AOAC Método Oficial 979.24Vitamina D en preparaciones de Vitaminas

Método de Cromatógrafo Líquido

(Aplicable para aceites que contienen ≥ 100 000 IU colecalciferol/g o vitamina D3/g; resinas ≥ 20 000 000 IU colecalciferol/g ; y polvos y preparaciones acuosas ≥ 25 000 IU colecalciferol/g ).

A. Principio

Concentrados secos y dispersiones acuosas son saponificados y extraídos. Vitamina D en soluciones de resina y aceites son disueltas en solventes. Vitamina D y previtamina D son separadas de impurezas por cromatografía líquida.

Concentraciones de Previtamina D se calcula como la vitamina D usando un factor de calibración. Vitamina D es la suma de vitamina D y previtamina D.

B. Apparatus

(a) Cromatografía Líquida.- Hewlett Packard 1010 A, o equivalente a detector UV con 254 nm. Condiciones de operación típica: velocidad del gráfico, 1cm/min; tasa de flujo de eluyente, 2ml/min (aprox. 100 atmóferas); sensibilidad del detector, 0.128 AUFS; temperatura, ambiente; válvula de inyección de volumen, 20 µl.

(b) Columna de cromatografía.- Acero inoxidable, 150 x 4.6 (diámetro interior) mm, empacado con partículas de 5µm de Lichrosorb Si 60, pasando la prueba de desempeño del sistema. Antes de introducir esta columna, la fase móvil debe estar bombeada a través de 100 cm x 4 mm de columna de acero inoxidable con un contenido de 50-250 µm de sílice, secada por 4 hrs a 250ºC. Diferentes longitudes de columnas o marcas de embalaje puede ser sustituido, y el volumen de inyección puede variar entre 10-30 µl, si cumple siempre la prueba de desempeño del sistema.

C. Reagents

(a) n-hexano.- Calidad de espectro. Secarlo pasando a través de la columna de 60 x 8 cm de diámetro que contiene 500g de sílice de 50-250 µm secado por 4 hrs a 150ºC.

(b) Alcohol n-amílico.- Grado reactivo.

(C) Fase móvil.- n-hexano y alcohol n-amílico (993 + 3). Ajustar la proporción de los componentes, si es necesario realizar un ensayo sustituible.

(d) Tolueno.- Grado reactivo o nanogrado.

(e) Solución estándar de Vitamina D.- Pesar con precisión aproximadamente 80 mg de solución estándar de Colecalciferol USP en matraz volumétrico de ambar de 25 ml. Disolver sin calor en tolueno, y diluir hasta formar volumen con tolueno. Preparar fresco a diario.

(f) Solución estándar sustituible.- Preparar una solución que contenga 2 mg de Vitamina D3 y 0,2 mg trans-vitamina D3 de aceite vegetal, disolver 0,25 g de la solución en 10 ml de tolueno y fase móvil (1 + 1). Picos de trans-vitamina D3 y previtamina D3 deberían tener aproximadamente la misma altura. Si es necesario, el contenido de previtamina D3 puede elevarse mediamente calentamiento de la solución de aceite a 90ºC por aprox. 45 min. Almacenar el aceite a 5ºC.

(g) Solución de Ascorbato de Sodio.- Disolver 3.5 g de ácido ascórbico en 20 ml NAOH (1N). Preparar fresco a diario.

(h) Solución de Sulfuro de Sodio.- Disolver 12 g Na2S·9H2O en 20 ml de H2O y diluir a 100 ml con Glicerina al 87%.

(i) Solución de Hidróxido de Potasio.- (1) (50% peso/volumen) Disolver 50 g de KOH en 50 ml de H2O y enfriar. Preparar fresco. (2) (3% en alcohol) Disolver 3 g de KOH en H2O, adicionar 10 ml de alcohol, y diluir a 100 ml con H2O. Preparar fresco.

(j) Éter.- Acido y peróxido libre.

D. Prueba de desempeño del sistema

Cromatografiar porciones de 20 µl de solución estándar sustituible 6 veces. Determinar la constante del pico de altura mediante el cálculo de desviación estándar y luego la desviación estándar relativa = Desviación estándar x 100/ media de los picos de altura. La desviación estándar relativa debería ser ≤1%. Determinar la resolución del pico (R) entre previtamina D3 y transvitamina D3:

R=2D / (B + C)

Donde: D = distancia entre máximos picos de previtamina D3 y transvitamina D3; B = ancho del pico de previtamina D3 ; y C = ancho del pico de transvitamina D3. La resolución del pico debería ser ≥ 1.0 para previtamina D3 / transvitamina D3

E. Determinación del factor de calibración

Pipetear 4 ml de solución patrón de Vitamina D, (e), en un matraz volumétrico de 25 ml. Adicionar 1 ml de touleno y diluir hasta volumen con una fase móvil. Almacenar en baño de hielo. Inyectar 20 µL en la columna a

través de una válvula de muestreo y ajustar condiciones operativas del detector hasta obtener el máximo de altura de los picos de escala. Repetir la inyección y promediar las alturas de los picos obtenidos (=K).

Pipetear 5 ml de solución patrón de Vitamina D, (e), en un matraz volumétrico de 25 ml, adicionar un poco de cristales de hidroxitolueno butilado, desplazar el aire con gas N2, y unir el condensador de reflujo. Calentar en baño de agua a 90ºC con gas N2 constante en un lugar oscuro y fresco. Diluir el volumen con una fase móvil. Inyectar 20 µL en la columna en las mismas condiciones que arriba. Determinar la altura del pico de la Vitamina D calentada (L) y de la previtamina D formada (M). Calcular el factor de calibración como sigue:

CF= [(5K/4) – L]/M

F. Preparación de la muestra

a. Resinas.- Romper a golpes la muestra fuera del envase que la contiene. En un matraz de 100 ml pesar con precisión 0,8 g aprox. (aprox. que contiene 20 000 000 IU de Vitamina D) de los pedazos más grandes de la parte inferior del recipiente. (Precaución: La muestra de resina no debe ser nunca molida). Disolver en tolueno y diluirlo hasta volumen. Pipetear 5 ml en un matraz volumétrico de 100 ml, adicionar 15 ml de tolueno y diluir hasta volumen con una fase móvil. (Concentración = 10 000 IU o 0,25 mg de vitamina D/ml).

b. Vitamina D en aceites.- Pesar con precisión una cantidad de aceite que contenga aprox. 500 000 IU en un matraz volumétrico de 50 ml. Disolver en 10,0 ml de tolueno y diluís hasta volumen con una fase móvil.

c. Preparaciones secas y acuosas.- Pesar con precisión en una matraz de saponificación una cantidad de muestra que contenga aprox. 100 000 IU de colecalciferol. Adicionar en pequeñas porciones, con agitación suave 25 ml de alcohol, 5 ml solución de ascorbato de sodio, (g), y 3 ml de solución KOH, (i). Colocar en baño de H2O hirviendo por 30 min y enfriar rápidamente en H2O fría que circula. Transferir la solución al separador con ayuda de dos porciones de 15 ml de H2O, 10 ml de alcohol, y dos porciones de 50 ml de éter.

Agitar vigorosamente 30 segundos y luego dejar reposar hasta que se aclare. Transferir la fase acuosa inferior al segundo separador y agitar con 10 ml de alcohol y 50 ml de n-pentano. Dejar que se separe, y transferir la capa acuosa inferior a la tercera fase de separador y pentano de la parte superior al primer separador, lavando el segundo separador con dos porciones de 10 ml de pentano y adicionar ese lavado al primer separador. Batir la fase acuosa en el tercer separador con 50 ml de pentano y descartar la fase acuosa, y adicionar el pentano al primer separador. Lavar los extractos de

pentano extraídos con tres porciones de solución de KOH al 3% (i), agitar vigorosamente y luego lavar con sucesivas porciones de 50 ml de H2O hasta que la ultima lavada sea neutral a la fenolftaleína. Drenar las últimas gotas de H2O, adicionar dos papeles filtro de 9cm en tiras en el embudo y agitar. Transferir el extracto de pentano lavado a un matraz de fondo redondo, enjuagando el separador y el papel con pentano.

Evaporar la solución al vacío hasta que seque con agitación en baño de H2O a ≤ 40ºC. Enfriar en agua fría que circula y restaurar la presión atmosférica con N2. Disolver inmediatamente el residuo en 2 ml de tolueno, transferir a un matraz volumétrico de 10 ml, enjuagando con una porción de 1 ml de fase móvil, y diluir hasta formar volumen con la fase móvil.

G. Determinación

Inyectar 20 µL la solución patrón de Vitamina D y una solución de muestra preparada en la columna a través de la válvula de muestreo con detector ajustada como detalla del apartado E. Medir las altura de picos de Vitamina D y previtamina D. Repetir la inyección y la reinyección de solución estándar después de cada 4 inyecciones de muestra para verificar que la respuesta se mantiene constante.

H. Cálculos

El promedio de los picos más altos obtenidos de replicas de patrones y muestras por duplicado.

Vitamina D IU/g = {[PD+(PP x CF)]/PR} (W’/W)(V’/V) x 40,000

Donde: PD, PP y PR son los picos más altos de vitamina D en la muestra, previtamina D en la muestra, y vitamina D en el patrón, respectivamente; CF = factor de calibración previtamina D/vitamina D; W’ = peso del patrón en mg; W = peso de la muestra en g; V = total solución de la muestra en ml; V’ = total solución patrón en ml (=25x50/4); y 40,000 = Vitamina D IU/mg material de referencia USP.