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ANTECEDENTES
Síndrome Reproductivo y Respiratorio Porcino (PRRSV )
Generalidades
En 1987, se reconoció al síndrome reproductivo y respiratorio porcino
(PRRS) como un nuevo padecimiento que provoca aborto o neumonía
severa en cerdos neonatos, el cual es causado por un virus de ARN,
referido como virus PRRS (PRRSV) (Rossow, 1998).
Este virus se transmite por contacto directo entre cerdos infectados y
no-infectados y la infección persistente puede ser intranasal o
transplacentaria. Una vez en la mucosa, el PRRSV inicia su replicación en
macrófagos regionales (único tipo de célula que sobrelleva tal replicación) y
promueve una viremia prolongada por su diseminación a otras poblaciones
de macrófagos. Tal persistencia es importante para la continuidad de la
replicación viral. El PRRSV induce el aborto en los últimos periodos de
gestación y se caracteriza por fetos parcialmente autolizados y/o
momificados. La neumonía que causa es más severa en cerdos jóvenes y
puede complicarse con infecciones bacterianas concurrentes. Las lesiones
pulmonares varían desde nulas hasta una consolidación difusa con un
engrosamiento intersticial multifocal de macrófagos y detritos celulares
necróticos en los alvéolos. Por esto, el suero y los pulmones son los
mejores especimenes para el diagnóstico (Delputte et al., 2002; Rossow,
1998).
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Agente Causal
Los Virus del Síndrome Reproductivo y Respiratorio Porcino
(PRRSV), de la elevación de la lactato deshidrogenasa (LDV), de la arteritis
equina (EAV) y de la fiebre hemorrágica del simio (SHFV) conforman un
grupo de virus envueltos de ARN de una sola cadena, clasificados en el
orden Nidovirales, familia Arteriviridae, género Arterivirus. Son esféricos de
envoltura lipídica, un ARN en sentido positivo de 13-15kb y de estructura y
organización funcional similares (Fig. 1A). Su genoma es de
aproximadamente 15 kb y contiene 7 ORFs. El ORF 1a y 1b son el 80% del
genoma y codifican para la RNA-polimerasa. Los otros 6 ORFs codifican
para las proteínas estructurales del virión, como los ORFs 2-5 que están
asociados con la envoltura y el ORF-7 con la nucleocápside.. La envoltura y
proteínas de membrana representan estructuras de superficie importantes
para las interacciones virus-hospedero (Nielsen et al., 2002; Meulenberg,
2000).
Los virus ARN en general, presentan numerosas mutaciones por la
replicación imprecisa del genoma ARN, originando una población de
secuencias relacionadas no-idénticas. Los virus PRRS son reconocidos por
su alta variabilidad genética y antigénica. Tal variabilidad promueve la
infección persistente en el hospedero, limita la inmunidad protectora y la
viabilidad de los ensayos para diagnosticar nuevas variantes y condiciona la
posible emergencia de nuevas cepas virulentas. Para resolver el problema
propiamente del PRRS en el campo, se requiere de la comprensión de la
cinética del virus y de la respuesta inmune en su contra (Batista et al., 2004;
Chang et al., 2002; Rossow, 1998; Wills et al., 2003).
Los estudios demuestran el tropismo del PRRSV hacia los
macrófagos porcinos inmaduros o recién activados, afectando su
maduración e impidiendo una adecuada respuesta inmune (Fig. 1B). Se han
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A)
B)
Macrófago normal no-infectado Macrófago normal infectado con PRRSV
Figura 1 | Representación esquemática del virus del PRRS y su
efecto. 1A | El ORF 1 codifica para la ARN polimerasa, los ORFs 2-6 para
la glicoproteína-2 (GP2)-GP5 y la proteína M y el ORF 7 para la
nucleocápside. (N) Nucleocápside, (M) Matriz y (E) Envoltura. 1B | Macrófago
alveolar normal e infectado con PRRSV (Chang et al., 2002; Labarque,
2003).
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visto diferencias respecto a la magnitud del daño por las distintas cepas
generadas por su alta variabilidad genética. No se han caracterizado los
receptores que permiten la entrada del virus a las células blanco, aunque se
han identificado a los glicosaminoglicanos de heparán sulfato como posibles
receptores para la adhesión del PRRSV a las células MARC-145 y a
macrófagos alveolares (Benfield et al., 1992; Samsom et al., 2000; Sur et
al., 1997; Vanderheijden et al., 2003).
Células Dendríticas
Dependiendo de su estadio de maduración, las células dendríticas
regulan la respuesta inmune dirigiendo la diferenciación y polarización de
los linfocitos T y B, para con ello programar una respuesta humoral o celular
(Randolph, et al., 2005).
Poblaciones
Se considera que existen dos vías de diferenciación hacia células
dendríticas, las cuales se desarrollan de progenitores de médula ósea (Fig.
2). La vía mieloide genera dos sub-poblaciones precursoras: las células de
Langerhans (encontradas en el epitelio como la piel) y las células
dendríticas intersticiales (todos los tejidos). La vía linfoide por otro lado,
genera células dendríticas plasmocitoides. Estos precursores migran a
diferentes tejidos donde se diferencian a células dendríticas inmaduras. Su
plasticidad funcional se adquiere en el proceso de estimulación, lo que les
permite generar respuestas rápidas y eficientes, independientemente del
reto afrontado (Banchereau & Palucka, 2005; Pulendran, 2004; Degli &
Smyth, 2005).
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Figura 2 | Poblaciones de células dendríticas human as.
Dependiendo de su ubicación anatómica las células dendríticas reciben
distintos nombres. La población de células dendríticas en sangre periférica
(SP) contiene tanto mieloides CD11c+ como plasmocitoides CD11c–
(Banchereau & Palucka, 2005).
Precursor Mieloide
Precursor Linfoide
Monocito
DC Mieloide CD11c+
DC Plasmocitoide CD11c-
IL-4
Célula de Langerhans
DC Intersticial DC Plasmocitoide
CTP CD34+
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Generación In Vitro de las Células Dendríticas
En los últimos años, las células dendríticas han sido objeto de
diferentes estudios, tanto en humanos como en cerdos. Uno de los modelos
de estudio de células dendríticas es a partir de monocitos porcinos. Los
monocitos de sangre periférica son cultivados de tres a seis días en
presencia de IL-4 y factor de crecimiento de colonias de granulocitos y
monocitos (GM-CSF), y la maduración es inducida utilizando IFNα, TNFα o
LPS. El marcador porcino clásico es el SWC3 (Swine Workshop Cluster), el
cual es un marcador de linaje mielo-monocítico homólogo a la proteína
reguladora de señal (SIRPa, CD172a) en otras especies (Merad et al.,
2002; Mccullough et al., 1999; Paillot et al., 2001; Summerfield et al., 2003).
Inmunología de las Células Dendríticas
Modulación de la Respuesta Inmune
Las células dendríticas expresan PRRs cuyas señales promueven las
respuestas efectoras específicas (Pulendran, 2004).
Las células dendríticas inmaduras se localizan en órganos periféricos
y en mucosas donde identifican directamente los patógenos, utilizando para
ello Receptores de Reconocimiento de Patógenos (PRRs). A su vez, estos
receptores reconocen Patrones Moleculares Asociados al Patógeno
(PAMPs), únicos en los microorganismos e invariables entre clases de
patógenos (Fig. 3) (Akira, 2003; Banchereau & Palucka, 2005; Huang et al.,
2001; Pulendran, 2004; Scott et al., 2005).
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Figura 3 | Maduración evolutivo-funcional de las cé lulas
dendríticas. La maduración puede dividirse en fases, todas con una
función celular discreta. Esta transición la median diversas señales y se
acompaña de cambios en la expresión de marcadores de superficie y
factores secretados (Pardoll, 2002; Stockwin, et al., 2000).
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Dentro de los PRRs se encuentran los receptores de lectinas tipo C,
de manosa y receptores tipo Toll (TLRs), siendo estos últimos los más
importantes. Las células dendríticas inmaduras son altamente eficientes en
el reconocimiento de antígenos por su alta expresión de TLRs, etapa en la
que además expresan un bajo nivel de moléculas de co-estimulación y de
MHC. En mamíferos se han caracterizado diez TLRs, donde el TLR4
reconoce el lipopolisacárido y el TLR2 el peptidoglicano de las bacterias
gram-positivas. Entre los TLRs que reconocen virus están los TLRs 3 y 9
(virus de doble cadena) y los TLRs 7 y 8 (virus de cadena sencilla). La
unión de su ligando al TLR activa la expresión de una variedad de genes,
considerándose que la naturaleza de la señal de maduración (PAMP viral o
microbiano) favorece un determinado patrón de citocinas para un micro-
ambiente que “instruye” el desarrollo de linfocitos T vírgenes. Así, las
células dendríticas definen el tipo de respuesta adaptativa que habrá de
desarrollarse (Fig. 3) (Akira, 2003; Banchereau & Palucka, 2005; Degli &
Smyth, 2005; Granucci et al., 2003; Huang et al., 2001; Iwasaki &
Medzhitov, 2004; Pardoll, 2002; Pulendran, 2004; Scott et al., 2005;
Stockwin et al., 2000).
Células Dendríticas y Linfocitos T
Posterior a su captura, el antígeno se procesa para su presentación
en complejos MHC-II o MHC-I/péptido en la superficie celular, a la vez que
la célula dendrítica migra y madura. La maduración involucra la expresión
de moléculas de co-estimulación y la disminución de los PRRs. Las células
dendríticas con el antígeno activan a los linfocitos T en los órganos linfoides
secundarios. La activación requiere de la estimulación sostenida del
receptor de linfocitos T (TCR), lográndose a través de la formación de la
sinapsis inmunológica, organización molecular concentrada en la región de
interacción entre las dos células, en donde se expresan el TCR, CD2 y
CD28 que interactúan con los complejos MHC-péptido. Además, se
expresan CD59/CD48 y CD80/CD86, moléculas de co-estimulación que en
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Figura 4 | Etapas de una respuesta inmune inflamato ria. Las
células dendríticas inmaduras expresan altos niveles de PRRs para la
captura del Ag, el cual estimula y promueve su migración hacia tejidos
periféricos. Al madurar adquieren la habilidad de estimular a los linfocitos T,
por su alta expresión de moléculas de co-estimulación. Los linfocitos T
proliferan, se diferencian a células efectoras y se extravasan hacia los sitios
de infección (Foti et al., 1999; Homey et al., 2002).
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conjunto a las primeras estimulan al linfocito T (Fig. 4) (Banchereau &
Palucka, 2005; Degli & Smyth, 2005; Foti et al., 1999; Granucci et al., 2003;
Heath et al., 2004; Homey et al., 2002; Montoya et al., 2002; Pardoll, 2002;
Scott et al., 2005).
Células Dendríticas en Infecciones Virales
Las células dendríticas juegan un papel crucial en la respuesta
inmune innata y adaptativa, haciéndolas sin embargo blanco de infecciones
virales. Un gran número de virus (influenza, virus sincitial respiratorio,
sarampión, herpes, citomegalovirus y dengue) pueden infectar directamente
las células dendríticas mieloides y linfoides in vitro, aunque no
necesariamente inducen su eliminación, ya que la producción de IFNα
protege a la célula de los efectos citopáticos virales. La inmunidad innata en
contra de los virus depende de los IFNs tipo I (IFNα/β) por interferir (de ahí
su nombre) en la replicación viral mediante la inducción de un gran número
de genes. Incrementa la expresión del MHC clase I en células infectadas
con virus y activa a las células NK. Por su parte, las células dendríticas
infectadas con un virus estimulan a los linfocitos T vírgenes para su
conversión en células efectoras productoras de IFNγ e IL-10. Por otro lado,
debido a que el tracto respiratorio es a menudo el sitio de replicación viral
primaria de algunos de los virus mencionados, es claro que el estudio de las
células dendríticas residentes sea de gran relevancia para las infecciones
virales in vivo (Fassnacht et al., 2004; Lambrecht et al., 2001; Ludewig et
al., 1998; Salek et al., 2004; Vincent et al., 2003).
Apoptosis por Virus
La inducción de la apoptosis por los virus es un fenómeno bien
establecido, mas no está completamente clara su relevancia en los
procesos infecciosos (Hay & Kannourakis, 2002).
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La muerte celular programada o apoptosis es un proceso importante
en el desarrollo y homeostasis de organismos multicelulares. Se caracteriza
por la activación de las caspasas, condensación de la cromatina, exposición
de la fosfatidilserina, contracción del citoplasma y la formación de las
prolongaciones membranaleso blebs. Es un mecanismo altamente eficiente
para la defensa en contra de una infección viral, organismos que pese a ser
simples en comparación a las células, tienen el potencial de modular las
vías apoptóticas del hospedero (Hay & Kannourakis, 2002; Miller & Fox,
2004; Sungwhan et al., 1999; Young et al., 1997).
Un virus puede afectar el inicio o progreso de la apoptosis en un
único punto. El inicio de la apoptosis representa una ventaja, ya que se
originan los cuerpos apoptóticos. Éstos al ser liberados son fagocitados por
los macrófagos, lo cual permite la diseminación de la progenie viral sin
iniciar una respuesta. Este fenómeno se ha observado para el virus HIV tipo
1, virus herpes simplex tipo 2 y del Epstein-Barr. Algunos virus pueden
multiplicarse rápidamente antes de que se monte una respuesta inmune
efectiva, característica de la mayoría de los virus ARN (como el de la
estomatitis vesicular y de la influenza). Otra estrategia es la infección
críptica donde un virus puede infectar una célula y permanecer indetectable,
evitando así la destrucción de la célula hospedera y permitiendo una
infección productiva. Además, un solo virus puede codificar proteínas que
promuevan o inhiban la apoptosis, tal como el HIV tipo 1. El HIV Nef la
induce mediando la expresión de TNF a la par que disminuye la expresión
de MHC I y de CD4, mientras que la GPx la inhibe al reducir el estrés
oxidativo y otras proteínas vía linfocitos CD8+ (Cuconati & White, 2002;
Deszcz et al., 2005; Hay & Kannourakis, 2002; Labarque et al., 2003;
Leopardi & Roizman, 1996; Sirinarumitr et al., 1998; Young et al., 1997).
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Apoptosis por el Virus PRRS
El virus de la arteritis equina (EAV) es el virus prototipo de los
Arteviridae. Se ha demostrado que induce apoptosis en células infectadas
in vitro sin inhibir la multiplicación viral y que la apoptosis se co-relaciona a
la aparición del efecto citopático (Miller & Fox, 2004).
El primer reporte de apoptosis relacionada al PRRSV fue por Suárez
et al., (1996). Ellos mostraron que la glicoproteína GP5 del PRRSV induce
apoptosis en monocapas de células MARC-145 cuando la glicoproteína
esté expresada en un vector vaccinia. Por su parte, Lee et al., (2004)
concluyen que la apoptosis inducida por la GP5 podría no ser observada, ya
que al establecer células HeLa que expresaban GP5 y al incubarlas con
células MARC-145, no observaron una reducción en el número de células o
fragmentación de DNA y los perfiles de expresión de genes no mostraron
una regulación de genes pro-apoptóticos.
Sirinarumitr et al., (1998) determinaron apoptosis en células
CRL11171 y en tejidos de cerdos infectados con la cepa PRRSV VR2385.
Labarque et al., (2003) observaron una relación entre el pico de replicación
del virus y la inducción de apoptosis en los pulmones de cerdos infectados
con PRRSV, aunque la mayoría de las células apoptóticas no estaban
infectadas. Debido a que la apoptosis es un proceso para eliminar células
en exceso o defectuosas durante el desarrollo normal, ellos la sugieren
como un mecanismo de control de la población. Sur et al., (1998) evaluaron
la apoptosis causada por la cepa PRRSV 16244B in vivo y encontraron
alteraciones en la espermatogénesis y apoptosis de células germinales
epiteliales en los testículos de cerdos infectados, sugiriendo la presencia de
un mecanismo indirecto de inducción de apoptosis por el PRRSV. Kim et al.,
(2002) evaluaron el mecanismo de muerte celular por la infección de células
MARC-145 con la cepa silvestre (P6) y una cepa adaptada a un cultivo
celular (P136) derivada del aislado americano SDSU-23983. Sus resultados
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indican que la apoptosis ocurre en células infectadas con PRRSV, pero es
un evento tardío durante la replicación del PRRSV y culmina rápidamente
en necrosis.
Algunos estudios demuestran que la infección con virus ARN activa
células dendríticas inmaduras. Un estudio demostró que el virus de la fiebre
porcina clásica favoreció una respuesta tipo I de IFNs, sin intervenir con la
reactividad inmune. En el caso del PRRSV no hay estudios al respecto, sin
embargo, se ha demostrado que induce apoptosis en macrófagos
alveolares y células germinales de cerdos. Considerando que algunas
células dendríticas pertenecen al linaje monocito-macrófago es posible que
además de infectarlas, el PRRSV provoque un efecto citopático similar al
observado en macrófagos (Kim et al., 1993; Kim et al., 2002; Labarque et
al., 2003; Miller & Fox, 2004; Meulenberg, 2000; Rossow, 1998; Sur et al.,
1998).
La comprensión de la dinámica de la persistencia del PRRSV es
esencial para el desarrollo de programas de control exitosos. Por ello, el
estudio de la infección por PRRSV en células dendríticas es importante ya
que los mecanismos de la inmunidad celular que este virus induce no han
sido comprendidos en su totalidad hasta el momento, así como tampoco se
ha determinado la relevancia de la apoptosis por la infección. Al ser las
células dendríticas de linaje monocito-macrófago y las presentadoras de
antígeno más importantes, se considera que su participación tanto en la
infección como en la persistencia del PRRSV es crítica. Por lo anterior, el
objetivo de este trabajo fue evaluar si la infección con PRRSV induce
apoptosis en células dendríticas de cerdo, mediante citometría de flujo
utilizando anexina V FITC.