1

Cortesía de la Bióloga L. C.

El antibiograma FUNDAMENTOS: Se entiende por antibiograma el estudio de la sensibilidad "in vitro" de las bacterias a los antibióticos. Por extensión, se suele incluir el estudio de la sensibilidad a las sulfamidas y otros quimioterápicos. La razón por la cual es conveniente el estudio del antibiograma de una bacteria determinada radica en el hecho de la diferente sensibilidad a los antibióticos de las distintas especies bacterianas y, más aún, en el hecho de que en numerosas especies existen grandes diferencias de sensibilidad a un determinado antibiótico entre unas y otras cepas. El antibiograma es un método de diagnóstico rápido y preciso Con ayuda del antibiograma se puede escoger el antibiótico más adecuado para el tratamiento de una enfermedad. MATERIAL:

Agar de Mueller-Hinton (Composición en gramos por litro de agua destilada: infusión de

carne, 300 g; peptona ácida de caseína, 170.5 g; almidón, 1.5 g; agar, 15 g; pH=7.3±0.2).

Antibiótico (Penicilina o cualquier otro que pueden traer los alumnos).

Hisopo o bastoncillo de algodón.

Tijeras

Papel de filtro

Placas de Petri

Tubos de ensayo.

MONTAJE: El antibiograma que se va a realizar, sigue la técnica basada en las experiencias de Kirby-Bauer (Bauer et al., 1960). Según estos autores, el microorganismo deberá inocularse en la superficie de una placa de agar, sobre la cual se colocarán discos impregnados con una concentración conocida de antibiótico. Las placas se incubarán durante 15 horas a 35 ºC. Durante la incubación, el antibiótico difundirá radialmente desde el disco a través del agar de cultivo, por lo que su concentración irá disminuyendo a medida que se aleja del disco. Primeramente se siembra en superficie de los microorganismos aislados previamente de las manos de los alumnos. Es preferible, aislar microorganismos Grampositivos, seleccionándose las colonias de coloración amarilla (Micrococcus luteus) o blanca (Bacillus sp). Tras el cultivo de los microorganismos, la práctica comienza en el laboratorio con la preparación del antibiótico y la posterior dilución. Se harán diluciones serán de 10-3, 10-4 y 10-5 del stock de antibiótico. A continuación, y mediante el uso de un hisopo o bastoncillo de algodón, se tomará una colonia microbiana y se dispersará sobre la superficie de una placa de cultivo.

2

Los alumnos, con ayuda de unas tijeras limpias, cortarán una superficie de papel de filtro de 0.5 cm × 0.5 cm, aproximadamente, cogiendo los trozos resultantes con la ayuda de unas pinzas y se dispondrán sobre la placa de cultivo, en la que previamente se había inoculado la bacteria, organizando una hipotética estructura triangular, disponiéndolos en los vértices.

A continuación se dispondrá una gota de la solución de antibiótico 10-5 en uno de los discos.

Del mismo modo, se dispensará una gota de la dilución 10-4 y 10-3 en los dos discos restantes.

La incubación se llevará a cabo a temperatura ambiente durante 48 horas, transcurrido el período de incubación se pondrá de manifiesto la presencia de halos de inhibición del crecimiento microbiano. EXPLICACIÓN: En líneas generales y en función sobre su forma de actuar sobre los microorganismos, hablamos de dos grandes grupos de antibióticos Antibióticos primariamente

3

bactericidas: Ejercen una acción letal e irreversible sobre el microbio (Fosfomicina Vancomicina. B-Lactámicos Polimixina. Aminoglucósidos Rifampicina. Acido Nalidíxico Quinoleinas. Nitrofurantoinas) Antibióticos primariamente bacteriostáticos: Inhiben el crecimiento pero no matan al microorganismo, permitiendo que las propias defensas del huésped pueden eliminar a las bacterias (Tetraciclina Cloranfenicol. Sulfonamidas Trimetroprim. Lincomicina Clindamicina. Macrólidos). Las formas de actuar de los antibióticos son muy diversas:

Inhiben la síntesis de la pared celular bacteriana.

Inhiben la síntesis de proteínas.

Inhiben la síntesis de Ac. Nucleicos.

Alteran las funciones de la membrana plasmática.

TRUCOS: Los alumnos deben tener en cuenta no tocar con las manos tanto la placa de agar como el papel de filtro para evitar contaminación del experimento. Al añadir la dilución del antibiótico en alumno debe tener cuidado de añadir la gota de dilución en el papel de agar. ESTIMACIONES: Se podría calcular La Concentración Inhibitoria Mínima (C.I.M) que se define como la menor concentración de una gama de diluciones de antibiótico que provoca una inhibición de cualquier crecimiento bacteriano visible. Es decir, es la concentración mínima requerida del antimicrobiano para causar inhibición del crecimiento bacteriano. Así como comparar mediante medición de los halos de inhibición la resistencia de las distintas cepas a una misma concentración de antibiótico. Calcular las distintas cantidades de antibiótico en cada dilución. APLICACIONES: Los datos que proporciona el antibiograma son muy valiosos pero su aplicación no es tan sencilla. Para la prescripción correcta de los antibióticos hay que tener en cuenta siempre la naturaleza del proceso infeccioso, la historia clínica del paciente, el mecanismo de acción del antibiótico, la toxicidad, las posibles sensibilización es del paciente, la vía de administración, etc. La resistencia de las bacterias es el principal obstáculo para la eficacia terapéutica de los antibióticos, pues no sólo puede anular la acción curativa si se manifiesta en el curso del tratamiento, sino que tiene a la larga consecuencias todavía más graves para el conjunto de la población, ya que provoca la desaparición de las cepas susceptibles y la propagación de las resistentes. Ese es el motivo por el cual la determinación de la sensibilidad de las bacterias a los antibióticos haya adquirido tanta importancia y sea indispensable para hacer de los antibióticos un uso racional y para preservar la eficacia de este grupo tan valioso de agentes terapéuticos. SUGERENCIAS: En 1928 Alexander Fleming descubrió la penicilina y sugirió quepodría usarse para tratar determinadas infecciones bacterianas. Sin embargo, este uso no se consideró seriamente hasta 1940, cuando Howard Florey y Ernst Chain (un científico

4

huido de la Alemania nazi) consiguieron producir y presentar la penicilina en una forma utilizable. Una serie de empresas del Reino Unido reconocieron su utilidad para el tratamiento de heridas de guerra y comenzaron a fabricarla a partir de cultivos de Penicillium desarrollados en baterías de botellas de vidrio. Las cantidades producidas eran insuficientes, por lo que Florey se desplazó a Estados Unidos para convencer a las compañías farmacéuticas de que fabricaran penicilina. La empresa química estadounidense Pfizer, de Brooklyn, fabricaba ácido cítrico mediante la fermentación de melazas. Después de muchas investigaciones adaptó dicho proceso para producir penicilina. Después de la guerra, los tres científicos recibieron el Premio Nobel por sus trabajos, y la penicilina pasó a estar disponible en todo el mundo. Pronto se descubrieron otras sustancias activas contra infecciones muy diversas, que se denominaron colectivamente antibióticos. Uno de los más conocidos fue la estreptomicina, descubierta por Selman A. Waksman y desarrollada en los laboratorios de la empresa farmacéutica estadounidense Merck & Co., de Nueva Jersey. Junto con los productos antibacterianos isoniacida y ácido p-aminosalicílico, la estreptomicina curaba la tuberculosis, causada por el bacilo de Koch. El mencionado tratamiento y el uso de la vacuna BCG —cuyo nombre eran las iniciales de los científicos franceses que la inventaron durante la guerra, los bacteriólogos Albert Calmette y Camille Guérin ha eliminado prácticamente la tuberculosis en Occidente. En 1936 el patólogo alemán Gerhard Domagk, de los laboratorios Bayer, comprobó que la sulfonamidocrisoidina, un tinte comercializado bajo la marca Prontosil, era eficaz contra la infección por estreptococos. Estos microorganismos eran los causantes de la sepsis puerperal, una enfermedad que a veces seguía al parto y provocaba frecuentemente la muerte de la madre. Se demostró que la parte activa de la molécula del Prontosil era el radical sulfonamida, lo que estimuló a los investigadores farmacéuticos a sintetizar una serie de fármacos nuevos conocidos como sulfonamidas o sulfamidas. La acción eficaz de la isoniacida se descubrió simultáneamente en los laboratorios de Squibb, en Estados Unidos y de Hoffmann-La Roche, en Suiza. Desgraciadamente para ambas empresas, la sustancia ya se había sintetizado en 1911 como 'curiosidad química', por lo que no pudieron obtener ninguna patente para cubrir el coste de la investigación y desarrollo del producto. A partir de 1970 se establecieron en muchos países organismos gubernamentales para controlar la calidad, los ensayos clínicos y el empaquetado, etiquetado y distribución de los fármacos. Conceden autorizaciones tanto para los fármacos como para sus fabricantes y sus inspectores tienen derecho a visitar en cualquier momento las instalaciones donde se fabrican y almacenan productos farmacéuticos. Otros organismos son responsables de controlar la fabricación y distribución de medicinas y productos de crecimiento para animales. La distribución de los numerosísimos fármacos disponibles a las miles de farmacias y clínicas existentes sería casi imposible sin los servicios de distribuidores mayoristas estratégicamente situados que realizan suministros diarios. Las farmacias locales, el último eslabón en la cadena del suministro de fármacos a los ciudadanos, son inspeccionadas por agentes responsables de los diferentes ministerios o departamentos de Sanidad. PREGUNTAS: Tipos de antibióticos, tanto por su función como su clasificación por su naturaleza química. Importancia de los antibióticos en la salud. Incl uir

5

REFERENCIAS: Revista Eureka sobre Enseñanza y Divulgación de las Ciencias. http://reuredc.uca.es/index.php/tavira Revista Eureka sobre Enseñanza y Divulgación de las Ciencias 8 (3), 353-357, 2011 CIENCIA RECREATIVA El antibiograma. Un recurso en el laboratorio de Educación Secundaria José Pedro López Pérez; Raquel Boronat Gil http://rodin.uca.es:8081/xmlui/bitstream/handle/10498/14399/11_Lopez_Boronat _2011.pdf?sequence=7 Antibiotic Susceptibility Testing by a Standardized Single Disk Method http://books.google.es/books?hl=es&lr=&id=fXlMtT_t7TsC&oi=fnd&pg=PA40&dq=+Kirby-Bauer+method&ots=vx75vvc4d7&sig=2xymhj2-Yqd9xGT58IwOGlS3eY#v=onepage&q=Kirby-Bauer%20method&f=false