada con amortiguador sin microcina 24.

El fluoróforo SYTO 9 entra a las bacterias vivas por receptores específicos y una vez

dentro de la bacteria puede unirse al DNA. Este complejo es excitado a 470 nm y

emite a 530 nm, correspondiente a la florescencia verde observada en A. En B, se

observa la entrada del colorante PI debido al daño natural en la membrana de la

bacteria control. La entrada de PI a la bacteria genera competencia por la unión al

DNA entre el SYTO 9 y el PI, desplazando este último al SYTO 9 generando una

*

**

Resultados. 52

disminución de la fluorescencia verde. Al ser excitado a 470 nm el PI emite

fluorescencia a 640 nm correspondiente a la emisión roja observada en B. En C una

superposición de las imágenes A y B muestran en el mismo campo las células vivas y

las células dañadas, observándose que la gran mayoría de las células se encuentran

vivas sin daño en la membrana. En D se muestra los resultados de la fluorescencia

verde en células tratadas durante 3 horas con microcina 24, observándose además una

clara disminución de la fluorescencia verde en contraposición al control sin tratar con

microcina 24. En E el gran aumento de la fluorescencia roja revela un considerable

daño en la membrana, generado por la exposición a la microcina 24, por el cual hace

ingreso a la bacteria el PI. El color amarillo que se observa en F es debido a la

colocalización de las fluorescencia verde y roja de las imágenes D y E.

Figura 20. Microscopía de fluorescencia de E. coli tratada con microcina 24. Para obtener las imágenes de microscopía se utilizaron los fluoróforos yoduro de propidio

(fluorescencia roja) y SYTO 9 (fluorescencia verde). En (A) la fluorescencia del SYTO 9 en células

tratadas con amortiguador sin microcina 24. En (B) la fluorescencia del yoduro de Propidio en células

tratadas con amortiguador sin microcina 24. En (C) una superposición de ambas imágenes. En (D) células tratadas con microcina 24 medidas en el espectro de emisión del SYTO 9. En (E) células

tratadas con microcina 24 medidas en el espectro de emisión del Ioduro de Propidio. En (F), una

superposición de las imágenes D y E.

Resultados. 53

5.3.- Relación entre el sistema de transporte del ferricromo hidroxamato y la

microcina 24

Los datos experimentales demuestran que la microcina 24 no utiliza ninguno de

los receptores involucrado en el reconocimiento y captura de la microcina E492

(proteínas FepA, Fiu y Cir) (Patzer y cols., 2003). Sin embargo, mutantes en TonB

son completamente resistentes a la microcina 24 (Patzer y cols., 2003), por lo que el

receptor para la microcina 24 debe ser un proteína involucrada en el transporte de

hierro que requiera de TonB.

5.3.1.- La microcina 24 utiliza el receptor fhuA

Para relacionar al receptor del ferricromo hidroxamato en la captura y transporte

de la microcina 24 se realizó ensayos de actividad antimicrobiana en placa,

empleando tres cepas de E. coli mutantes en fhuA. Estas cepas son E. coli P8 una

derivada fhuA- de la cepa E. coli AB2847, E. coli JM110 y E. coli C600. Este ensayo

de actividad antimicrobiana con cepa productora de microcina 24 se realizó según lo

descrito en Materiales y Métodos. En la Figura 21 se compara su sensibilidad frente

a una cepa de E. coli DH5α control. Los resultados revelan una pérdida total de la

sensibilidad hacia la microcina 24 en las cepas fhuA-.

Figura 21. Sensibilidad de cepas de E. coli mutantes en fhuA. La figura ilustra la sensibilidad

de diferentes cepas de E. coli hacia la microcina 24. En A el halo de inhibición alrededor del disco

señala la sensibilidad de una cepa de E. coli DH5α. En B se ilustra la sensibilidad de una cepa de E.

coli P8 derivada de la cepa E. coli AB2847. En C se muestra la sensibilidad de la cepa de E. coli

JM110. En D se muestra la sensibilidad de la cepa E. coli C600.

Resultados. 54

5.3.2.- Participación del sistema FhuCDB

Como último paso en la dilucidación del mecanismo de acción de la microcina 24

se estudio la participación del sistema de transporte del ferricromo hidroxamato.

El sistema de transporte del ferricromo hidroxamato cuenta con 4 genes

distribuidos en un operón (Figura 22). Este sistema es capaz de captar el complejo

hierro-ferricromo desde el medio extracelular y transportarlo hacia el citoplasma,

según lo descrito anteriormente. Considerando que la microcina 24 utiliza el mismo

receptor FhuA del ferricromo y que además FhuD se encuentra en el periplasma

interactuando con FhuA y TonB (Carter y cols., 2006), nos preguntamos si ¿la

microcina 24 utilizará el sistema completo de transporte del sideróforo ferricromo

hidroxamato?

Figura 22. Operón fhu. Estructura del operón fhu compuesto por los genes fhuA, fhuC, fhuD y fhuB.

Para estudiar la participación del sistema de transporte del ferricromo

hidroxamato en el reconocimiento e inserción de la microcina 24 en la membrana

interna, se eliminaron los genes fhuC, fhuD y fhuB del operón fhu dejando intacto el

gen fhuA. Esta deleción se realizó mediante la técnica desarrollada por Datsenko y

Wanner (2000), que utiliza el sistema de recombinasa del fago Lambda red (genes γ,

β y exo) para insertar en el cromosoma bacteriano un trozo de DNA lineal generado

por PCR a partir del plasmidio pKD4, descrita en Materiales y Métodos.

5.3.3.- Mutaciones en el sistema de transporte del ferricromo diminuye la acción

de la microcina 24

Se generó una E. coli BW25113 mutante, carente de los genes fhuCDB,

denominada E. coli S100, fue generada utilizando la técnica de Wanner. Esta mutante

Resultados. 55

fue verificada mediante PCR utilizando la pareja de partidores F-k2 y R-fhuB-P2, que

generaría un amplicón de 952 pb en una mutante. El producto de la PCR fue sometido

a una electroforesis de DNA en gel de agarosa al 1% (Figura 23 A), en cuyo primer

carril se cargó el estándar de DNA de 1 kb. El segundo carril corresponde a la PCR

de la mutante E. coli BW25115 con los partidores F-k2 y R-fhuB-P2. La banda de

aproximadamente 900 pb indica que se generó una mutante con los genes fhuCDB

delecionados. En el tercer carril, una PCR fue realizada con los mismos partidores F-

k2 y R-fhuB-P2 sobre una E. coli BW25113 silvestre. En este caso no hay

amplificación, lo que verifica que la banda observada en el segundo carril

corresponde al amplicón de la mutante carente de los genes fhuCDB.

En el siguiente paso se midió la sensibilidad de esta mutante frente a una cepa de

E. coli productora de microcina 24 (Figura 23 B y C). Los resultados muestran que

al mutar los genes fhuCDB se pierde sensibilidad a la microcina 24 generada por la

colonia de E. coli MC1061pGOB18 en el centro de la imagen (Figura 23 B), en

contraste a lo observado en una E. coli BW25113 silvestre, cuya notable sensibilidad

a la microcina 24 se aprecia en la formación de un gran halo de inhibición de

crecimiento alrededor de la colonia de E. coli MC1061pGOB18 (Figura 23 C).

Figura 23. Mutante carente de los genes fhuCDB realizada mediante la técnica de Wanner. A) verificación de la mutante mediante PCR utilizando la pareja de partidores F-k2 y R-fhuB-P2. En el

primer carril se encuentra el ladder de 1 kb, la banda de aproximadamente 900 pb en el carril 2

corresponde al amplicón de 952 pb. En el tercer carril, la misma pareja de primer utilizada en una

reacción de PCR sobre la cepa BW25113. B) Sensibilidad de la cepa E. coli BW25113 mutante hacia

la microcina 24, generada por una colonia de E. coli MC1061pGOB18. C) Sensibilidad de la cepa

silvestre de E. coli BW25113 a la microcina 24 generada por una colonia de E. coli MC1061pGOB18

Resultados. 56

Los resultados mostrados hasta ahora indican que el sistema FhuC, FhuB y FhuD

está relacionado en el mecanismo de acción de la microcina 24, pero no indica de qué

manera están involucrados cada uno de ellos. Para responder esta interrogante, se

utilizó las mutantes individuales del sistema fhuCDB creadas por Tomoya Baba y

cols. en la Universidad de Keio, Ciudad de Tsuruoka, Yamagata, Japón, (colección

Keio, Baba y cols., 2006).

5.3.4.- Sólo FhuB y FhuD están involucrados en el mecanismo de acción de la

microcina 24

Se analizaron mutantes individuales de cada uno de los componentes del sistema

de transporte del ferricromo hidroxamato, incluyendo la mutante del gen fhuA en la

búsqueda de resistencia a la microcina 24.

Se inoculó E. coli MC1061pGOB18 en un césped de cada una de las mutantes del

sistema fhuACDB y se registró el halo generado por la sensibilidad a la microcina 24

(Figura 24). La cepa isogénica de E. coli BW25113 presenta una sensibilidad alta a

la microcina (Figura 24 A). Ésta se utilizó como patrón de comparación frente al

resto de las mutantes del sistema y se le asignó arbitrariamente un 100 % de

sensibilidad al diámetro del halo de inhibición generado frente a la microcina 24.

Bajo este parámetro se comparó el resto de las mutantes. Una mutante carente del

receptor FhuA es completamente resistente a la microcina 24 (Figura 24 B), mientras

que una mutante en el gen fhuC aparentemente no cambia su sensibilidad a la

microcina 24 (Figura 24 D). En contraste, una mutante en fhuB (Figura 24 C)

disminuye apreciablemente la sensibilidad hacia la microcina 24 y aún más una

mutante en fhuD (Figura 24 E).

Resultados. 57

Figura 24. Sensibilidad de las mutantes a la microcina 24. (A) sensibilidad de la cepa isogénica de

E. coli BW25113. (B) sensibilidad de la cepa de E. coli mutante en el gen fhuA. Se observa además el

desarrollo de la cepa productora de la microcina 24, que sobresale del disco. (C) sensibilidad de la

cepa de E. coli mutante en el gen fhuB. (D) sensibilidad de la cepa de E. coli mutante en el gen fhuC.

(E) sensibilidad de la cepa de E. coli mutante en el gen fhuD. Las flechas señalan el borde del halo de

inhibición de crecimiento generado por la cepa productora de microcina 24 en el disco.

Como se mencionó anteriormente, para poder comparar la sensibilidad de las

diferentes mutantes hacia la microcina 24, se midió el halo de inhibición de cada una

de ellas y se comparó con el halo generado en una cepa isogénica, de forma de

correlacionar las mutantes con la cepa isogénica (Figura 25). En el gráfico es posible

apreciar que las mutantes en los genes fhuB y fhuD pierden sensibilidad a la

microcina 24, disminuyendo en un 30 % y 40 % respectivamente su sensibilidad con

respecto al 100 % de sensibilidad de la cepa isogénica. Estas diferencias, al ser

analizadas mediante la prueba t, resultan significativa con un p < 0,01. En cambio, no

así en el caso de la mutante fhuC, cuya diferencia de sensibilidad con respecto a la

cepa isogénica E. coli BW25113 no resulta ser significativa.

Resultados. 58

Figura 25.- Sensibilidad de las mutantes del sistema fhu a la microcina 24. La mutación de los

genes fhuD y fhuB implicados en el transporte del ferricromo genera una mayor resistencia a la

microcina 24. La sensibilidad de las mutantes se expresó en función a la sensibilidad de la cepa

isogénica de E. coliBW25113. Para el análisis estadístico, cada una de las diferencias de las barras fue

comparada en función a la cepa isogénica (barra negra). ** p < 0,01.

5.3.5.- La complementación de las mutantes revierte el fenotipo de resistencia a

la microcina 24

Para demostrar que la pérdida de sensibilidad a la microcina 24 es debido a la

mutación en uno de los genes del sistema fhuACDB, se complementaron estas

mutantes con los respectivos genes clonados en pCA24N, un vector de bajo número

de copias (Kitagawa y cols 2005). Estos plasmidios fueron construidos ligando el

producto PCR del gen a clonar dentro del sitio StuI del vector pCA24N (Kitagawa y

cols 2005). Los resultados indican que al ser complementadas las mutantes con sus

respectivos genes, revierten el fenotipo de resistencia a la microcina 24, mostrándose,

en el caso de fhuA, incluso más sensibles que la cepa isogénica E. coli BW25113

(Figura 26).

** **

Resultados. 59

Figura 26. Sensibilidad a la microcina 24 de las mutantes del sistema fhu complementadas en trans. Ensayo de sensibilidad de las mutantes complementadas frente a una cepa de E. coli

MC1061pGOB18 productora de microcina 24 presente en los discos. (A) Sensibilidad de la mutante

fhuB complementada. (B) Sensibilidad de la mutante fhuC complementada. (C) Sensibilidad de la

mutante fhuD complementada. (D) Sensibilidad de la cepa isogénica BW25113. (E) Sensibilidad de la

mutante en fhuA complementada. Las flechas señalan el borde del halo de inhibición de crecimiento

generado por la cepa productora de microcina 24 en el disco.

Al complementar una mutante que carece del receptor FhuA, con el plasmidio

pJW0146 que lleva el gen fhuA y sobre-expresarlo, se observa un aumento desde 0

(Figura 24 B y Figura 26) hasta un 120 % de sensibilidad a la microcina 24 (Figura

26 E y Figura 27). En un segundo experimento, al complementar las mutantes en

fhuBDC con sus respectivos genes y sobre-expresarlos, se observa una recuperación

de la sensibilidad cercana a un 100 % en el caso de la mutante JW0149 fhuB-

complementada con pJW0149, plasmidio que lleva el gen fhuB. La mutante JW0148,

complementada con pJW0148, aumenta su sensibilidad a un 87 % con respecto a la

cepa isogénica. Este aumento de sensibilidad resulta significativo si se compara con

un 63 % de sensibilidad de la mutante JW0148 no complementada indicada en la

Figura 25, (aumento de 24 % de la sensibilidad de JW0148 con un p < 0,05). La

sensibilidad de la mutante JW0147 complementada con pJW0147 que lleva el gen

Resultados. 60

fhuC no aumenta significativamente con respecto al control de sensibilidad, ni con

respecto a la mutante JW0147 no complementada.

Figura 27. Sensibilidad de las mutantes del sistema fhu a la microcina 24 complementadas con sus respectivos genes. Las mutantes del sistema fhu recobran el fenotipo de sensibilidad a la

microcina 24 al ser complementadas. La sensibilidad de las mutantes complementadas se expresó en

función a la sensibilidad de la cepa isogénica de E. coli BW25113. Para el análisis estadístico, cada

una de las diferencias de las barras fue comparada en función a la cepa isogénica (barra negra); ** p <

0,01. En el caso de la mutante JW0148 complementada con fhuD, el valor de 88 % de sensibilidad se

comparó con el valor de 63 % de sensibilidad obtenido en el experimento de la figura 23, mostrando

un aumento significativo con un p < 0,05.

**

*

Discusión. 61

6.- DISCUSIÓN.

El objetivo central de esta tesis fue realizar una caracterización del péptido

antimicrobiano microcina 24 y determinar su mecanismo de acción. Para simplificar

el análisis se discutirán primero los resultados relativos a la caracterización de la

microcina 24, y posteriormente se discutirán los resultados relacionados con el

mecanismo de acción.

6.1.- Caracterización del péptido antimicrobiano microcina 24

Las microcinas son un grupo de bacteriocinas de bajo peso molecular (inferior a

10 kDa), no inducibles por el sistema SOS, producidas en fase estacionaria de

crecimiento (Riley y cols., 2002), a excepción de la microcina E492 que se produce

durante la fase exponencial (de Lorenzo y cols., 1984). Nuestros resultados indican que

la microcina 24 al igual que la microcina E492, se comporta distinto a las demás

bacteriocinas, dado que se produce durante la fase exponencial de crecimiento

(Figura 5). Este resultado se correlaciona con el resultado obtenido en el experimento

de RT-PCR (Figura 6), señalando que en un cultivo de E. coli MC1061pGOB18, en

fase exponencial, es posible encontrar un mRNA que contiene los genes involucrados

en la producción de la microcina 24 y también su inmunidad, lo que indica que ambos

genes se transcriben juntos en una sola unidad transcripcional bicistrónica. Como la

microcina 24 es una proteína activa sobre cepas de E. coli, al ser producida requiere

de un elemento que le entregue inmunidad a la cepa productora, de lo contrario, un

desequilibrio en la producción de microcina frente a inmunidad resultaría tóxico para

la cepa productora. Al estar los genes de la inmunidad y de la microcina 24 en un solo

mRNA bicistrónico, como indica la Figura 6, es posible tener control sobre la

cantidad de microcina versus la cantidad de proteína de inmunidad, puesto que según

la distribución en el mRNA la microcina 24 se expresa luego de su inmunidad. Esto

mantendría el equilibrio para que la microcina no resulte tóxica para la cepa

productora.

Discusión. 62

Considerando que todas las microcinas conocidas son solubles en solventes

orgánicos (Kolter y Moreno, 1992), se empleó cromatografía de fase reversa en

columnas hidrofóbicas (Sep-Pak C18) para purificar la microcina 24. Empleando

concentraciones crecientes de metanol, como fase móvil, la microcina comenzó a

eluír de la columna sólo a partir de la fracción correspondiente a 70 % de metanol. La

alta hidrofobicidad de la microcina 24 permite suponer que a altas concentraciones

formará agregados. En efecto, al eluir la microcina 24 con un solvente más volátil,

como acetonitrilo 100 %, se observa la aparición de núcleos de agregación que crecen

a medida que el solvente se evapora. Esta propiedad también es compartida con

extractos de microcina E492, que forma agregados amiloides con propiedades

citotóxicas sobre líneas tumorales de células humanas HeLa (Hetz y cols 2002).

Hasta el momento se desconoce si la microcina 24 es capaz de formar agregados

amiloides con propiedades citotóxicas, razón por la cual sería interesante estudiar su

efecto sobre líneas celulares humanas.

Los resultados de la cromatografía en columnas hidrofóbicas indicó que la

microcina 24 está presente en todas las fracciones que presentan actividad

antibacteriana (Figura 7 B). Además se observa que la microcina 24 posee una masa

aproximada de 7 kDa. Se purificó la fracción 95 % de metanol que presenta gran

actividad mediante HPLC (Figura 8). Los resultados de actividad y de SDS-PAGE

muestran que la microcina 24 eluye de la columna a partir del minuto 15 y su masa no

presenta mayor diferencia a la deducida anteriormente.

La masa experimental obtenida a partir de los datos de espectrometría de masa de

la microcina 24 purificada mediante HPLC, indican que existe sólo un compuesto con

una masa de 7274 Da que posee actividad antibacteriana (Figura 9). Esta masa

experimental no concuerda con los datos teóricos deducidos a partir de la secuencia

génica de la microcina 24 publicados en el GenBank (U47048). Según esta secuencia,

la microcina 24 se traduce como un péptido de 90 aminoácidos, el cual sufre un corte

proteolítico en un motivo típico de los exportadores ABC de bacteriocinas, resultando

en un péptido de 74 aminoácidos, cuya masa teórica es 7527 Da, es decir, con una

masa superior en 253 Da a la obtenida por espectrometría de masa.

Discusión. 63

El análisis de las secuencias de varias microcinas que comparten el mismo

sistema de exportación tipo ABC, y que por ende el mismo motivo de corte, indicó

que el corte proteolítico probablemente no ocurre en la secuencia de doble Glicina

como sugiere la literatura (Figura 12) (Gilson y cols., 1990). Sin embargo, un corte

realizado en GA generaría un péptido de 73 aminoácidos con una masa teórica de

7456 Da. Este valor es aún 182 Da mayor que la masa experimental; por lo que no

explicaría la diferencia de masa entre la masa molecular teórica, deducida de la

secuencia U47048 y el resultado experimental obtenido mediante espectrometría de

masa.

Inicialmente, se reportó que la microcina E492 poseía una masa de 7886 Da.

(Pons y cols., 2002), posteriormente se determinó que se puede purificar una forma

modificada de la microcina E492 y que posee una masa de 8717 Da (Thomas y cols.,

2004). Esta diferencia entre las especies de MccE492 se debe a una modificación

postraduccional en el residuo serina 84 (Thomas y cols., 2004), correspondiente a

una molécula tipo salmoquelina (Hantke y cols., 2003). A pesar que la microcina 24

presenta una identidad del 48,9 % con la microcina E492, no es posible suponer que

la diferencia de masa se deba a una modificación postraduccional en la microcina 24

no detectada, ya que esta no posee la secuencia glicina-serina característica de la

región carboxilo terminal de la microcina E492 a la cual se pueda anclar la

modificación. Sin embargo, sería interesante medir la expresión de la microcina 24 en

cepas de E. coli que contengan los genes productores de la salmoquelina.

La masa teórica de la microcina 24 se deduce a partir de la secuencia génica

publicada en GenBank U47048 en 1996. Es posible que la diferencia de masa se

deba a un cambio en la secuencia genética debido a una mutación posterior a la

secuenciación del sistema productor de la microcina 24, o bien a un error en la

secuencia publicada. Considerando que esta secuencia fue obtenida mediante

secuenciación manual de todo el sistema de la microcina 24 clonado sobre pBR322,

es posible suponer un error, debido a la baja fidelidad de la técnica manual en

comparación a las técnicas modernas de secuenciación. Para responder la interrogante

Discusión. 64

de la diferencia de masa resultó adecuado volver a secuenciar el sistema productor de

la microcina 24.

Los resultados de la re-secuenciación indican diferencias en el gen mtfS (Figura

10), que puede explicar la diferencia de masa entre la teórica y la obtenida

experimentalmente. El gen mtfS secuenciado contiene tres nucleótidos de guanina

más que la secuencia publicada, distribuidos de manera no consecutiva dentro de una

región de 30 pb (Figura 10 A). Esto genera un corrimiento del marco de lectura en

una región de 10 aminoácidos, generando así una secuencia primaria diferente a la

reportada (Figura 10 B). Esta nueva secuencia de la microcina 24, al ser procesada

proteolíticamente en glicina-glicina (GG), genera un péptido de 75 aminoácidos

(7293 Da), la que presenta sólo 18,79 Da de diferencia con la masa experimental, a

diferencia del valor teórico de 7527 Da de la microcina 24 publicada, 253 Da superior

a la obtenida según espectrometría de masa. A pesar que se corrigió la discrepancia

de la masa, no es posible diferenciar el sitio del corte proteolítico, puesto que un corte

en glicina-alanina (GA) de la nueva microcina 24 generaría un péptido de 74

aminoácidos con una masa teórica de 7221, sólo 53 Da por debajo del valor obtenido

experimentalmente. La microcina 24 posee una identidad del 42 % con la microcina

E492, sin embargo, analizando la nueva secuencia aminoacídica, la microcina 24

aumenta a un 50 % de identidad con la microcina E492. Todo esto nos indica que el

cambio en la secuencia no es un evento estocástico, sino más bien sugiere que la

nueva secuencia contiene una alta probabilidad de ser correcta. En función a esta

diferencia el gen de la microcina 24, junto con el resto de genes del sistema productor

de microcina, fueron renombrados como sigue: mcnR (antiguamente llamado mdbA),

mcnI (mtfI), mcnN (mtfS), mcnA (mtfA) y mcnB (mtfB).

La proteína McnB participa en la exportación de la microcina 24. Esta posee un

dominio C39 (perteneciente al dominio C39 de la superfamilia de proteasa C39) que

genera el corte proteolítico a la microcina 24 al ser exportada. Este dominio C39 es

altamente conservado entre los exportadores de las microcinas tipo II (Figura 13),

posee un 73 % de identidad (86 % de similitud) con el dominio C39 de la proteína

MceG perteneciente al complejo transportador de la microcina E492 y un 78 % de

Discusión. 65

identidad con el dominio C39 de la proteína CvaB. La figura 12 permite observar

que todos los dominios C39 de los diferentes exportadores de microcinas tipo II

realizan el corte proteolítico luego del residuo 15 del alineamiento, independiente si

esta señal es GG o GA, como es el caso de la microcina V (CvaC) que es procesada y

exportada por CvaB. En función a esto, proponemos que el dominio C39 de la

proteína McnB genera un corte proteolítico en la secuencia GA al igual que el

dominio C39 de la proteína MceG.

La secuenciación del gen mcnR arrojó una diferencia importante en su secuencia,

la presencia de una adenina extra luego de la adenina A302

produce un corrimiento del

marco de lectura, generando una proteína diferente con un 60,2 % de identidad a la

proteína MdbA reportada (Figura 14). Originalmente, la proteína MdbA contenía un

dominio conservado PRK10947 incompleto que corresponde a una proteína de unión

a DNA reguladora transcripcional presente en la familia de reguladores H-NS. La re-

secuenciación del gen mcnR indicó que la proteína McnR contiene el dominio

completo. Las proteínas pertenecientes a la familia de las H-NS presentan dominios

de unión a DNA y actúan como silenciadores selectivos de genes o regiones del

cromosoma bacteriano (Browning y cols., 2000). Se creyó por varios años que este

tipo de proteínas se unía a zonas del DNA ricas en TA sin tener preferencia por

alguna secuencia específica (Dorman, 2004), sin embargo estudios recientes indican

que las H-NS presentan preferencias por determinadas secuencias altamente

conservadas, cuyo consenso es TCGATAAATT (Lang y cols., 2007), siendo las

bases subrayada las más conservadas. Tomando en consideración que el análisis

bioinformático reveló 7 motivos H-NS de unión al sistema productor de la microcina

24, ubicándose uno de ellos próximo al codón de inicio de traducción del gen mcnI (-

84 bases del ATG) (Figura 17, Tabla IV), y que además el gen que codifica para la

H-NS se encuentra presente en un plasmidio de alto número de copias (pGOB18

proviene de pBR322), resulta trascendental estudiar el efecto regulador de McnR en

la expresión del sistema microcina 24.

Discusión. 66

6.2.- Mecanismo de acción del péptido antimicrobiano microcina 24

La microcina 24 ha sido agrupada en el grupo IIb de microcinas, correspondiente

a las microcinas formadoras de poros sin modificaciones postraduccionales

(Duquesne y cols., 2007). Esta clasificación se diseñó sin evidencia experimental que

la avalara. Uno de los objetivos planteados en esta tesis fue determinar

experimentalmente la permeabilización de la membrana de la célula blanco producto

de la acción de la microcina 24. Para esto se empleó el o-nitrofenilgalactopiranosido

(ONPG), un derivado galactósido que no absorbe en la longitud de onda de la luz

visible y que contiene un grupo o-nitrofenilo en el carbono-1. La hidrólisis de este

enlace libera al o-nitrofenol que absorbe luz visible tornando la solución de un color

amarillo intenso. Al igual que la lactosa, el ONPG es sustrato para la enzima β-

galactosidasa (codificada por el gen lacZ), requiere de la permeasa (codificada por el

gen lacY) para ingresar a la bacteria y es capaz de unirse al represor para inducir la

expresión del operón lac. La permeasa es un importador específico de membrana

interna, pues sin éste el ONPG no puede ingresar a la bacteria y, aún cuando la

bacteria posea la enzima β-galactosidasa, no podrá hidrolizar al ONPG. La cepa de E.

coli HB101 es incapaz de utilizar lactosa como fuente de carbono debido a que carece

de esta permeasa. En función a esto, es posible predecir que la E. coli HB101 sólo

podrá hidrolizar al ONPG si se permeabiliza la membrana interna. Al incubar la E.

coli HB101 junto con la microcina 24 y ONPG (Figura 18) es posible observar que

el medio adquiere una coloración amarilla, lo que evidencia la hidrólisis del ONPG.

De esta observación es posible inferir que la microcina 24 permeabiliza la membrana

interna de la bacteria. Para descartar la hidrólisis espontánea del ONPG se empleó

como control una cepa de E. coli HB101 incubada con ONPG en ausencia de

microcina 24. La gráfica de la cinética en presencia de microcina 24 (Figura 18)

muestra un aumento del hidrolizado durante todo el ensayo. Este comportamiento se

explica al considerar que la bacteria no es capaz de recuperar la integridad de su

membrana luego de la permeabilización producida por la microcina 24, lo que

conlleva a un ingreso constante de ONPG a la bacteria y evidentemente su hidrólisis.

Un daño que permeabilice la membrana interna puede llegar a ser fatal si la bacteria

Discusión. 67

no es capaz de recuperar la integridad de su membrana, ya que la función energética

depende de la gradiente de protones generada entre el periplasma y el citoplasma.

Para evaluar la recuperación fenotípica de las bacterias tratadas con la microcina 24

se realizaron recuentos de células viables comparadas con un control no tratado con

esta microcina (Figura 19). Al comparar las células tratadas durante tres horas con

microcina 24 se observa una disminución de la viabilidad celular de un 40 % con

respecto a células sin tratar al inicio del ensayo. Esta disminución es mucho más

notable si la comparamos con el control no incubado con microcina 24, pues al cabo

de tres horas ha aumentado el número de células hasta un 400 % en relación a la

cantidad original al inicio del ensayo. Considerando esto, las bacterias que fueron

tratadas con microcina 24 y no fueron afectadas (dado que se observa la presencia de

células viables) al cabo de 3 horas habrían aumentado en número en un 400 %

también, sobrevalorando el dato de 40% de viabilidad obtenido en el ensayo. Por lo

tanto, el número de células viables debiera ser aún menor que el calculado en el

experimento. Para corroborar esta hipótesis, se realizó un ensayo de viabilidad celular

utilizando el sistema comercial BACTO/LIVE®

(Invitrogen). Empleando microscopía

de fluorescencia, es posible observar células viables y células muertas, gracias a los

fluoróforos Yoduro de propidio y SYTO 9. En la Figura 20 se observan las células

control y las células tratadas con microcinas 24. Al cabo de tres horas es posible

contrastar el número de células inviables (rojas) del experimento control con la

cantidad de células inviables del experimento tratado con microcina 24. La gran

mayoría de las células incubadas con microcina 24 se encuentran dañadas, lo que

favorece la entrada del yoduro de propidio, desplazando al SYTO 9 que se encuentra

unido al DNA (esto se observa de un color amarillo cuando se superponen las dos

fluorescencia). Este ensayo corrobora el daño generado en la membrana de las

bacterias incubadas con la microcina 24. Además es posible observar que el recuento

de células viables después del tratamiento con microcina 24 en el experimento de la

Figura 19 se encuentra sobredimensionado, puesto que el ensayo mediante

fluorescencia muestra que la gran mayoría de células se encuentran muertas o

inviables después de 3 h de tratamiento con microcina 24.

Discusión. 68

Las evidencias experimentales que relacionan a la microcina 24 al receptor FhuA

se basan en el hecho que la microcina 24 no utiliza los transportadores FepA, Fiu ni

Cir, pero depende de la proteína TonB (Patzer y cols 2003). Sin embargo, hasta esta

memoria no se había demostrado experimentalmente que la microcina 24 requiera del

receptor FhuA. Los resultados obtenidos en este trabajo indican que la microcina 24

requiere del receptor FhuA para ejercer su acción bactericida, ya que bacterias

carentes de este receptor resultan completamente resistentes a la acción de la

microcina 24 (Figura 21).

Existen estudios que demuestran la capacidad de las microcinas del grupo II

como, por ejemplo E492 (Lagos y cols., 1993), y H47 (Rodriguez y cols., 1998) de

insertarse en una bicapa lipídica. Estos estudios miden la conductancia de dos medios

separados por una membrana lipídica artificial, registrando un cambio en la

conductividad una vez que la microcina se inserta en la bicapa. Considerando que la

microcina 24 permeabiliza la membrana de las células sensibles y además, comparte

un alto porcentaje identidad con E492, parece plausible estimar que la microcina 24

se inserte en bicapas lipídicas. Es de considerar que aún cuando estas microcinas se

inserten en bicapas lipídicas in vitro, no implica necesariamente que lo harían in vivo,

debido a la gran cantidad de proteínas presente en la membrana interna de las

bacterias que podrían impedir la inserción de dichas microcinas, o en el mejor de los

casos, favorecerla. Por ejemplo, la microcina V es catalogada como una microcina

formadora de poros, aún cuando no ha sido posible corroborarlo in vitro mediante

ensayos de conductancia sobre bicapas lipídicas (Yang y Konisky, 1984). Sin

embargo, se ha demostrado que la microcina V requiere de la proteína SdaC para

insertarse en la membrana interna de la célula blanco (Gérard y cols., 2005). Para

estudiar los sucesos que ocurren desde que la microcina 24 ingresa al periplasma

hasta que se “inserta” en la membrana interna, resulta importante conocer el receptor

FhuA (de la microcina 24) y el microambiente de interacción de éste en el transporte

del ferricromo hidroxamato, para determinar si alteran la función de la microcina 24.

Para esto, se propuso eliminar las proteínas que interactúan con FhuA y que

pertenecen al sistema de transporte del ferricromo. Mediante mutagénesis por

Discusión. 69

reemplazo se eliminó los genes fhuD, fhuC, fhuB y se evaluó la sensibilidad de esta

mutante a la microcina 24. Los resultados ilustrados en la Figura 23 muestran una

notable disminución de la sensibilidad representado por una menor zona de inhibición

de crecimiento en torno a la colonia de E. coli MC1061pGOB18. La disminución de

la sensibilidad da cuenta de la participación de este sistema en el proceso de inserción

de la microcina 24 en la membrana interna, pero no revela la participación que tiene

cada uno de estos genes en la inserción de la microcina. Es posible descubrir la

participación de los genes del sistema si son eliminados en forma individual. Para

esto se solicitó a la Universidad de Keio las mutantes en los genes fhuA, fhuB, fhuC y

fhuD (colección Keio) con sus respectivos genes clonados en un vector pCA24N

(colección ASKA). Las Figuras 24 y 25 ilustran la sensibilidad de cada una de estas

mutantes a la microcina 24. Como es de esperar, la mutación en el receptor FhuA

genera un fenotipo de resistencia a la microcina 24, ya que éste es el receptor

utilizado por la microcina para ingresar al periplasma. Una eliminación de FhuC no

genera mayor resistencia a la microcina 24, puesto que esta proteína se encuentra

anclada a FhuB por la cara interna de la membrana citoplasmática, sin contacto

directo con el periplasma. Sólo las mutantes en los genes fhuB y fhuD generan un

fenotipo de mayor resistencia a la microcina 24. Estas proteínas se encuentran en el

periplasma, siendo FhuD la que está en contacto directo con el receptor FhuA

(Carter y cols., 2006), por lo tanto FhuD es la proteína que interactúa con las

moléculas que ingresan a través del receptor. FhuB es el translocador de membrana

interna que libera al ferricromo de FhuD transportándolo hacia el citoplasma. Estos

fenotipos de resistencia a la microcina 24 pueden ser revertidos al transformar cada

una de estas mutantes con sus respectivos genes clonados en el vector pCA24, como

ilustran las Figuras 26 y 27, relacionando el fenotipo a la mutación efectuada.

Es muy probable, considerando la proximidad de FhuD a FhuA, que la microcina

luego de entrar por FhuA interactúe con FhuD. Si esto ocurre, es probable que la

interacción entre FhuD y FhuB ayuden a liberar a la microcina 24 de FhuD.

Por los antecedentes descritos se propone el siguiente modelo de acción de la

microcina 24:

Discusión. 70

FhuD, que fue propuesto anteriormente como un transportador de la microcina 24

cuando ingresa al periplasma, es sólo un vehículo que acelera la llegada de la

microcina 24 a la membrana interna; su interacción con FhuB permite la liberación de

la microcina del vehículo. La ausencia de este vehículo retrasa la llegada de la

microcina, puesto que tendrá que difundir a través de las proteínas del periplasma.

En consecuencia, si se elimina FhuB, se retrasará la liberación de microcina del

vehículo. Con la eliminación de FhuD se necesitará de una concentración mayor de

microcina para que, por simple difusión, atraviese el periplasma y llegue a la

membrana interna, lo que se traduce en un aumento de la resistencia a la microcina 24

o un halo de inhibición más pequeño alrededor de una colonia productora, dado que

sólo en las proximidades de la colonia productora la concentración de microcina 24 es

tan alta como para inhibir el crecimiento de esta mutante.

Debido a que la mutante triple sólo genera mayor resistencia a la microcina 24,

debe existir un mecanismo alternativo por el cual la microcina 24 llega al periplasma.

En función a la baja sensibilidad de la mutante triple a la microcina 24 se propone lo

siguiente:

El péptido antimicrobiano microcina 24 se une específicamente al receptor de

membrana externa FhuA el cual, gracias a la energía que le entrega el sistema

TonB/ExbBD, transporta a la microcina 24 desde el medio externo hacia el

periplasma. Inmediatamente después, FhuD captura a la microcina 24 y la conduce a

través del periplasma hasta encontrarse con FhuB. La interacción entre FhuD y FhuB

libera a la microcina 24 de FhuD, permitiendo de esta forma la inserción en la

membrana citoplasmática (Figura 28). Una vez que la microcina 24 logra insertarse

en la membrana interna, generará una permeabilización de ésta y en consecuencia,

generará la muerte celular.

Discusión. 71

Figura 28. Esquematización del modelo de resistencia a la microcina 24 propuesto. El

diagrama ilustra el camino recorrido por la microcina 24 desde que es reconocida por el receptor del

ferricromo hidroxamato FhuA hasta que se inserta en la membrana interna de la célula blanco. Las

flechas indican el movimiento de fhuD entre FhuA y FhuB. La microcina 24 está representada en el

diagrama de color azul. Membrana externa (ME), membrana interna (MI), espacio periplásmico.

TonB

FhuD

FFFhhhuuuBBB

FhuC

FhuA

Mcc24

ME

MI

EP

Medio

extracelular

Citoplasma

Conclusiones. 72

7.- CONCLUSIONES

1. El gen estructural de la microcina 24 y el gen que codifica para su

proteína de inmunidad forman una unidad transcripcional bicistrónica.

2. La microcina 24 se expresa y comienza a exportarse en fase exponencial

de crecimiento.

3. La espectrometría de masa de la microcina 24 indica que esta

bacteriocina es un péptido de 7274 Da.

4. La secuenciación del sistema productor de microcina 24 indica que esta

bacteriocina se sintetiza como una pre-proteína de 89 aminoácidos y que

posee un 48,9 % de identidad con la microcina E492

5. La microcina 24 permeabiliza la membrana interna de las bacterias

sensibles, generando un daño irreversible en la membrana interna, lo que

genera la muerte celular.

6. La proteína FhuA es el receptor utilizado por la microcina 24 para

ingresar al periplasma de la célula blanco

7. Los genes fhuD y fhuB del sistema de captura y transporte del ferricromo

participan en el mecanismo de acción del péptido antimicrobiano

microcina 24.

Referencias. 73

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