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UNIVERSIDAD DE CHILE

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS DEPARTAMENTO DE QUÍMICA FARMACOLÓGICA Y TOXICOLÓGICA LABORATORIOS DE BIOELECTROQUÍMICA Y FARMACOQUÍMICA

“ESTUDIO DEL COMPORTAMIENTO ELECTROQUÍMICO DE BENSERAZIDA Y APLICACIONES ANALÍTICAS”

PROFESOR PATROCINANTE DIRECTORES DE MEMORIA Dr. Alejandro Álvarez Lueje Dr. Alejandro Álvarez Lueje Departamento de Química Dra. Soledad Bollo Dragnic Farmacológica y Toxicológica Departamento de Química

Farmacológica y Toxicológica

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico

MARÍA MAGDALENA PÉREZ ORTIZ SANTIAGO DE CHILE

2008

A mi madre, por todo su esfuerzo, apoyo y amor incondicional

Agradecimientos Agradezco primeramente a Dios por permitirme terminar este camino, por darme valor, perseverancia y fuerza para afrontarlo en los momentos difíciles, y capacidad para disfrutarlo en los momentos felices. A mi madre, a quién amo y admiro, por ser siempre un ejemplo para mi y mis hermanos, y por haber estado presente a lo largo de mi vida y de mi carrera. A mi abuela y a mis hermanos, por el cariño y el apoyo que cada uno me brinda a su manera. A mi director, profesor Alejandro Álvarez, por brindarme sus conocimientos y guiarme con paciencia al logro de esta meta. A los profesores Claudia Yánez, Soledad bollo y Pablo Richter, por sus consejos y correcciones. A mis compañeros del laboratorio de Bioelectroquímica, Marcia, Paola, Mauricio y Ricardo, por sus conocimientos electroquímicos tan necesarios en el desarrollo de esta memoria. A mis pocos pero buenos amigos, Kathy, Claudio y Cecilia, por enseñarme el valor de la amistad y todos los momentos vividos. Finalmente, a todos aquéllos que hicieron posible que este día llegara y contribuyeron a la realización de este trabajo.

ii

ÍNDICE

RESUMEN............................................................................................... iii

SUMMARY .............................................................................................. iv

1. INTRODUCCIÓN ..................................................................................1

2. MATERIALES Y MÉTODOS ....................................................................4

2.1 Materiales................................................................................................. 4

2.1.1 Fármacos estudiados.......................................................................... 4

2.1.2 Reactivos y disolventes ...................................................................... 4

2.1.3 Disoluciones tampón .......................................................................... 5

2.1.4 Material de vidrio ............................................................................... 5

2.1.5 Instrumental de uso general y otros materiales.................................. 5

2.1.6 Equipos .............................................................................................. 6

2.2 Métodos.................................................................................................... 7

2.2.1 Caracterización electroquímica ........................................................... 7

2.2.1.1 Preparación de disoluciones......................................................... 7

2.2.1.2 Voltamperometría de pulso diferencial......................................... 8

2.2.1.3 Voltamperometría cíclica ............................................................. 9

2.2.1.4 Electrólisis a potencial controlado...............................................10

2.2.1.5 Espectroelectroquímica...............................................................13

2.2.2 Desarrollo de la metodología electroanalítica ....................................14

2.2.3 Aplicación a forma farmacéutica........................................................18

2.2.4 Cromatografía líquida de alta eficiencia .............................................19

2.2.5. Estudio de estabilidad por voltamperometría de pulso diferencial .....19

2.2.6. Determinación de la constante de disociación...................................21

i

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ..............................................................23

3.1 Caracterización electroquímica ................................................................23

3.1.1 Comportamiento electroquímico de benserazida ...................................23

3.1.1.1 Voltamperometría de pulso diferencial en medio acuoso.................23

3.1.1.3 Voltamperometría hidrodinámica....................................................31

3.1.2 Comportamiento electroquímico de levodopa ........................................38

3.1.2.1 Voltamperometría de pulso diferencial en medio acuoso.................38

3.1.2.2 Voltamperometría cíclica ................................................................39

3.2. Desarrollo de la metodología electroanalítica ..........................................41

3.2.1 Selección de condiciones óptimas ......................................................41

3.2.2 Curva de calibración ..........................................................................43

3.2.3 Estudios de Selectividad ....................................................................45

3.3 Aplicaciones de la metodología analítica ..................................................50

3.3.1 Cuantificación de benserazida en forma farmacéutica........................50

3.3.2 Estudio de estabilidad hidrolítica de benserazida ...............................52

CONCLUSIONES ....................................................................................56

REFERENCIAS .......................................................................................58

ii

Resumen

RESUMEN

En esta Memoria se presenta el estudio del comportamiento anódico del

fármaco antiparkinsoniano benserazida, haciendo uso de las técnicas de

voltamperometrías de pulso diferencial (VPD), cíclica (VC), lineal (VL), y

electrólisis a potencial controlado (EPC) y el desarrollo de una metodología por

VPD para su determinación, ya sea como materia prima o forma farmacéutica.

Empleando VPD, benserazida exhibe una señal de oxidación principal, bien

definida, a potenciales relativamente bajos en un amplio rango de pH (2-10) y

otras tres señales a potenciales más anódicos, menos resueltas, sobre el

electrodo de carbón vítreo en medio acuoso. Las señales son pH dependientes y

se desplazan hacia potenciales menos positivos conforme aumenta el pH del

medio. Por otra parte, los resultados de VC y VL en medio acuoso revelan que el

proceso de oxidación es irreversible y está controlado por difusión de la especie

electroactiva a la superficie del electrodo de carbón vítreo.

La metodología analítica para la determinación de benserazida se realizó

por VPD, en disolución tampón Britton-Robinson 0.1 M, pH 6, presentando

valores de repetibilidad y reproducibilidad adecuados (CV<2%), porcentajes de

recuperación superiores a 98%, en un rango dinámico entre 2.5×10-5 y

2.5×10-4 M. Además, la metodología desarrollada fue selectiva frente a los

excipientes contenidos en la formulación farmacéutica. Esta metodología fue

aplicada a la valoración y determinación de la uniformidad de contenido de

benserazida en asociación con levodopa en comprimidos, obteniéndose

resultados comparables con el método oficial descrito en la Farmacopea Británica

2003.

Finalmente, la metodología voltamperométrica se aplicó al ensayo de la

cinética de degradación hidrolítica de benserazida, encontrando una cinética de

orden uno en las condiciones ensayadas.

iii

Summary

SUMMARY

ELECTROCHEMICAL BEHAVIOR OF BENSERAZIDE AND ANALYTICAL APPLICATIONS

In this Thesis, the electrochemical behavior of the anti Parkinson drug

benserazide and its analytical determination is presented. These studies were

carried out by using differential pulse (DPV), cyclic (CV) and linear (LV)

voltammetries techniques and also electrolysis experiments. Furthermore, a DPV

methodology was developed in order to quantify benserazide in both

pharmaceuticals and raw material.

By using DPV, benserazide exhibited a main well-defined oxidation signal

at low potentials in a broad pH range (2-10), and also three bad resolved signals

at higher anodic potentials on glassy carbon electrode in aqueous media. These

signals were pH-dependents and shifting towards less positive potentials with pH.

On the other hand, CV and LV experiments reveal that in aqueous medium, the

oxidation process was irreversible and diffusion-controlled.

The developed analytical methodology was carried out by using DPV, in

0.1 M Britton-Robinson buffer pH 6, and exhibited adequate repeatability and

reproducibility values with RSD < 2% and percentages recoveries higher than

98% in a concentration range of 2.5×10-5 y 2.5×10-4 M. Also, pharmaceutical

excipients do not interfered in the proposed method. Additionally, the developed

DPV method was successfully applied to both the assay and the uniformity

content of benserazide in presence of levodopa in tablets and the results were

compared with the official one, described by Britannic Pharmacopoeia 2003.

Finally, the voltammetric method was also applied to the hydrolytic

degradation studies of benserazide, finding that benserazide exhibits a pseudo

first order kinetic in the experimental conditions tested.

iv

Magdalena Pérez O.

1. INTRODUCCIÓN

La enfermedad de Parkinson es una enfermedad neurodegenerativa del

sistema nervioso central, cuya principal característica es la muerte progresiva de

neuronas en una parte del cerebro, denominada sustancia negra. La

consecuencia más importante de esta pérdida neuronal es una marcada

disminución en la disponibilidad cerebral de dopamina, principal neurotrasmisor

sintetizado por estas neuronas, originándose una disfunción en la regulación de

las principales estructuras cerebrales implicadas en el control del movimiento1- 5

De esta manera, la enfermedad de Parkinson se caracteriza por ser un

trastorno motor progresivo, cuyos principales síntomas son la torpeza

generalizada, con lentitud en la realización de movimientos, escasez de motilidad

espontánea, temblor de reposo y rigidez1,6.

En la actualidad se puede resumir que la enfermedad de Parkinson no

tiene una causa única, existiendo casos familiares con anomalías genéticas

conocidas y otros casos en los que una conjunción de factores genéticos y

ambientales, serían los responsables de la muerte neuronal3,7.

El tratamiento farmacológico fundamental es la reposición de dopamina

cerebral, mediante la administración de su precursor levodopa, pues la dopamina

no es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica. Sin embargo, aún cuando

levodopa atraviesa la barrera hematoencefálica y se transforma en dopamina por

acción de la enzima dopa-descarboxilasa, un 95% de ella es transformada en

dopamina fuera del sistema nervioso central. Ello implica administrar altas dosis

del fármaco, lo que se asocia con complicaciones motoras a mediano-largo plazo

y otros efectos adversos, como taquicardias y arritmias, producto de su

conversión periférica8,9.

Con el fin de prevenir las complicaciones ya mencionadas, asociadas a la

conversión periférica de levodopa en dopamina y a la vez aumentar sus niveles

1

Summary

en el sistema nervioso central, se ha asociado a levodopa un inhibidor de la

descarboxilasa periférica (carbidopa o benserazida), de manera de reducir así sus

dosis y los efectos secundarios relacionados1,8.

Benserazida, 2-amino-3-hidroxi-2´-(2,3,4-trihidroxibencil) propiono-

hidrazida (Figura 1), es un inhibidor periférico de la enzima dopa descarboxilasa,

empleado conjuntamente con levodopa [3-(3,4-dihidroxifenil)-l-alanina] para el

tratamiento de la enfermedad de Parkinson, en proporción 1:4, respectivamente.

Se emplea en dosis diarias de 50 mg, que pueden ser incrementadas a

100 ó

Desde el punto de vista analítico, benserazida ha sido determinada

simultá

OH

OH

NN

O

NH2

OHH

H

250 mg, conjuntamente con levodopa. Es rápidamente absorbida y

metabolizada a trihidroxibenzilhidrazina en la mucosa intestinal e hígado después

de una administración oral, alcanzando niveles plasmáticos de 1 mg/L después

de 1 h de una administración oral de 50 mg. Aproximadamente el 50 a 60 % de

una dosis oral y el 80 % de una dosis IV es excretado en 12 h, principalmente

como metabolitos, los cuales se excretan en su mayor parte por la orina y en

menor proporción por las heces1,10.

neamente con levodopa en formulaciones farmacéuticas, empleando

distintos métodos, como electroforesis capilar11- 13, espectrofotometría

derivativa14- 16, multivariada17- 20 y por complejación con dióxido de germanio21,

mientras que la Farmacopea Británica emplea la cromatografía líquida en fase

reversa con detector ultravioleta, como método oficial para la determinación

simultánea de levodopa y benserazida22.

OH

Figura 1. Estructura química de benserazida

2

Magdalena Pérez O.

Por otra parte, benserazida ha sido determinada en fluidos biológicos por

HPLC con detector electroquímico, al igual que muchos congéneres catecólicos,

como levodopa, carbidopa y catecolaminas endógenas, en función de la oxidación

electroquímica de los hidroxilos fenólicos presentes en la estructura23- 26.

Pese a lo anteriormente expuesto, no existen estudios que describan el

comportamiento electroquímico de benserazida ni tampoco su determinación

analítica empleando algún método voltamperométrico.

En función de los antecedentes expuestos, en esta Memoria se plantea

como objetivo general el estudio del comportamiento electroquímico de

benserazida, con vistas a desarrollar una metodología electroanalítica adecuada

para su cuantificación como materia prima y formas farmacéuticas.

De acuerdo a lo anterior, se plantean los siguientes objetivos específicos:

1. Caracterizar del comportamiento electroquímico de benserazida sobre el

electrodo de carbón vítreo, empleando las técnicas de voltamperometría de

pulso diferencial (VPD), voltamperometría cíclica (VC) y electrólisis a potencial

controlado (EPC).

2. Desarrollar una metodología electroanalítica reproducible y selectiva, que

permita la posterior determinación de benserazida en formas farmacéuticas

del mercado nacional y a su vez aplicarla al estudio de estabilidad de este

principio activo.

3

Materiales y métodos

2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1 Materiales

2.1.1 Fármacos estudiados

a) DCI : Benserazida clorhidrato (98.5%, Laboratorio Tecnofarma)

Fórmula global : C10H15N3O5. HCl

Nomenclatura : 2-amino-3-hidroxi-2’-(2,3,4-trihidroxibencil)

propionohidrazida

Peso molecular : 293.71 g/mol

Rango de fusión: 146-148ºC27

Forma farmacéutica: Comprimidos de 250 mg, Prolopa®. Laboratorio Roche.

b) DCI : Levodopa (99.3%, Laboratorio Chile)

Fórmula global : C9H11NO4

Nomenclatura : 3-(3,4-dihidroxifenil)-l-alanina

Peso molecular : 197.19 g/mol

Rango de fusión: 276-278°C

Forma farmacéutica: Comprimidos de 250 mg, Prolopa®. Laboratorio Roche.

2.1.2 Reactivos y disolventes

Acetonitrilo (99.0%) grado gradiente, Merck.

Ácido acético glacial (100.0 %) p.a. Merck.

Ácido bórico p.a., Merck.

Ácido clorhídrico (36.5%) p.a Equilab.

Ácido ortofosfórico (85.0%) p.a., Merck.

Agua calidad HPLC (Milli-Q).

Almidón, calidad técnica.

Celulosa microcristalina, calidad técnica.

Cloruro de potasio p.a. Merck.

4

Magdalena Pérez O.

Decanosulfonato de sodio, para síntesis. Merck

Diclorometano, p.a., Merck

Dióxido de titanio, calidad técnica.

Estearato de magnesio, calidad técnica.

Etanol absoluto (99.8%) p.a., Merck.

Fosfato de sodio dibásico anhidro, p.a., Merck.

Helio extrapuro AGA.

Hidróxido de sodio (NaOH) (pellets) p.a. Merck.

Hidroxipropilcelulosa, calidad técnica.

Hidroxipropilmetilcelulosa, calidad técnica.

Lactosa, calidad técnica.

Nitrógeno extrapuro AGA.

Ortofosfato dihidrogeno de potasio, p.a., Merck

Sorbitol, calidad técnica.

Talco, calidad técnica.

2.1.3 Disoluciones tampón

Tampón calibrador pH-metro, 4.00 Hanna Instruments.



Tampón Britton-Robinson 0.1 M.

2.1.4 Material de vidrio

Todo el material de vidrio utilizado fue clase A.

2.1.5 Instrumental de uso general y otros materiales

Pipetas automáticas, Eppendorf Research de volumen variable 10-1000 μL.

Jeringa de inyección Hamilton de 50 μL.

Filtros Millipore para jeringa de 0.45 μL.

5


Viales ámbar de 2 mL, Hewlett Packard.

Sellos de viales, Hewlett Packard.

Engargoladora, Hewlett Packard.

Desengargoladora, Hewlett Packard.

2.1.6 Equipos

a) Sistema voltamperométrico

Analizador voltamperométrico BAS CV-50W y BAS CV-100W.

Celda electroquímica BAS (5 y 10 mL).

Electrodo de trabajo : electrodo de carbón vítreo (CHI 104).

Electrodo auxiliar : platino BAS MW-1032.

Electrodo de referencia : Ag/AgCl BAS RE-5B.

Computador Pentium, con programa de adquisición y tratamiento de datos

CV-50W, CV-100W.

b) Sistema cromatográfico

Bomba Waters® 600 Controller Millipore Model Code 6CE.

Detector con arreglo de fotodiodos Waters® 996.

Columna cromatográfica Phenomenex 100-5C-8 (4.60 mm×150 mm).

Precolumna C18 μBondapak (30 mm×4.6 mm).

Inyector Rheodyne de 20 μL.

Horno columna, Waters® 600.

Computador Pentium II con programa de adquisición y tratamiento de datos

MILLENIUM versión 3.05.

c) Sistema espectrofotométrico (UV-VIS)

i) Espectrofotómetro UV-VIS Unicam UV2.

Celdas de cuarzo de paso óptico 10 mm.

6

Magdalena Pérez O.

Computador Pentium III, con programa de adquisición y tratamiento de datos

VISION 2.2.

ii) Espectrofotometro UV-Vis CHEMSTATION diodo array

Sofware 845X UV-Visible System

Copyright Agilent Technologies 95-03 para tratamiento y adquisición de datos.

e) Equipos de uso general

Agitador magnético Hotplate Stirrer

Balanza analítica de precisión, Precisa 40SM-200A (sensibilidad 0.01 mg).

Baño de ultrasonido, Branson 2210.

Estufa WTC Bindert.

Medidor de pH, WTW pMX 537.

Medidor de pH WTW modelo pMx 3000.

Sistema purificador de agua, Milli-Q Ultra-Pure Water System.

2.2 Métodos

2.2.1 Caracterización electroquímica

2.2.1.1 Preparación de disoluciones

a) Disolución stock de los compuestos en estudio

En forma independiente se pesó, exactamente, alrededor de 14.68 mg de

benserazida clorhidrato y 9.86 mg de levodopa. El polvo fue disuelto en agua con

ayuda de ultrasonido al interior de un matraz aforado de 5 mL, finalmente se

enrasó con agua obteniéndose una disolución 1×10-2 M para cada fármaco.

7


b) Tampón Britton-Robinson 0.1 M

Se disolvieron 6.20 g de ácido bórico en agua Milli-Q, con ayuda de ultrasonido,

en un matraz aforado de 1000 mL. Se agregó 6.8 mL de ácido ortofosfórico,

5.8 mL de ácido acético y se completó volumen con agua Milli-Q.

2.2.1.2 Voltamperometría de pulso diferencial

a) Condiciones experimentales

Los electrodos utilizados fueron:

Electrodo de trabajo : Electrodo de carbón vítreo BAS.

Electrodo Auxiliar : Electrodo de platino.

Electrodo de referencia : Electrodo de Ag/AgCl.

Las condiciones de operación fueron:

Potencial inicial : -200 mV

Potencial final : 1300 mV

Velocidad de barrido : 20 mV/s

Escala de sensibilidad : 10 – 100 µA/V

Las disoluciones de trabajo en la celda electroquímica no fueron protegidas de la

luz ni burbujeadas con nitrógeno previa medición. La temperatura de trabajo fue

la ambiental.

Después de cada medición se procedió a limpiar el electrodo de carbón vítreo,

puliéndolo primero en alúmina de 0.3 µm y posteriormente en alúmina de

0.05 µm.

8

Magdalena Pérez O.

b) Estudio de la influencia de pH

Se determinó el comportamiento electroquímico para cada fármaco en un rango

de pH entre 2.0-7.0 para levodopa y 2.0-10.0 para benserazida, a una disolución

de trabajo de concentración 1.0×10-4 M. Para ello se transfirieron alícuotas de 50

µL de las disoluciones stock de cada fármaco a matraces de 5 mL y se aforó con

tampón Britton-Robinson 0.1 M. El pH de estas disoluciones se ajustó empleando

una disolución concentrada de NaOH, incrementándose en una unidad a partir de

pH 2. Para cada pH se realizaron mediciones por triplicado, registrando cada

voltamperograma.

c) Estudio de concentración

Para cada fármaco de determinó el efecto de la concentración en el

comportamiento electroquímico, en un rango de concentración de trabajo entre

2.5×10-5 M y 2.5×10-3 M. Para ello se transfirió una cantidad de volumen

adecuado de disolución stock del fármaco correspondiente a un matraz aforado

de 5 mL, enrasando con tampón Britton-Robinson 0.1 M ajustado a pH 6. Las

mediciones correspondientes a cada concentración se realizaron por triplicado,

registrando cada voltamperograma.

2.2.1.3 Voltamperometría cíclica



Electrodo de trabajo : Electrodo de carbón vítreo BAS.

Electrodo Auxiliar : Electrodo de platino.


9



Potencial inicial: -200 mV

Potencial final: 1200 mV

Velocidad de barrido : 0.1 - 5 V/s

Escala de sensibilidad: 10 – 100 µA/V

Las disoluciones de trabajo en la celda electroquímica no fueron protegidas de la

luz ni burbujeadas con nitrógeno previa medición. La temperatura de trabajo fue

la ambiental.

Después de cada medición se procedió a limpiar el electrodo de carbón vítreo,

puliéndolo primero en alúmina de 0.3 µm y posteriormente en alúmina de

0.05 µm.

b) Estudio de la influencia de pH

Se determinó el comportamiento electroquímico de benserazida a disoluciones de

trabajo de concentración 1.0×10-3 M a tres valores de pH: 2.0, 6.0 y 8.0. Para

ello se transfirió una alícuota de 500 µL de la disolución stock del fármaco a un

matraz de 5 mL y se aforó con tampón Britton-Robinson 0.1 M. El pH de cada

disolución fue ajustado utilizando disoluciones concentradas de NaOH y HCl. Para

cada pH y velocidad de barrido se realizaron mediciones por triplicado,

registrando los voltamperogramas.

2.2.1.4 Electrólisis a potencial controlado

La electrólisis a potencial controlado se llevó a cabo a tres valores de pH

distintos: 2.0, 3.0 y 7.0, en tampón Britton-Robinson 0.1 M.

10

Magdalena Pérez O.

a) Disolución de trabajo

Para los ensayos realizados a pH 2.0 y 3.0, se transfirió una alícuota de 375 µL

de la disolución stock del fármaco a un matraz de 50 mL y se llevó a volumen

con tampón Britton-Robinson 0.1 M previamente ajustado al pH de trabajo,

obteniéndose una disolución de concentración final 7.5×10-5 M.

Para el estudio realizado a pH 7.0, se tomó una alícuota de 1000 µL de la

solución stock del fármaco y luego se procedió de manera análoga a lo descrito

anteriormente, obteniéndose, en este caso, una disolución de concentración final

2.0×10-4 M.

b) Condiciones experimentales


Electrodo de trabajo : Malla de carbón vítreo reticulado.

Electrodo Auxiliar : Electrodo de platino



Intervalo de electrólisis : 1000 mseg

Proporción de corriente final : 10 / 1000

Escala de sensibilidad : automática

Dado que benserazida presenta más de una señal de oxidación, los potenciales

aplicados variaron según el potencial de oxidación de la señal principal de

benserazida con el pH, así para los pH 2 y 7 se aplicó el potencial necesario más

100 mV para oxidar sólo la seña principal, mientras que para pH 3 se aplicó

potencial necesario para lograr la oxidación de todas las señales y por tanto

calcular el número de electrones transferidos en el proceso completo.

11


Las disoluciones de trabajo no fueron protegidas de la luz en la celda

electroquímica, pero sí burbujeadas con nitrógeno durante 10 minutos previa

electrólisis. La temperatura de trabajo fue la ambiental.

c) Procedimiento

La electrólisis a potencial controlado se realizó durante el tiempo necesario, para

observar una disminución notoria en la señal principal de benserazida al pH

ensayado, registrándose cada tres minutos las gráficas de carga versus tiempo.

Posteriormente, en cada caso, se realizó la electrólisis del disolvente bajo las

mismas condiciones experimentales en que se realizó la electrólisis de

benserazida, con el propósito de obtener la carga neta total correspondiente a la

electrólisis del fármaco. En forma paralela, se realizó el seguimiento de ésta por

voltamperometría de pulso diferencial.

d) Cálculo del número de electrones

Para el cálculo del número de electrones se estimó la sumatoria de las cargas

finales de electrólisis sucesivas, con corrección de la carga basal. A partir de la

carga total neta y empleando la ecuación de Faraday (ecuación 1), se calculó el

número de electrones transferidos por mol de benserazida.

Ecuación 1. Q neta = n F e Donde:

n = número de moles F = constante de Faraday (96500 C/ mol) e = número de electrones.

12

Magdalena Pérez O.

2.2.1.5 Espectro-electroquímica

A. Preparación de disoluciones


Se tomaron 500 µL de disolución stock de benserazida, los que fueron llevados a

un matraz aforado de 5 mL, enrasado con tampón Britton-Robinson 0.1 M

previamente ajustado a pH 6, obteniéndose una disolución de concentración final

1.0×10-3 M.

b) Disolución blanco

Se realizó con tampón Britton-Robinson 0.1 M ajustado a pH 6.

B. Procedimiento



Electrodo de trabajo : Malla de carbón vítreo reticulado.

Electrodo Auxiliar : Electrodo de platino


La disolución de trabajo, contenida en una cubeta de cuarzo, fue burbujeada con

nitrógeno previamente y durante la electrólisis, la cual se efectuó durante 90

minutos aplicando un potencial de 200 mV a intervalos de 5 minutos, al cabo de

los cuales se deja de aplicar el potencial y el burbujeo de nitrógeno, para

registrar el espectro correspondiente.

13


2.2.2 Desarrollo de la metodología electroanalítica

A. Voltamperometría de pulso diferencial

a) Curva de calibración

A partir de una disolución stock de benserazida de concentración 1×10-2 M, se

prepararon 9 disoluciones de concentraciones entre 2.5×10-5 M hasta 2.5×10-4 M.

Para ello, alícuotas de la disolución stock de benserazida fueron transferidas a un

matraz aforado de 5 mL, completando volumen con tampón Britton-Robinson 0.1

M ajustado a pH 6. Las disoluciones así preparadas fueron medidas por


b) Estudio de repetibilidad

Se midieron 8 veces consecutivas, por la técnica de voltamperometría de pulso

diferencial, 5 mL de las disoluciones de trabajo de concentración 4.0×10-5 M,

1.0×10-4 M, 2.0×10-4 M de benserazida, tampón Britton-Robinson a pH 6.0. Como

parámetro estadístico se consideró el coeficiente de variación de la corriente de

pico de la señal obtenida.

c) Estudio de reproducibilidad

Se midieron 10 veces consecutivas, por la técnica de voltamperometría de pulso

diferencial, 5 mL de las disoluciones de trabajo de concentración 4.0×10-5 M,

1.0×10-4 M, 2.0×10-4 M de benserazida, tampón Britton-Robinson a pH 6.0,

variando el día de medición. Como parámetro estadístico se consideró el

coeficiente de variación de la corriente de pico de la señal obtenida.

d) Límite de detección y límite de cuantificación

Para la estimación del límite de detección y cuantificación se procedió como

sigue:

14

Magdalena Pérez O.

- A partir de la curva de calibración se obtuvo el valor de la pendiente de

la recta (m).

- Se midió por duplicado cuatro disoluciones en el rango inferior de la

curva de calibración (2.5×10-5 M, 3.0×10-5 M, 3.5×10-5 M, 4.0×10-5 M). Para

estas cuatro disoluciones se obtuvo los valores promedios de la corriente de pico

(XIp) y la desviación estándar (σ).

- Se representó gráficamente XIp versus la concentración de la muestra y

se determinó la ecuación de la nueva recta. Al extrapolar la respuesta a

concentración cero se obtuvo la respuesta del blanco (Ybl).

- Se representó gráficamente σ versus la concentración de muestra y al

extrapolar la respuesta a concentración cero, se obtuvo el valor de la respuesta

de la desviación estándar del blanco (σbl).

El límite de detección (LD) (Ecuación 2) y el límite de cuantificación (LC)

(Ecuación 3) se calcularon según las siguientes ecuaciones:

Donde:

m = Pendiente de curva de calibración

Ybl = Respuesta del blanco σbl = Desviación estándar del blanco

Ecuación 2.

cuación 3.

udios de selectividad

Para la validación de la metodología electroanalítica desarrollada, se realizaron

los siguientes ensayos de degradación acelerados:

i) Hidrólisis ácida

Se tomaron 500 µL de disolución stock de benserazida y se llevaron a un matraz

aforado de 5 mL, enrasando con HCl 1 N. La disolución preparada se transfirió a

reflujo por 1 hora. Posteriormente se tomó una alícuota de 1250 µL de la

mσ3Y

LD blbl +=

mσ10Y

LC blbl +=E

d) Est

un balón de destilación de 25 mL conectado a un tubo refrigerante y se calentó a

15


disolución hidrolizada y se transfirió a un matraz aforado de 5 mL, enrasando con

tampón Britton-Robinson 0.1 M, obteniéndose una disolución de concentración

2.5×10-4 M. Finalmente se ajustó pH a 6 y se midió por voltamperometría de

pulso diferencial.

ii) Hidrólisis básica

e tomaron 500 µL de disolución stock de benserazida y se llevaron a volumen

i) Fotólisis

lrededor de 15 mL de la disolución stock de benserazida, previamente

) Termólisis

lrededor de 5 mL de disolución stock de benserazida fueron repartidos en cuatro

S

final de 5 mL con NaOH 1 N en un matraz aforado. Dado que la hidrólisis fue

instantánea no fue necesario calentar a reflujo. De la disolución hidrolizada se

tomó una alícuota de 1250 µL que se llevó a un matraz aforado de 5 mL,

enrasando con tampón Britton-Robinson 0.1 M, obteniéndose una disolución de

concentración 2.5×10-4 M. Finalmente se ajustó pH a 6 y se midió por


ii

A

burbujeada con nitrógeno durante 10 minutos, fueron repartidos en tres cubetas

de cuarzo con tapa, las que se expusieron a luz de día durante una semana. De

las disoluciones fotolizadas, se tomaron alícuotas de 125 µL al tercer, quinto y

octavo día, las que fueron transferidas a matraces aforados de 5 mL y llevadas a

volumen con tampón Britton-Robinson 0.1 M ajustado a pH 6, para obtener

disoluciones de concentración 2.5×10-4 M.

iv

A

viales color ámbar, correctamente sellados y expuestos a una temperatura de

60ºC durante 7 horas. Alícuotas de 125 µL de las disoluciones sometidas a

temperatura fueron tomadas a los tiempos de 1, 3, 5 y 7 horas y llevadas a

matraces aforados de 5 mL, los cuales fueron enrasados con

16

Magdalena Pérez O.

tampón Britton-Robinson 0.1 M ajustado a pH 6, para obtener disoluciones de

concentración 2.5×10-4 M.

Las disoluciones finales obtenidas en cada uno de los ensayos de degradación se

) Estudio de recuperación

e realizó a dos niveles de concentración: rango bajo (4.5×10-5 M) y alto

n

uego, para realizar el estudio de recuperación en el rango alto de la curva de

e prepararon disoluciones stock de concentración 5.0×10-3 M para benserazida

ara realizar el estudio de recuperación en el rango bajo de la curva de

calibración, se tomaron 90 µL de las disoluciones stock y se llevaron a un matraz

analizaron además por HPLC, utilizando el método descrito en la Farmacopea

Británica.

e

S

(2.0×10-4 M) de la curva de calibración. En cada caso, se prepararon diez

muestras sintéticas en forma independiente; cada una ellas conteniendo

benserazida, levodopa y excipientes de acuerdo a lo declaro en la formulación.

En una primera etapa se preparó una mezcla de excipientes en una proporció

similar a la de fabricación. Los excipientes ensayados fueron: fosfato monoácido

de calcio, manitol, almidón de maíz, polividona, etilcelulosa, estearato de

magnesio, celulosa microcristalina y óxido de hierro rojo.

L

calibración, las muestras fueron preparas como se indica a continuación:

S

y 2.9×10-2 M para levodopa. De éstas se transfirieron alícuotas de 400 µL a un

matraz aforado de 10 mL, obteniéndose concentraciones finales de 2.0×10-4 M y

1.2×10-3 M respectivamente, lo que corresponde a 0.6 mg de benserazida y 2.3

mg de levodopa. Posteriormente se agregó al mismo matraz alrededor de 3.45

mg de la mezcla de excipientes, exactamente pesados. La mezcla fue suspendida

en tampón Britton-Robinson 0.1 M ajustado a pH 6 y luego llevada a volumen

final de 10 mL.

P

17


aforado de 10 mL, obteniéndose disoluciones de concentración 4.5×10-5 M para

benserazida y 2.7×10-4 M para levodopa, lo que corresponde a 0.13 mg y

0.53 mg de los respectivos fármacos. Luego, se agregó al mismo matraz

alrededor de 0.77 mg de la mezcla de excipientes, exactamente pesados.

La mezcla final fue suspendida en tampón Britton-Robinson 0.1 M, ajustado a

pH 6 y luego llevada a un volumen final de 10 mL.

Las disoluciones así preparadas fueron medidas por triplicado, utilizando la

cnica de voltamperometría de pulso diferencial.

a la valoración y determinación de

niformidad de contenido de comprimidos de liberación convencional Prolopa® de

olieron 20 comprimidos hasta obtener un polvo fino, del cual, una

ez homogenizado, se pesó una cantidad correspondiente a 100 mg de levodopa.

té

2.2.3 Aplicación a forma farmacéutica

La metodología desarrollada fue aplicada

u

Laboratorio Roche, conteniendo según lo declarado 200 mg de levodopa y 50 mg

de benserazida. Como método comparativo se utilizó el descrito por la

Farmacopea Británica 2003, basado en cromatografía líquida de alta eficiencia.

i) Valoración

Se pesaron y m

v

La fracción de polvo pesada fue disuelta en un matraz aforado de 100 mL con

ácido ortofosfórico 0.1 M y ayuda de ultrasonido. La suspensión obtenida fue

filtrada a través de filtro Millipore de 0.45 µm, transfiriéndose 1 mL de esta

solución a un matraz aforado de 10 mL, el que luego fue llevado a volumen con

fase móvil. La disolución resultante se analizó por HPLC y la metodología

desarrollada (VPD), para lo cual se transfirió una alícuota de 1030 µL a un matraz

aforado de 5 mL con tampón Britton-Robinson 0.1 M, ajustado previamente a

pH 6. Tanto las mediciones por voltamperometría de pulso diferencial como las

inyecciones por cromatografía líquida se realizaron por triplicado, registrando los

voltamperogramas y cromatogramas correspondientes.

18

Magdalena Pérez O.

ii) Uniformidad de contenido

Se realizó el análisis de 10 comprimidos en forma individual, los que fueron

pesados y disueltos en un matraz aforado de 100 mL con ácido ortofosfórico 0.1

N y ayuda de ultrasonido. La suspensión fue filtrada a través de un filtro Millipore

de 0.45 µm, de la cual se transfirió una alícuota de 500 µL a un matraz aforado

de 10 mL, enrasando a volumen con fase móvil. De esta disolución se inyectaron

20 µL en el cromatógrafo, y se transfirió una alícuota de 515 µL a un matraz

aforado de 10 mL, llevando a volumen con tampón Britton-Robinson 0.1 M, la

que fue analizada por voltamperometría de pulso diferencial. Las mediciones se

realizaron por triplicado, registrando los voltamperogramas y cromatogramas

correspondientes.

2.2.4 Cromatografía líquida de alta eficiencia

Los resultados de valoración y uniformidad de contenido determinados para cada

forma farmacéutica fueron comparados con los obtenidos mediante la

metodología descrita en Farmacopea, basada en HPLC. El análisis de los

comprimidos se realizó a un flujo de 1.2 mL/min y una temperatura de 30°C.

2.2.5. Estudio de estabilidad por voltamperometría de pulso diferencial

a) Condiciones de trabajo

Para cada pH al que se llevó a cabo el estudio, se preparó 5 mL de solución stock

de benserazida a una concentración 1.0×10-2 M en tampón Britton-Robinson 0.1

M, ajustado al pH correspondiente (2.0; 6.0; 7.0). Cada una de ellas se repartió

en 10 viales ámbar, los que fueron herméticamente sellados y posteriormente

dispuestos durante 5 horas a una temperatura de 40ºC.

19


20

Donde:

as de 125 µL de las disoluciones sometidas a

mperatura fueron tomadas cada una hora y llevadas a matraces aforados de 5

a determinar el orden de reacción se escogió el método

rafico28, en el cual si la resultante de la gráfica de la concentración remanente

ersus el tiempo es una línea recta, se trata de una reacción de orden cero,

del logaritmo natural de la

oncentración remanente versus o bien el inverso de la concentración remanente

ida media (t1/2), es el tiempo necesario para que reaccione la mitad de la

itad la concentración inicial de la sustancia inicial.

Para una reacción de primer orden, la vida media viene dada por la ecuación 4:

Ecuación 4.

Para cada pH estudiado, alícuot

te

mL, los cuales fueron enrasados con tampón Britton-Robinson 0.1 M ajustado a

pH 6, para obtener disoluciones finales de concentración 2.5×10-4 M, las que

fueron medidas por la técnica de voltamperometría de pulso diferencial y

cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC), utilizando el método descrito en

la Farmacopea Británica, al cual se le modificó el flujo de la fase móvil a 0.8

mL/min.

c) Determinación del orden de reacción

Como método par

g

v

mientras que si la resultante de la gráfica

c

versus tiempo, corresponden a una línea recta, se trata de una reacción de orden

uno o dos, respectivamente.

d) Determinación de la vida media

V

sustancia inicial presente, es decir, el tiempo necesario para que se reduzca a la

m

k = pendiente de la recta para cinética de orden uno.

k

221

ln/

t =

Magdalena Pérez O.

2.2.6. Determinación de la constante de disociación

A. Preparación de disoluciones


Se tomaron 1250 µL de disolución stock de benserazida, los que fueron llevados

a un matraz aforado de 50 mL, aforando con tampón Britton-Robinson 0.1 M,

bteniéndose una disolución de concentración final 2.5×10-4 M.

) Disolución blanco

espectral en un rango de pH de 2 a 12, utilizando

omo disolvente tampón Britton-Robinson 0.1 M, a la cual se fue incrementando

luciones concentradas de NaOH o HCl,

egún sea necesario, hasta alcanzar el pH requerido.

do un barrido de longitud de

nda entre 200 y 500 nm.

os resultados derivados del estudio de la influencia del pH en el comportamiento

espectral de benserazida, permitieron la determinación de dos de los pKa

aparentes del fármaco, mediante la ecuación de

o

b

Se realizó con tampón Britton-Robinson 0.1 M

B. Procedimiento

A partir de una disolución 2.5×10-4 M de benserazida, se estudió la influencia del

pH sobre su comportamiento

c

el pH en 0.5 unidades, empleando so

s

Las soluciones preparadas a cada pH fueron medidas en el espectrofotómetro con

cubetas de cuarzo de 10 nm de paso óptico, efectuan

o

L

Henderson-Hasselbach

modificada29:

21


Ecuación 5. )A(A

A)(AlogpKpH máx −

+= min

a −

onde: máx = máxima absorbancia en el intervalo de pH escogido

el intervalo de pH escogido ución en el intervalo de pH escogido

DAAmin = mínima absorbancia en A = absorbancia al pH de la disol

A partir de la representación gráfica de pH versus log [(Amáx - A)/(A - Amin)] se

obtiene una recta, cuyo intercepto corresponde al valor de pKa.

22

Magdalena Pérez O.

3. RESULTADOS Y

-200 0 200 400 600 800 10000

1

2

3

4

5

6

7

I / µ

A

E / mV

pH 2 pH 3 pH 4 pH 5 pH 6

A

-200 0 200 400 600 800 10000

1

2

3

4

5

6

7


B

I / µ

A

E / mV

-200 0 200 400 600 800 10000

1

2

3

4

5

6

7

I / µ

A

E / mV

I

II III IV

DISCUSIÓN

.1 Caracterización electroquímica

azida

.1.1.1 Voltamperometría de pulso diferencial en medio acuoso

el electrodo de

arbón vítreo.

En el intervalo de pH estudiado se observa una señal de oxidación

principal, bien definida, a potenciales relativamente bajos (señal I en Figura 2) y

otras tres señales a potenciales más anódicos, menos resueltas y de baja

intensidad de corriente, respecto a la principal (señales II, III y IV en Figura 2).

Todas las señales son pH dependientes y se desplazan progresivamente hacia

potenciales menos positivos, conforme aumenta el pH del medio.

Figura 2. Voltamperogramas de pulso diferencial de una disolución de benserazida 1×10-4 M en tampón Britton-Robinson 0.1 M a pH 2-6 (A), pH 6-10 (B). Inserto: voltamperograma a pH 6, en que se destaca cada una de las señales.

3

3.1.1 Comportamiento electroquímico de benser

3

Benserazida, en tampón Britton-Robinson 0.1 M, exhibe una respuesta

anódica bien definida en el intervalo de pH de 2 a 10, sobre

c

23

Resultados y discusión

24

2 4 6 8 100

1

2

3

4

5

6

7

Señal III

Señal II

Señal I

Ip /

µA

pH

Figura 3. A. Dependencia del potencial de pico (E

B

ciales de pico (EP) con el pH del medio se

uestra en la Figura 3 A. A partir de ella es posible inferir que los protones del

de oxidación para las señales I, II, III y

dependencia

neal con el pH, con pendientes de -62.9 mV/pH para la señal I entre pH 2 y 10

8), -50.0

V/pH para la señal III entre pH 2 y 6 (r2=0.9924) y -45.0 mV/pH para la

endencia con los protones del medio se puede observar también

ara el comportamiento de la corriente de pico (IP) de la señal I, la cual se

muy baja, va

incrementando su valor, en forma concomitante con la disminución de la

corriente de la señal I. Por último, la señal IV, que se insinúa entre pH 4 y 6

presenta intensidades de corrientes aún menores (no incluida en Figura 3B).

B. Dependencia de orriente de pico (IP) con el pH. Disolución de benserazida 1×10-4 M en tampón Britton-

La evolución de los poten

m

medio están involucrados en el proceso

IV. En efecto, estas cuatro ondas voltamperométricas exhiben una

li

(r2=0.9994), -54.0 mV/pH para la señal II entre pH 5 y 10 (r2=0.994

m

señal IV, que aparece entre pH 4 y 6 (r2= 0.9609).

Esta dep

p

mantiene estable a pH ácidos, para decrecer a pH neutros y alcalinos

(Figura 3 B). Este comportamiento ha sido observado previamente con

compuestos polifenólicos estructuralmente relacionados, del tipo alquilgalatos30.

Por otra parte, la señal II presenta una intensidad de corriente muy baja,

alrededor de 5 a 6 veces menor que la señal I, en tanto que la señal III, que

aparece alrededor de pH 5 con una intensidad de corriente

-150

0

150

300

450

600

750

A

Ep

/ mV

Señal II

Señal III

Señal I

Señal IV

P) con el pH.

2 4 6 8 10

pH

cRobinson 0.1 M.

Magdalena Pérez O.

Con el objetivo de dilucidar si los cambios que sufren las señales

secundarias de benserazida (señales II y III) con el pH, tienen alguna relación

con el pKa de la molécula, se realizó el estudio de la influencia de pH, en tampón

Britton-Robinson, sobre los máximos de absorción que presenta benserazida por

espectroscopia UV-Visible. La Figura 4 presenta los espectros obtenidos para

benserazida en un rango de pH de 2.0 a 12.0. Los espectros presentan máximos

de absorción importantes a 230 nm y 273 nm. A medida que aumenta la

alcalinidad del medio, se genera un desplazamiento

250 300 350 400 450 5000.0

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

0.5

B

Abs

orba

ncia

λ / nm

pH 7.5 pH 8.0 pH 8.5 pH 9.0 pH 9.5 pH 10.0 pH 11.0 pH 11.5 pH 12.0

aproximadamente.

250 300 350 400 450 5000,0

0,5

1,0

1,5

hipercrómico de los máximos

e absorción mencionados y aparecen otros dos a 340 y 410 nm,

5×10-4 M en tampón Britton-Robinson

de la absorbancia con el pH a

a presenta dos saltos importantes,

gura 5). Los datos obtenidos en

dos de los pKa de benserazida, de

ach mo a (Ecuación 5). Los

valores de pKa para el fármaco fueron calculados por el método de regresión

lineal, donde el pH fue la variable dependiente y el log [(Amáx - A)/(A - Amin)] la

variable independiente, como se presenta en la Figura 6. De esta forma, los

2,0

d

pH 1.5 pH 2.0 pH 2.5 pH 3.0 pH 5.5 pH 6.0 pH 6.5 pH 7.0

Abs

orba

ncia

λ / nm

pH 3.5 pH 4.0 pH 4.5 pH 5.0

A

Figura 4. Espectros de absorción de benserazida 2.

0.1 M, a pH 1.5-7.0 (A) y pH 7.5-12.0 (B)

Al graficar la evolución

272 nm, se puede observar que benserazid

entre pH 4 y 6 y pH 9 y 12, respectivamente (Fi

este estudio fueron utilizados para calcular

acuerdo a la ecuación de Henderson-Hasselb dificad

valores de pKa obtenidos fueron de 5.44 y 10.91.

25


26

-1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0

4,5

5,0

5,5

6,0

6,5

C

LOG((Amax-A)/(A-Amin))

2 4 6 8 10 120,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9 272 nm

Abs

orba

ncia

2 4 6 8 10 12

1,6

1,8

2,0

2,2

2,4

2,6

2,8Ab

sorb

anci

a230 nm

pH

-0,5 0,0 0,5 1,0 1,5

8,5

9,0

9,5

10,0

10,5

11,0pH

LOG((Amax-A)/(A-Amin))

pH

5 – 12.0) a λ 230 y 272 nm.

Figura 6.

Hasselb

Figura 5. Dependencia de la absorbancia con el pH (1.

pH = 5.441 – 1.250 log((Amax-A)/(A-Amin)) r = 0.9961

pH = 10.908 – 1.993 log((Amax-A)/(A-Amin)) r = 0.9920

Determinación de pKa por UV-Vis mediante la ecuación de Henderson-

ach

Comparando los pKa calculados para benserazida con el comportamiento

electroquímico, se podría decir que, aparentemente existe una relación entre el

pKa calculado de 5.44 con la aparición de la señal II a pH 5 y la desaparición de

la señal III a pH 6.0, y en consecuencia, que las señales observadas se deban a

un cambio de la especie que se oxida, de ionizada a desionizada.

Magdalena Pérez O.

3.1.1.2 Voltamperometría cíclica

Con el fin de completar los estudios electroquímicos básicos de

benserazida, se empleó la técnica de voltamperometría cíclica, utilizando como

electrodo de trabajo el electrodo de carbón vítreo. El estudio se realizó en medio

acuoso a diferentes pH y velocidades de barrido.

Los voltamperogramas cíclicos de benserazida en medio acuoso exhiben

dos señales de oxidación a pH 2.0 y pH 6.0 (Figuras 7 A-D), las cuales presentan

máximos aproximadamente a 500 y 750 mV (pH 2), y a 250 y 750 mV (pH 7).

Por otra parte, a pH 8.0, la solución originalmente traslúcida se torna amarilla y

por VC se observan tres señales de oxidación poco definidas. En todos los casos,

el pH del medio, sin la aparición de nuevas señales en los barridos de vuelta a pH

6 y 8, indicando que el proceso de oxidación es de carácter irreversible a esos pH

(Figuras 7 C-F). situación se produce a pH 2, ya que en los

voltamperogramas cíclicos realizados, si bien no se define una señal clara en los

barridos de vuelta, a velocidades de barrido elevadas (Vb > 1 V/s) es posible

observar la aparición de nuevas señales a potenciales cercanos a 300 y 600 mV

(Figura 7 B).

A objeto de clarificar las dependencia de las señales en cada

voltamperograma, se realizaron experimentos cambiando el potencial final de los

barridos a una velocidad fija (0.1 V/s). De este estudio se pudo apreciar que la

segunda señal de oxidación aparece en un barrido corto, entre 600 y 1000 mV,

una etapa independiente en el proceso de oxidación del fármaco

(Figura 8). Por otra parte, la primera onda en el barrido de vuelta depende de la

primer

disminuye al aumentar la velocidad de barrido) dependa de ésta.

estas señales se desplazan hacia potenciales menos positivos conforme aumenta

Distinta

en consecuencia, esta señal podría depender de la primera, así como podría

tratarse de

a señal de oxidación con un ΔEP=71 mV (que se hace mayor conforme

aumenta la velocidad de barrido), mientras que no se puede asegurar que la

segunda onda con un ΔEP=306 mV respecto a la segunda señal de oxidación (que

27


28

2

0 250 500 750 1000 1250 1500 1750-100

-50

0

50

100

150

200

50A

500

600

I / µ

A

E / mV0 250 500 750 1000 1250 1500 1750

-200

-100

0

100

200

300

400

B

I / µ

A

E / mV

0 250 500 750 1000 1250 1500 1750-50

0

50

100

150

200

250C

I / µ

A

E / mV0 250 500 750 1000 1250 1500 1750

-150

0

150

300

450

600

750D

I / µ

A

E / mV

-500 0 500 1000 1500

-200

0

200

400

600

800 F

I / µ

A

E / mV

olución de benserazida 1×10-3 M en tampón

-500 0 500 1000 1500-100

0

100

200

300 E

I / µ

A

E / mV

Figura 7. Voltamperogramas cíclicos. DisBritton-Robinson 0.1 M. A, C y E: Vb de 0.1 V/s a 0.9 V/s a pH 2.0, 6.0 y 8.0, respectivamente. B, D y F: Vb de 1.0 V/s a 5.0 V/s a pH 2.0, 6.0 y 8.0, respectivamente.

Magdalena Pérez O.

29

500

520

2.00 2.25 2.50 2.75 3.00 3.25 3.50 3.75

420

440

460

480

540

E /

mV

Log V

A

2,00 2,25 2,50 2,75 3,00 3,25 3,50 3,75780

800

820

840

860

880

900

E /

mV

230

240

250

Log V

2.00 2.25 2.50 2.75 3.00 3.25 3.50 3.75170

180

190

200

210

220

Ep

/ mV

B

2,00 2,25 2,50 2,75 3,00 3,25 3,50 3,75600

620

Log Vb

640

660

680

700

Ep /

mV

-200-10

0

30

Log Vb

0 200 400 600 800 1000 1200

10

20

40 A 40I /

µA 20

30

E / mV

Figura 8. VC de benserazida a diferentes barridos de potencial. pH 2 (A) y pH 6 (B).

Con el propósito de aclarar la reversibilidad del proceso redox involucrado,

se evaluó el comportamiento de los potenciales de oxidación, respecto a la

velocidad de barrido (Figura 9). En esta figura se puede observar que los

potenciales de oxidación son dependientes de la velocidad de barrido,

sustentando el carácter irreversible de la reacción31

-200 0 200 400 600 800 1000 1200-10

Figura 9. Dependencia de EP con log Vb a pH 2.0 (A) y a pH 6 (B). Disolución de benserazida 1×10-3 M en tampón Britton-Robinson 0.1 M. Insertos: Dependencia de EP con log Vb de la segunda señal.

0

10

B

µI /

A

E / mv


30

2,00 2,25 2,50 2,75 3,00 3,25 3,50 3,750,75

1,00

1,25

1,50

1,75

2,00

2,25

2,50 Pico 1 Pico 2

Log

Ip

Log Vb

B

Se estudió también el comportamiento de la variación de la corriente

respecto al incremento de la velocidad de barrido (log IP versus log Vb), con el

propósito de obtener información acerca de la naturaleza del proceso redox

involucrado en la oxidación del compuesto. De esta manera, si la pendiente del

gráfico log IP - log Vb tiende a 1, el proceso estará controlado por la adsorción de

la especie electroactiva sobre el electrodo de trabajo, mientras que si la

pendiente es cercana a 0.5 el proceso estará controlado por difusión32. Al

respecto, benserazida a los distintos pH estudiados, presenta una dependencia

lineal entre log IP y log Vb, con pendientes cercanas a 0.5, valores que indican

que el proceso de oxidación tiene un control difusivo (Figura 10). Sin embargo,

como se puede observar en la Figura 11, la gráfica de corriente de pico (IP)

versus la raíz cuadrada de la velocidad de barrido (Vb1/2), presenta dos tramos de

linealidad a los pH estudiados, evidenciándose más a pH 6 (Figura 11 B),

sugiriendo que, a ciertas velocidades de barrido, el proceso de oxidación no es

controlado completamente por difusión, existiendo adsorción de la especie

oxidable o de alguno de sus productos de oxidación.

Figura 10. Dependencia de log IP con log Vb a pH 2.0 (A). Dependencia de EP con log Vb (B). Disolución de benserazida 1×10-3 M en tampón Britton-Robinson 0.1 M.

2.00 2.25 2.50 2.75 3.00 3.25 3.50 3.751.00

1.25

1.50

1.75

2.00

2.25

2.50

A Pico 1 Pico 2

Log

Ip

Log Vb

Magdalena Pérez O.

10 20 30 40 50 60 700

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220 Pico 1 Pico 2

Ip /

µA

Vb1/2

A

10 20 30 40 50 60 700

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220 Pico 1 Pico 2

Ip /

µA

Vb1/2

B

Figura 11. Dependencia de IP con Vb1/2 a pH 2.0 (A) y a pH 6 (B). Disolución de

Tabla 1.

benserazida 1×10-3 M en tampón Britton-Robinson 0.1 M.

Parámetros cinéticos obtenidos por VC para benserazida a pH 2.0 y 6.0

pH Señal δlog IP/δ log Vb

2 2 0.5855 1 0.4474

6 1 0.4484

3.1.1.3 Voltamperometría hidrodinámica

Con el propósito de corroborar el tipo de control involucrado en el proceso

perficie del electrodo de carbón vítreo, se

ineal con el electrodo de disco rotatorio,

ódico no es controlado por difusión, en todo el

tudiado, lo que se complementa con los

tamperométrico realizado anteriormente.

oxidativo de benserazida sobre la su

utilizó la técnica de voltamperometría l

obteniéndose que el proceso electr

intervalo de velocidades de rotación es

resultados derivados del estudio ciclovol

evich, esto es, se graficó la corriente límite versus la raíz de la velocidad de

rotación del electrodo, de esta forma, en la Figura 12, se observa que no existe

un comportamiento lineal en todo el intervalo estudiado, sugiriendo que a

Los resultados obtenidos se representan de acuerdo a la ecuación de

L

31


32

0 2500

500 750 1000

10

20

30

40

I lim /

uA

E / mV

100 rpm 200 rpm 300 rpm 400 rpm

A

20

40

60

80

0 250 500 750 10000

BI lim

/ uA

E / mV

500 rpm 1000 rpm 1500 rpm 2000 rpm 2500 rpm 3000 rpm

20 25 30 35 40 45

9

10

11

12

13

14

15C

I lim/ µ

A

velocid

igura 12. A y B. Voltamperogramas hidrodinámicos de benserazida sobre el electrodo de carbón vítreo a pH 6. C. Dependencia de la corriente límite con la velocidad de rotación.

ω1/2

ades menores a 500 rpm y mayores a 2000 hay adsorción de la especie

electroactiva, probablemente, debido a la formación de películas sobre la

superficie de trabajo. Este comportamiento a velocidades elevadas podría

deberse a que, bajo estas condiciones el flujo ya deja de ser laminar, mientras

que a velocidades bajas de rotación, es probable que la velocidad de reacción sea

mucho mayor a la velocidad con que difunde la especie, hacia la superficie del

electrodo. Además, como la recta de la gráfica de Ilim frente ω1/2 no pasa por el

origen, se vuelve a corroborar que el proceso de oxidación es irreversible33.

F

Magdalena Pérez O.

3.1.1.4 Electrólisis a Potencial Controlado

La electrólisis a potencial controlado se realizó con el fin de identificar los

intermediarios y productos de oxidación generados a partir de la reacción de

oxidación de benserazida, así como también, si es que es posible, calcular el

número de electrones transferidos en el proceso de electro-oxidación. Para ello

se utilizaron soluciones de benserazida a pH 2.0, 3.0 y 7.0; las que fueron

sometidas a electrólisis a un potencial constante de 400, 650 y 130 mV,

respectivamente; durante 120, 60 y 90 minutos para cada caso. El potencial de

de benserazida a cada valor de pH (Figura 2); de esta manera, con los estudios

alizados a pH 2 y 7 se espera obtener información sobre la primera etapa del

un potencial que produce la ión de tod ódicas observadas,

información sobre el proceso global.

En las Figur T) versus

tiempo y la evolución de la corriente con el tiempo de electrólisis,

estos datos experimentales y empleando la ecuación

e Faraday, se calculó el número de electrones transferidos a cada pH estudiado.

fue de 1.42 ± 0.16,

± 0.65 y 0.73 ± 0.04, para pH 2.0, 3.0 y 7.0, respectivamente.

ustancialmente de lo esperado.

C

electrólisis fue escogido de acuerdo al potencial de oxidación de la señal principal

re

proceso electroquímico, mientras que con el ensayo realizado a pH 3, al aplicar

oxidac as las ondas an

as 13 A-F se presentan las gráficas de carga total (Q

respectivamente. A partir de

d

De esta forma, el número de electrones encontrado

7.87

Desde el punto de vista teórico, y tomando como base otra moléculas

análogas, tanto de derivados catecólicos36,37 como pirogálicos, se deberían

encontrar dos electrones para la oxidación de la benserazida. Al respecto, de los

valores encontrados experimentalmente, el de 1.3 obtenido a pH 2.0, es el que

más se acerca a lo esperado; en tanto que los otros, para pH 3.0 y 7.0, difieren

s

abe destacar que la literatura reporta, que la oxidación de compuestos

de tipo polifenólicos, a excepción de los catecólicos, involucra inusualmente un

33


34

0 20 40 60 800,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

número mayor de electrones que el número de hidroxilos en la molécula, y que

los catecoles, con dos hidroxilos, presentan valores de dos electrones a pH

menores a 7, pero que aumentan drásticamente a pH mayores a 7. Este inusual

gran número de electrones en los compuestos fenólicos, estaría íntimamente

relacionado con la irreversibilidad de los voltamperogramas cíclicos, debido

reacciones químicas posteriores a las reacciones electroquímicas34. Lo anterior

podría dar cuenta del valor de 10 electrones encontrado experimentalmente.

4,5

D

I / µ

A

10 20 30 40 50 600,5

1,0

1 ,5

2 ,0

2 ,5

3 ,0

3 ,5

4 ,0

4 ,5

t / m in

C

QT

A p licando 650 m VBritton-R ob inson pH 3

t / m in

0 20 40 60 80 100 1201,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

B

Ip /

µA

t / m in0 20 40 60 80 100 120

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

QT

t / m in

AAplicando 400 m VBritton-R ob inson pH 2

0 20 40 60 80 100

0,1

0 ,2

0 ,3

0 ,4

0 ,5

0 ,6

0 ,7 E

QT

t / m in

B ritton R ob inson pH 7A p licando 130 m V

0 20 40 60 80 100

2,5

3 ,0

3 ,5

4 ,0

4 ,5

5 ,0

5 ,5

6 ,0 F

I / µ

A

t / m in

la intensidad de corriente de la señal principal de benserazida con el tiempo de electrólisis para los tres pH evaluados (B, D, F).

Figura 13. Izquierda: carga total versus tiempo para benserazida y tampón Britton-Robinson 0.1 M a pH 2, 3 y 7 (A, C, E). ■ Benserazida, ● Britton Robinson. Derecha: cambio en

Magdalena Pérez O.

Adicionalmente, la electrólisis de benserazida se llevó a cabo por la técnica de

spectro-electroquímica, encontrándose que a medida que transcurre el tiempo de

ectróli

3 (338 nm)

n la Figura 15 se muestran los cromatogramas obtenidos, observándose

que aún c

la aparición de nuevas señales.

e

el sis, las bandas principales del compuesto a 231 y 274 nm sufren un cambio

hipercrómico, perdiendo el espectro rápidamente su morfología inicial.

En la Figura 14 A, es posible observar, que ya a los 5 minutos de electrólisis se

genera una nueva banda bien definida, cercana a los 338 nm, y otra mucho menos

insinuada a los 390 nm, ambas sufren también un cambio hipercrómico con el transcurso

de la electrólisis, definiendo al final de ésta un espectro completamente diferente al que

presenta benserazida.

0,6

0,8

1,0

1,2

Figura 14. A. Evolución del espectro ultravioleta correspondiente a la electrólisis a potencial controlado de benserazida a pH 6, aplicando un potencial de 200 mV cada 5 minutos. B. Evolución de las bandas de absorbancia 1 (231 nm), 2 (274 nm),y 4 (390 nm).

0 20 40 60 80 1000,0

Con el objetivo de obtener algo más de información sobre el o los

productos de electrolisis generados, se procedió a inyectar en el cromatógrafo

líquido las soluciones de pH 2.0 y 3.0, sometidas a electrólisis a potencial

constante.

E

uando la disminución del pico cromatográfico de benserazida es

notoria, siendo ésta de un 60% en el primer caso, y casi total en el segundo, sin

0,2

0,4

B

338 nm

231 nm

anci

a

390 nm

274 nm

Abs

orb

t / min300 400 500 600

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2A

3

2

4

Abs

orba

ncia

0 min 5 min 15 min 25 min 35 min 90 min

1

λ / nm

35


36

10

Por otra parte, el cambio que se presenta entre 1 y 2 minutos en el

segundo cromatograma, se podría explicar por la extracción previa a la que fue

sometida la muestra, con el fin de lograr identificar algún producto de

degradación generado en la electrólisis que pudiera encontrarse en trazas,

pudiéndose deber entonces a trazas del solvente empleado. Considerando lo

anterior, la desaparición de la señal de benserazida, en este caso, tal vez, no se

0 2 4 6 80,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

Abs

orba

ncia

t / min

Blanco (Britton-Robinson pH 2.0) Benserazida estándar Benserazida electrolizada

deba a su electrólisis total, sino a que no se logró su extracción de manera

adecuada.

0 1 2 3 4 50,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

Blanco (Britton-Robinson pH 3.0) Benserazida estándar Benserazida electrolizada

Abs

orba

ncia

t / min

Figura 15 A. Cromatograma de la solución electrolizada a pH 2. B. Cromatograma del extracto clorofórmico de la solución electrolizada a pH 3.

Magdalena Pérez O.

En base a los resultados obtenidos y a los antecedentes bibliográficos previos,

benserazida experimentaría una oxidación vía dos electrones y dos protones, de

acuerdo a:

Para lo cual se puede postular el siguiente mecanismo:

No obstante, los resultados obtenidos a pH 7 dan cuenta que el proceso

global de oxidación de benserazida, involucra un número de electrones mayor a

lo propuesto, por lo que es probable la formación de dímeros en las reacciones

posteriores a la reacción electroquímica propuesta.

OH

OH

OH

NHNH OH

O

NH22H+ + 2e-

OH

O

O

NHNH OH

O

NH2

OH

O

NHNH OH

O

NH2

OH

OH

OH

OH

NHNH OH

O

NH2

C

OH

O

NHNH OH

O

NH2

OH C

OH

O

NHNH OH

O

NH2

OH

CH

OH

O

OHNH

NH OH

O

NH2

OH

O

NHNH OH

O

NH2

OH

C

OH

O

NHNH OH

O

NH2

OH

OH

O

O

NHNH OH

O

NH2

- H+, e-

- H+, e-

37


-200 0 200 400 600 800 10000

1

5

6

2

3

4

7

8

I / µ

A

E / mV


-200 0 200 400 600 800 10000

4

5

6

B7

8

1

2

3


I / µ

A3.1.2

ado que las formulaciones farmacéuticas de benserazida se encuentran

asociad

e sentido, levodopa en tampón Britton-Robinson 0.1 M

presenta un comportamiento similar a benserazida, sobre el electrodo de carbón

vítreo, mostrando una respuesta anódica bien definida en un rango de pH de 2.0

a 10 y una o dos ondas mal resueltas, a potenciales más anódicos, las cuales se

insinúan a partir de pH 6 en adelante (Figura 17).

10 (B).

Figura 16. Estructura química de levodopa

Comportamiento electroquímico de levodopa

3.1.2.1 Voltamperometría de pulso diferencial en medio acuoso

D

as a levodopa, y a que presenta una estructura química similar

(Figura 16), se procedió a realizar el estudio de la respuesta electroquímica de

esta última, en condiciones experimentales análogas a las estudiadas con

benserazida. En est

OH

OHNH2

OH

O

A

E / mV

Figura 17. Voltamperograma de pulso diferencial de levodopa en tampón Britton-

Robinson 0.1 M a pH 2-6 (A), pH 6-

38

Magdalena Pérez O.

La evolución del potencial de pico (EP) de la señal principal con el pH del

medio se presenta en la Figura 18 A. En ella es posible observar un

comportamiento análogo a la benserazida, con una dependencia lineal entre

potenciales y pH, con una pendiente de 52.5 mV/pH (r2=0.9986), evidenciando

que el proceso de oxidación depende de la concentración de protones del

medio35. Esta dependencia con los protones del medio se puede observar

también para el comportamiento de la corriente de pico (IP), la cual se mantiene

estable a pH

2 4 6 8 100

1

2

3

4

5

6

7

8

I P /

µA

pH

B

2 4 6 8 100

100

200

300

400

500

EP

/ mV

pH

A

ácidos, para decrecer a pH neutros y alcalinos (Figura 18 B).

Lo anterior corrobora lo que ya está descrito en la literatura, pues se sabe

que el mecanismo de oxidación de levodopa involucra dos electrones,

acompañado por el mismo número de protones35- 37.

Figura 18. A. Dependencia del potencial de pico (EP) con el pH en tampón Britton-Robinson 0.1M. B. Dependencia de corriente de pico (IP) con el pH en tampón Britton-Robinson 0.1 M. 3.1.2.2 Voltamperometría cíclica

El comportamiento electroquímico de levodopa también fue estudiado por

voltamperometría cíclica en medio acuoso. Tanto los voltamperogramas cíclicos

ráfica EP versus log Vb muestran un perfil de oxidación seudo

V,

como la g

reversible, con potenciales de pico anódico y catódico a 240 y 280 m

39


40

2,4

2,6

2,8

3,0

3,2

3,4

3,6

2,0 2,5 3,0 3,5 4,0

log

I P

A

y = a + b*x

a = 1.67792b = 0.4419R2= 0.99949

0 20 40 60 80 100

500

1000

1500

2000

2500

3000

Log Vb

0

y = a + b*x

a = 116.715b = 27.2008R2= 0.99905

I P / µA

b

B

V 1/2

2.0 2.5 3.0 3.5 4.0300

325

350

375

400

425

450

EP /

mV

Log Vb

B

0 250 500 750 1000 1250 1500

-200

0

200

400

600

0.1 V/sI / µ

A

E / mV

10 V/sA

menta de manera lineal con el logaritmo de la velocidad de barrido

entre 0.1 y 10 v/s, con una pendiente de 0.4419 (r= 0.99949), lo que sugiere

que el mecanismo oxidativo para este compuesto opera principalmente por

difusión (Figura 20).

Figura 19. Voltamperogramas cíclicos. Disolución de levodopa 1×10-3 M, en tampón Britton-Robinson 0.1 M, pH 2 (A). Dependencia de EP con log Vb (B).

encia de IP con Vb (B).

respectivamente (Figura 19). Por otra parte, en la evaluación de la influencia de

la velocidad de barrido en el proceso de oxidación, el logaritmo de las corrientes

de pico incre

Figura 20. Dependencia de log IP con log Vb (A). Depend 1/2

Magdalena Pérez O.

41

3.2. D rollo de la metodología electroanalítica

.2.1 Selección de condiciones óptimas

A objeto de encontrar las condiciones analíticas óptimas para la

Figura 21. Voltamperogramas superpuestos de benserazida y levodopa en tampón Britton-Robinson 0.1 M, pH 6 (A) y ácido clorhídrico 0.1 M (B).

Cuando se ensayó tampón Britton-Robinson a pH 5, 6 y 7, se obtuvo que

aún cuando ambas señales no se resolvían del todo, era posible identificar los

máximos de cada una, mientras que a menores valores de pH no se logró la

resolución completa ni parcial de ambas señales (Figura 22 B).

4

6

8

esar

3

determinación de benserazida en presencia de levodopa, se llevó a cabo un

estudio detallado del comportamiento de potenciales y corrientes de pico versus

pH, y distintos medios de disolución (tampón Britton-Robinson, HCl y HClO4)

para las mezclas entre ambos fármacos, ya que, dado a la similitud estructural

entre ellos, las señales de oxidación respectivas se producen en regiones de

potencial bastante cercanas complicando su determinación cuando se encuentran

en mezcla (Figura 21)

107

0 200 400 600 800 1000 12000

2

B

E / mV

I / µ

A

Levovopa Benserazida

-200 0 200 400 600 800 1000 12000

1

2

3

4

5

6

Levodopa Benserazida A

Ip /

µA

E / mV


Adicionalmente, a pH iguales o mayores a 7, pese a que se logra una

mejor separación de dichas señales,

15

20

25

-200 0 200 400 600 800 1000 12000

5

10I /

E / mV

µA

5.0x10-4 M 1.0x10-4 M 5.0x10-5 M

A

15

20

25

-200 0 200 400 600 800 1000 12000

5

10I /

E / mV

µA

5.0x10-4 M 1.0x10-4 M 5.0x10-5 M

B

al (I) de benserazida es mucho menor respecto a la señal secundaria, que

a estos pH resulta ser de mayor intensidad (Figura 22 B), pero que, en este caso,

se ve solapada por la presencia de levodopa.

la intensidad de corriente de la señal

princip

Figura 22. Voltamperogramas de mezclas benserazida-levodopa (1:1) en tampón Britton-Robinson 0.1, M a pH 6 (A) y pH 7 (B).

Considerando lo anteriormente dicho, se seleccionó tampón Britton-

Robinson 0.1 M a pH 6 para la determinación analítica (Figura 23 A). Bajo estas

condiciones, benserazida exhibió un pico de oxidación y una onda anódica poco

definida y de baja intensidad a aproximadamente 100 y 300 mV

respectivamente, empleándose la primera señal para su cuantificación.

n tampón Britton-Robinson 0.1 M.

En la Figura 23 se ilustra el efecto de la mezcla de ambos compuestos, en

distintas proporciones, sobre los voltamperogramas en ácido perclórico 0.1 M y

e

42

Magdalena Pérez O.

0 250 500 750 1000 1250

0

2

4

6

8

10

12

14

16

B

I / µ

A

2

4

6

8

12

E / mV0 250 500 750 1000 1250

0

10A

I / µ

A

E / mV

Figura 23. Benserazida 5×10-5 M en presencia de distintas concentraciones de levodopa .0x10-5 M – 2 x 10-4 M), en tampón Britton-Robinson 0.1 M, pH 6 (A) y HClO4 0.1 M (B).

.2.2 Curva de calibración

Primeramente se realizó un estudio de concentración en un rango amplio

de manera de seleccionar el intervalo

inámico más adecuado (Figura 24). A partir de este estudio se observó una

2.5×10-4 M, por lo que fue en este intervalo en el que se construyó la curva de

alibración (Figura 25), la que quedó definida por la siguiente ecuación:

IP [µA] = 0.2907 [µA] + 52657 [µA/M] · C [M] (r = 0.9995;n = 9)

En la Tabla 2 se resumen los parámetros de eficiencia analítica para el

étodo por voltamperometría de pulso diferencial desarrollado. En esta tabla es

ara los ensayos de repetibilidad y reproducibilidad a los tres niveles de

oncentración ensayados, y porcentajes de recuperación superiores al 98%.

(5

3

de trabajo, desde 2.5×10-5 M a 2.5×10-3 M,

d

respuesta lineal de la corriente de pico (IP) con la concentración entre 2.5×10-5 M

y

c

m

posible apreciar que se obtuvieron coeficientes de variación aceptables (<2%),

p

c

43


50

0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,250

2

4

6

8

10

12

14

y = a + b*x

a = 0.29078b = 52657.9R2= 0.99955

I / µ

A

Concentración / mM-200 0 200 400 600 800 1000 12000

2

4

6

8

10

12

14

16

18

I / µ

A

E / mV

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.50

10

20

30

40

Ip /

µA

Concentración / mM-200 0 200 400 600 800 1000 12000

5

10

15

20

25

30

40

45

35

Ip /

µA

Figura 25. Curva de calibración por VPD para benserazida (2.5×10-5 M - 2.5×10-4 M) en

Tabla 2. Parámetros de eficiencia analítica de la metodología por VPD

E / mV

Figura 24. Estudio de concentración de benserazida (2.5×10-5 M - 2.5×10-3 M) en tampón Britton-Robinson 0.1 M a pH 6.

tampón Britton-Robinson 0.1 M a pH 6.

Repetibilidad (CV %) 1.09 (4.0×10-5 M)- 1.54 (1.0×10-4 M) - 1.64 (2.0×10-4 M)

Reproducibilidad (CV %) 1.41 (4.0×10-5 M) - 1.08 (1.0×10-4 M) - 1.86 (2.0×10-4

Límite detección (M) 7.12×10

M)

Límite cuantificación (M) 9.49×10-6

% Recuperación 98.5 (4.5×10-5 M) - 99.7 (2.0×10-4 M)

-6

44

Magdalena Pérez O.

45

500 750 1000 1250

4

16

0 2500

2

6

8

10

12

14

I / µ

A

E / mV

Benserazida pH 6 Hidrólisis ácida Hidrólisis básica

3.2.3

ble que se deba

sólo a la presencia del analito, libre de interferentes, tales como productos de

degradación. Además se incluye la evaluación del comportamiento de la señal

electroquímica de benserazida, frente a la presencia de algunos de los

excipientes presentes en las formulaciones farmacéuticas disponibles en el

mercado nacional que contienen este principio activo.

Como resultado del ensayo de hidrólisis ácida se observa un corrimiento

en el potencial de la señal principal de benserazida así como también un aumento

en la anchura y una leve disminución en la intensidad de corriente de ésta.

Además se puede notar la desaparición de las señales poco definidas que

).

igura 26. Voltamperogramas de benserazida en tampón Britton-Robinson 0.1 M pH 6,

espués de ser sometida a hidrólisis ácida y básica.

Estudios de Selectividad

El estudio de selectividad, en este caso incluye ensayos de degradación

hidrolítica, fotolítica y de termólisis, con la finalidad de comprobar si la

metodología desarrollada es capaz de producir una señal medi

aparecen entre 250 y 600 mV, y la aparición de una nueva señal a

aproximadamente 800 mV (Figura 26

F

d


46

0 250 500 750 1000 1250

10

14

16

0

2

4

6

8

12

t = 0 días t = 7 horas

tos de degradación generados (Figura 28). Con estos resultados podemos

inferir que los productos de degradación de benserazida, bajo estas condiciones,

serían electroactivos y que sufrirían oxidación electroquímica en regiones de

potencial cercanas a su precursor, interfiriendo en la determinación de éste por

VPD.

I / µ

A

E / mV

Cuando benserazida es sometida a hidrólisis alcalina, la señal principal

cambia completamente su forma, presentándose más ancha y de menor

intensidad a potenciales menos positivos que a los que aparece el estándar, y

aunque al igual que en el caso anterior desaparecen las señales poco definidas

que se producen entre los 250 y 600 mV, no observándose la aparición de

nuevas señales de oxidación (Figura 26).

En la Figura 27 se observa que bajo condiciones de temperatura extrema,

a excepción del leve cambio que presenta el voltamperograma de benserazida

entre 250 y 900 mV, no existen diferencias respecto al desplazamiento e

yectar parte de la misma solución al cromatógrafo, se puede observar que a

s 7 horas de reacción, el área del pico cromatográfico de benserazida

os) ha decrecido un 77% respecto a la inicial, así

omo también se aprecian otras seis señales correspondientes a los posibles

produc

Figura 27. Voltamperogramas de benserazi tton-Robinson 0.1 M pH 6, espués de ser sometida a una temperatura de 60° durante 7 horas (benserazida .5×10-4 M en agua).

intensidad de la señal principal de una disolución estándar. Sin embargo, al

in

la

(aproximadamente a 3 minut

c

da en tampón Brid2

Magdalena Pérez O.

47

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

0.18

0 2 4 6 8 10 12 14

32

A, 2

20 n

m

t / min

0 horas 7 horas

1

200 250 300 350 4000.000

0.005

0.010

0.015

0.020

1

Abso

rban

cia

λ / nm

200 250 300 350 4000.00

0.05

0.10

0.15

0.20

2

Abs

orba

ncia

λ / nm200 250 300 350 400

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

3

Abso

rban

cia

λ / min

nte 7

ida

los

que

igura 29 B, el espectro de benserazida en

mpón Britton-Robinson 0.1 M pH 6, presenta máximos de absorción a 230 y

273 nm. ores de

bsorbancia a las longitudes de ondas mencionadas, insinuándose un tercer

medida que el tiemp

u

Figura 28. Cromatograma de benserazida en agua, sometida a 60ºC durahoras. Inserto: espectros UV de cada señal.

De manera similar a lo que ocurre con la degradación de benserazida bajo

condiciones de temperatura extrema, cuando la solución del fármaco es somet

a fotólisis, no se producen nuevas señales de oxidación ni se observan

variaciones en cuanto a morfología e intensidad en la señal principal en

voltamperogramas, aún cuando la solución se torna de color amarillo, por lo

se procedió a medir la muestra por espectrofotometría y HPLC, para corroborar

su potencial fotodegradación y los productos derivados de ésta.

Como se puede apreciar en la F

ta

Las soluciones fotolizadas muestran un aumento en los val

a

máximo a 325 nm a o de fotólisis aumenta, lo que es

concordante con el color q e presenta la solución.

Resultados y discusión Resultados y discusión

0 250 500 750 1000 1250

2

4

6

0

8

10

16

1212

1414

E / mV

t = 0 días t = 8 días 2.0

I / µ

AA

0.0

1.5

250 300 350 400 450 500

0.5

1.0

B

Abs

orba

n

t / min

cia

48

0

8

10

16

0 250 500 750 1000 1250

2

4

6

E / mV

t = 0 días t = 8 días 2.0

I / µ

AA

0.0

1.5

250 300 350 400 450 500

0.5

1.0

0 hB 48 h

96 h 192 h

cia

Abs

orba

n

t / min

250 300 350 400

0.00

0.01

0.02

0.03

ab

sorb

anci

a

λ

1

250 300 350 400

0,0000

0,0025

0,0050

0,0075

0,0100

2

abso

rban

cia

λ

250 300 350 400

0,00

0,01

0,02

0,03

3

abso

rban

cia

λ

250 300 35

0,000

0,025

0,050

0,075

0 400

4

abso

rban

cia

λ

or otra parte, el cromatograma de la solución expuesta a fotólisis durante

una se

zida fotolizada durante una semana. Inserto: espectros UV de cada señal.

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18

Figura 29. Degradación fotolítica de benserazida por VPD (A) y espectrofotometría (B)

P

mana, exhibe una señal de benserazida con un área disminuida en un 66%

y otras tres señales nuevas (1, 2 y 4), correspondientes a los productos de

degradación fotolítica de benserazida (Figura 30). En este caso, al igual que en el

anterior podemos concluir que los productos de degradación generados son

electroactivos y sufren oxidación en la misma región de potencial que

benserazida.

Figura 30. Cromatograma de la solución de bensera

0 2 4 6 8 10 12 14

42

3

Abso

rban

cia

o horas 1 semana

1

t / min

48

Magdalena Pérez O.

Por último, del estudio de recuperación realizado a dos niveles de

concentración (2.0×10-4 M y 4.5×10-5 M ), en muestras simuladas que contenían

0.6 y 0.13 mg del fármaco puro más levodopa y excipientes en proporción similar

a la de fabricación, se obtuvo que la metodología analítica desarrollada por VPD

permite la determinación de benserazida en presencia de levodopa y excipientes,

sin interferencia y de manera satisfactoria (Figura 31), con porcentajes de

recuperación mayores al 98% en ambos casos. Los resultados del estudio de

recuperación se presentan de manera detallada en la Tabla 3.

Tabla 3. Estudio de recuperación de benserazida en muestras sintéticas

Muestra Benserazida (2.0×10-4 M)

% Recuperación Benserazida (4.5×10-5M)

% Recuperación

1 104.4 101.5

2 98.7 99.3

3 98.0 97.6

4 97.8 97.1

5 101.0 101.1

6 99.0 99.0

7 94.4 99.3

8 95.2 99.7

9 98.4 101.8

10 97.7 100.0

Promedio 98.5 99.6

d.e. 2.8 1.5

CV, % 2.8 1.6

49


-200 0 200 400 600 800 1000 12000

5

35

10

15

20

25

30

I / µ

A

E / mV

Forma Farmacéutica simulada Estandar Benserazida

6

8

12

-200 0 200 400 600 800 1000 12000

2

4

10

Forma Farmacéutica simulada Estándar Benserazida

I / µ

A

E / mV

Figura 31. Voltamperogramas correspondiente al estudio de recuperación realizado a nivel alto (benserazida 2.0×10-4 M) y bajo (benserazida 4.5×10-5M) de la curva de calibración. 3.3 Aplicaciones de la metodología analítica

3.3.1 Cuantificación de benserazida en forma farmacéutica

Para la aplicación de la metodología electroanalítica desarrollada, se

procedió a realizar la valoración y posterior determinación de la uniformidad de

contenido de una forma farmacéutica presente en el mercado nacional que

ontiene benserazida. La formulación correspondió a comprimidos de libración

onvencional de la marca Prolopa® (Laboratorio Roche).

Tanto la valoración como la determinación de la uniformidad de contenido

e llevo a cabo empleando la metodología propuesta por voltamperometría de

uso diferencial bajo condiciones óptimas. Como método comparativo se utilizó el

escrito en la Farmacopea Británica 2003.

Los resultados obtenidos para la valoración y uniformidad de contenido

or ambas técnicas se muestran de manera detallada en las Tablas 4 y 5.

c

c

s

p

d

p

50

Magdalena Pérez O.

Tabla 4. Valoración de benserazida en comprimidos de benserazida y levodopa1

Benserazida (mg) D.E. (mg) CV (%)

VPD 50.8 0.8 0.79

HPLC 49.0 0.3 0.35 1Prolopa® Comprimidos (200 mg levodopa, 50 mg benserazida)

Tabla 5. Uniformidad de contenido de benserazida por la metodología propuesta y HPLC

VPD HPLC

Comprimido % encontrado % encontrado

1 98.0 94.5

2 103.4 95.4

3 95.2 91.9

92.8

5 103.9 101.0

6 102.0 104.1

4 99.7

7 109.2 99.9

8 97.6 94.1

9 105.7 97.2

10 108.2 93.8

Promedio 102.3 96.5

D.E. 4.7 4.0

CV (%) 4.6 4.1

51


52

3.3.2 Estudio de estabilidad hidrolítica de benserazida

La aplicación del método voltamperométrico desarrollado al estudio de

estabilidad de benserazida, se realizó a una concentración de 2.5×10-4 M, a

cuatro valores de pH (2, 6, 7 y 9) en tampón Britton-Robinson 0.1 M y a una

temperatura de 40ºC, con el fin de conocer la influencia del pH del medio en la

velocidad de degradación de este fármaco.

En la figura 32 se presentan los voltamperogramas de benserazida a pH 7,

n,

in la aparición de nuevas señales anódicas.

Figura 32. Voltamperogramas correspondiente al estudio de degradación de benserazida a pH 7.

De los resultados de los ensayos de degradación se puede observar que la

degradación de benserazida se ve influenciada por el pH del medio,

incrementando su inestabilidad a medida que el pH aumenta; incluso a pH

superiores a 9, la degradación del fármaco es prácticamente instantánea,

quedando un remanente inferior al 20% de la concentración inicial a las dos

horas.

observándose que la señal de oxidación decae en transcurso de la degradació

s

-200 0 200 400 600 800 1000 12000

2

4

6

8

10

12

I / µ

A

E / mV

0 min 60 min 120 min 180 min 240 min 300 min

Magdalena Pérez O.

53

-8,0

0 50 100 150 200 250 300 350

-10,0

-9,5

-9,0

-8,5

pH 2 pH 6 pH 7 pH 9

log

C

t / min

Figura 33. Efecto del pH sobre la degradación de benserazida a 40º C por VPD

Con fines comparativos se llevó a cabo el ensayo de degradación por

HPLC. En la Figura 34 se presentan los cromatogramas de benserazida a pH 7,

observándose que la señal que aparece a los 8 minutos decae con el transcurso

de la degradación, sin la aparición de nuevos picos cromatográficos, por lo que es

probable que los productos de degradación generados sean m

Por otra parte, los valores de concentración remanente obtenidos se

ajustan a una cinética de seudo orden uno, con constantes de degradación de

2.6×10-4, 2.2×10-3, 3.8×10-3 y 1.3×10-2 min-1 para pH 2, 6, 7 y 9

respectivamente (Figura 33).

ucho más polares

ue su precursor y aparezcan a tiempos cercanos a cero, bajo la señal de blanco.

q


0 50 100 150 200 250 300-11,5

-10,5

-9,5

-9,0

-8,0

-11,0

-10,0

-8,5

pH 2 pH 6 pH 7 pH 9

C

10 1200

0.02

0.04

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

0.18

ln

t / min

0 2 4 6 80.

0.06A, 2

m

t / min

20 n

0 horas 1 hora 2 horas 5 horas Blanco

Figura 34. Cromatogramas correspondiente al estudio de degradación de benserazida a pH 7.

Respecto al orden cinético de degradación, este fue concordante con lo

obtenido por VPD, es decir seudo orden uno, sin embargo las constantes de

degradación obtenidas por HPLC fueron superiores a las obtenidas por VPD, en

los 4 pH ensayados (Figura 35). Para una mejor visualización, en la Tabla 6 se

presentan los resultados obtenidos por ambas técnicas.

Figura 35. Efecto del pH sobre la degradación de benserazida a 40º C por HPLC

54

Magdalena Pérez O.

Tabla 6. Valores de constantes de degradación a distintos pH por VPD y HPLC.

Constante de degradación (k, min-1) pH

VPD HPLC

2 2.6×10 2.9×10 -4 -3

6 2.2×10 5.5×10

7 3.8×10 7.6×10

9 1.3×10 1.2×10-2

-3 -3

-3 -3

-2

Adicionalmente, a partir de los resultados del estudio de la influencia de

pH sobre la velocidad de degradación de benserazida por VPD y HPLC, se pudo

calcular la vida media del fármaco a partir de la ecuación 4 (ver metodología)

(Tabla 7).

Tabla 7. Valores de vidas medias a distintos pH por VPD y HPLC

Vida media (t1/2,h) horas pH

VPD HPLC

2 44.4 4.0

6 5.2 2.1

7 3.0 1.5

9 0.9 1

Como se puede observar en las Tablas 6 y 7, tanto los valores de las

constantes de degradación como los valores obtenidos para la vida media del

fármaco por VPD, difieren notablemente de lo encontrado por HPLC, siendo

mucho mayor esta diferencia a pH ácido (2.0) y haciéndose cada vez menores a

medida que aumenta la alcalinidad, encontrándose que a pH 9.0, los valores

obtenidos por ambas técnicas son prácticamente los mismos, esto debido a la

degradación instantánea que sufre benserazida bajo estas condiciones.

55

Magdalena Pérez O.

CON

r la técnica de voltamperometría de pulso d cial (VPD), ben a en

pón Britton-Robinso , pH 6, presen n respuesta anó on un

y de menor intensidad,

en un amplio intervalo de pH (2.0 - 10.0) sobre el electrodo de carbón vítreo.

• Las cuatro señales fueron dependientes de pH, existiendo una relación entre

la aparición-desaparición de la segunda y tercera señal con uno de los valores

de pKa .

• Benserazida senta dos máxim bsorción en el rango ultravioleta (230

y 272 nm), s que sufren c s apreciables con el pH del medio,

permitiendo ular dos de los p fármaco (pKa1 = Ka2 = 10.90).

• Los resultados de voltamperometría cíclica (VC) reve ue, en medio

acuoso, el proceso de oxidación de benserazida es le y está

gobernado principalmente por la ón de la especie electroactiva a la

superficie del electrodo a las velocidades de tudiadas

(0.1 - 5.0 V/s), aún cuando por voltamperometría lineal se aprecia, a

velocidades bajas, un comportamiento adsortivo.

• Los ensayo electrólisis a p ial controlado no permitieron calcular

satisfacto el número de ctrones transferidos en el proceso de

oxidación de benserazida, en las condiciones ensayadas.

• La metodología electroanalítica desarrollada por VPD, utilizando como

condiciones óptimas tampón Britton-Robinson 0.1 M, pH 6, resultó ser

reproducible, con coeficientes de variación menores al 2%, y selectiva frente

a los excipientes contenidos en la formulaciones comerciales que contienen

benserazida, con porcentajes de recuperación mayores a 98%, así como para

CLUSIONES • Po iferen serazid

tam n 0.1 M tó u dica c

pico principal de oxidación y tres ondas poco resultas

de la molécula

pre os de a

lo ambio

calc Ka del 5.44 p

laron q

irreversib

difusi

barrido es

s de otenc

riamente ele

56

Magdalena Pérez O.

sus productos de hidrólisis básica. Presentando límites de detección y de

cuantificación de 7.12×10-6 y 9.49×10-6 M, respectivamente.

to en la Farmacopea Británica (49.0

mg, CV = 0.30 %). Mientras que el estudio de uniformidad de contenido

res

• Del estudio de estabilidad realizado para benserazida, se obtuvo una

degradación hidrolítica de pseudo orden uno. La velocidad de degradación fue

pH dependiente, lo que se manifestó tanto en los valores de las constantes

cinéticas, como en las vidas medias encontradas.

• La valoración de los comprimidos de benserazida en asociación con levodopa,

Prolopa® que declaran contener 50 y 200 mg de los respectivos fármacos, dio

como resultado 50.8 mg (CV = 0.79%), lo que estuvo bastante cercano a lo

encontrado por el método oficial descri

ultó en 102.3 mg/comp (CV = 4.56%), como promedio de un estudio

individual de 10 comprimidos.

57

Magdalena Pérez O.

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