1

METODOS DE ANÁLISIS EN QUIMICA CLINICA ANÁLISIS DE SANGRE

1. Análisis en suero

1.1. Evaluación de la función renal. ACIDO URICO: Es el producto resultante del metabolismo de las nucleoproteínas. La insuficiencia renal crónica avanzada produce un incremento progresivo del nivel de ácido úrico en el plasma. Se deposita en los tejidos en forma de uratos dando lugar a la enfermedad conocida como �gota�. Intervalos de referencia: 36-77 mg/L en Hombres 25-68 mg/L en Mujeres Métodos de análisis: • Método espectrofotométrico: el ácido úrico actúa como un agente reductor del ácido fonsfotungstico. Previamente hay que eliminar las proteínas por precipitación. Ácido úrico + H3PW12O40 + O2 → Alantoína + CO2 + AZUL DE TUNGSTENO ( λ = 700 nm) • Método enzimático: URICASA Ácido úrico + O2 Alantoína + H2O2 + CO2 • Método polarográfico: Se emplea un sensor polarográfico de O2. En la reacción anterior, se mide el consumo de O2 siendo proporcional a la concentración de ácido úrico. • HPLC Se usa fase inversa y detección espectrofotométrica a λ = 280 ó 235 nm nm También se puede usar intercambio iónico y detección electroquímica (amperométrica: se mide la intensidad de corriente a un potencial constante).

1.2. Evaluación de existencia de hiperlipidemia y de riesgo de enfermedades cardiovasculares. COLESTEROL: Se encuentra presente en todas las lipoproteínas plasmáticas. Cuando un exceso de lípidos no se elimina o utiliza, se deposita en tejidos y paredes arteriales, obstruyendo el flujo de sangre a órganos vitales. Se obstruye la circulación dando lugar, por ejemplo, al infarto de miocardio. Intervalos de referencia: 1.20-2.20 g/L Colesterol HDL: 0.40-1.10 g/L Hombres 0.50-1.20 g/L Mujeres Métodos de análisis: La determinación de colesterol total incluye las formas libre y esterificada del mismo. Los métodos de análisis se dividen en:

Se acopla a una reacción indicadora

2

• Métodos en 1 etapa: son ensayos directos, sin preparación previa de la muestra de suero. Suelen ser medidas espectrofotométricas o fluorimétricas. Exhiben a menudo errores debido a interferencias y a diferencias del color desarrollado por el colesterol libre y el esterificado. • Métodos en 2 etapas: se introduce una etapa previa de extracción orgánica eliminando muchas interferencias. Sin embargo, no se elimina el efecto de la respuesta de color diferencial entre el colesterol libre y esterificado. Pero se acepta para el trabajo clínico de rutina usando factores de corrección. • Métodos en 3 etapas: además de la extracción del colesterol, incluye una etapa de saponificación que hidroliza la porción acido graso de los esteres del colesterol. Se determina el colesterol libre total • Métodos en 4 etapas: además de la extracción, saponificación y desarrollo del color, incluye una cuarta etapa en la cual se precipita el colesterol libre con digitonina (saponina que esterifica el grupo hidroxilo) La cuantificación final del colesterol se hace por la medida del color desarrollado y no se distingue entre colesterol libre y esterificado. El reactivo reacciona con el colesterol que encuentran y ya sabemos que el desarrollo del color es distinto para el colesterol libre y para el esterificado. Esta cuantificación final puede hacerse: Reacción con una sal de Fe3+ : se emplea ácido acético + ácido sulfúrico y se añade una sal de Fe3+ Como producto de reacción se obtiene el catión tetraenílico que se mide a λ = 563 nm. Reacción con el ácido p-toluensulfónico: Anhídrido acético Colesterol + ácido p-toluensulfónico cromóforo (λ = 550 nm) ac. Acético glacial ac. Sulfúrico Reacciones enzimáticas: incluyen la etapa de saponificación mediante el uso de una enzima: Colesterol esterasa Esteres del colesterol + H2O Colesterol + ácidos grasos libres Colesterol oxidasa Colesterol + O2 colest-4-eno-3-ona + H2O2

EXTRACCIÓN COLESTEROL LIBRE TOTAL DESARROLLO COLORSAPONIFICACIÓN CUANTIFICACIÓN

12 3

Colesterol LIBRE+

Colesterol ESTERIFICADO

EXTRACCIÓNEXTRACCIÓN COLESTEROL LIBRE TOTALCOLESTEROL LIBRE TOTAL DESARROLLO COLORDESARROLLO COLORSAPONIFICACIÓN CUANTIFICACIÓN

1122 33

Colesterol LIBRE+

Colesterol ESTERIFICADO

EXTRACCIÓN COLESTEROL ESTERIFICADO COLESTEROL LIBREDIGITONINA SAPONIFICACIÓN

12 3

Colesterol LIBRE+

Colesterol ESTERIFICADO DESARROLLO COLOR

4Se cuantifica

↓Colesterol LIBRE

CUANTIFICACIÓN

EXTRACCIÓNEXTRACCIÓN COLESTEROL ESTERIFICADOCOLESTEROL ESTERIFICADO COLESTEROL LIBRECOLESTEROL LIBREDIGITONINA SAPONIFICACIÓN

1122 33

Colesterol LIBRE+

Colesterol ESTERIFICADO DESARROLLO COLORDESARROLLO COLOR

44Se cuantifica

↓Colesterol LIBRE

CUANTIFICACIÓN

3

Se sigue el consumo de O2 con un electrodo de oxígeno o bien se acopla el H2O2 a una reacción indicadora, por ejemplo: Peroxidasa 2 H2O2 + Fenol + 4-aminofenazona quinonimina + 4 H2O Se determina la quinonimina formada a λ = 500 nm COLESTEROL UNIDO A LIPOPROTEÍNAS DE ALTA DENSIDAD- HDL : High Density Lipoproteins LDL: Low Density Lipoproteins VLDL: Very Low Density Lipoprotein. La HDL desempeñan un papel importante para transportar el colesterol lejos de los tejidos y proporciona protección contra las enfermedades de la arteria coronaria. Están compuestas por un 50% de proteínas y un 50% de lípidos. De estos últimos, el 28% son fosfolípidos, el 18% colesterol (libre y esterificado, más cantidad del segundo) y el 4% restante son triglicéridos. Los pasos a seguir para determinar el colesterol unido a las HDL sería:

• Aislar las HDL • Cuantificar el colesterol (ya visto)

Para aislar las HDL se puede seguir cualquiera de los siguientes métodos:

• Ultracentrifugación: el suero se ajusta a una densidad de 1.063 g/ml por adición de KBr (415 mg/5 mL). Se centrífuga: la disolución sobrenadante contiene VLDL y LDL y la inferior HDL

• Cromatografía en columna por intercambio iónico o exclusión molecular. • Electroforesis • Precipitación: precipitación selectiva de lipoproteínas con diversas soluciones

polianiónicas. Las HDL quedan en el sobrenadante, no precipitan.

1.3. Evaluación de la función hepática Para evaluar la función hepática se determinan las siguientes enzimas: Alanina aminotransferasa (ALT) Fosfatasa alcalina (ALP) Aspartato aminotransferasa (AST) Gamma glutamiltransferasa (GGT) Como ejemplo, veremos la determinación de la ALT: ALANINA AMINOTRANSFERASA (ALT): Diagnostica enfermedades hepáticas agudas y crónicas, la presencia de hepatitis aumenta su concentración en suero. Intervalo de referencia: 0-55 U/L

4

Métodos de análisis: Esta enzima cataliza la transferencia del grupo amino según la reacción: El suero a analizar (donde se encuentra la ALT) se incuba en L-alanina + α-cetoglutarato de manera que el PIRUVATO formado se evalúa de una de las dos maneras siguientes: a) Se sigue la candidad de Dinitrofenilhidrazona del piruvato formada a λ= 505 nm: b) Se sigue espectrofotométricamente a λ= 340 nm la desaparición del NADH (Nicotinamida-adenin-dinucleotido reducido):

2. Medidas de la coagulación sanguínea Los coágulos de sangre se forman por la interacción de aproximadamente una docena de proteínas llamadas factores de coagulación, los cuales funcionan simultáneamente para convertir la proteína PROTROMBINA en un enzima proteolítico llamado TROMBINA La TROMBINA a su vez actúa sobre una proteína circulante denominada FIBRINOGENO, convirtiendo dicho fibrinógeno en FIBRINA. Los monómeros de fibrina se polimerizan para formar unas macromoléculas denominadas REDES DE FIBRINA.

CO2H

H - C � NH2

CH3

CO2H

C = O

CH2

CH2

CO2H

CO2H

C = O

CH3

CO2H

H- C = NH2

CH2

CH2

CO2H

+ +

L-Alanina α-Cetoglutarato PIRUVATO L-Glutamato

ALT↔CO2H

H - C � NH2

CH3

CO2H

H - C � NH2

CH3

CO2H

C = O

CH2

CH2

CO2H

CO2H

C = O

CH2

CH2

CO2H

CO2H

C = O

CH3

CO2H

C = O

CH3

CO2H

H- C = NH2

CH2

CH2

CO2H

CO2H

H- C = NH2

CH2

CH2

CO2H

+ +

L-Alanina α-Cetoglutarato PIRUVATO L-Glutamato

ALT↔

CO2H

H - C � OH

CH3

Lactato

+ NAD+↔LD (lactatodeshidrogenada)+ NADH + H+PIRUVATO

CO2H

H - C � OH

CH3

CO2H

H - C � OH

CH3

Lactato

+ NAD+↔LD (lactatodeshidrogenada)+ NADH + H+PIRUVATOPIRUVATO

CO2H

C = O

CH3

PIRUVATO

CO2H

N = C

CH3

Dinitrofenilhidrazina (DNPH) Dinitrofenilhidrazona del PIRUVATO (azul)

+ ↔CO2H

C = O

CH3

CO2H

C = O

CH3

PIRUVATOPIRUVATO

CO2H

N = C

CH3

CO2H

N = C

CH3

Dinitrofenilhidrazina (DNPH) Dinitrofenilhidrazona del PIRUVATO (azul)

+ ↔

5

Las redes de fibrina en conjunción con las plaquetas agregadas y los glóbulos rojos de la sangre forman un coágulo que generalmente puede prevenir la pérdida excesiva de sangre. Los ANALIZADORES DE COAGULACIÓN son instrumentos que se utilizan para estudiar el estado funcional del sistema de coagulación. Evalúan la capacidad del sistema de coagulación, midiendo la cantidad de tiempo necesario para que ocurra la formación de redes de fibrina bajo condiciones cuidadosamente controladas. Los medidores del tiempo de coagulación más utilizados son:

1. Medidores ópticos del tiempo de coagulación (ver fotocopia correspondiente) Los ensayos que se realizan más comúnmente son los del tiempo de protrombina y tiempo de tromboplastina parcial activada. En ambos casos, los reactivos apropiados se mezclan con la muestra y cuando se añade el último reactivo se pone en marcha el cronómetro. Cuando el instrumento detecta la formación de redes de fibrina se para el cronómetro. Los medidores ópticos se basan en la turbidimetría y en él las redes de fibrina formadas son los suficientemente grandes para dispersar o bloquear la transmisión de energía radiante. Cuando se va a medir el tiempo de coagulación, la muestra de plasma se mezcla con todos los reactivos excepto uno. Al añadir el último reactivo, es cuando se pone en marcha el cronómetro. Cuando el detector capta una disminución brusca de la luz transmitida, el cronómetro se para automáticamente. Las medidas de coagulación son dependientes de la temperatura, la mayoría de los instrumentos están preparados para mantener la muestra problema a 37± 0.5ºC

2. Medidores conductimétricos del tiempo de coagulación (ver fotocopia correspondiente) Se determina la conductividad eléctrica sumergiendo dos electrodos en la mezcla de reacción. Cuando se añade el último reactivo a la cubeta de ensayo se pone en marcha el cronómetro y uno de los electrodos se mueve rápidamente a través de la solución. Con su movimiento se acerca al electrodo fijo sin llegar a tocarlo, volviendo después a la posición original. Este ciclo se repite aproximadamente cada medio segundo, manteniendo la disolución bien mezclada. Cuando comienzan a formarse las redes de fibrina, se conectan los dos electrodos entre sí, causando un cambio en la conductividad eléctrica que provoca la parada del cronómetro.

3. Contadores de células sanguíneas Los más sencillos pueden identificar y contar eritrocitos, leucocitos y plaquetas. Entre los más complejos están los citómetros de flujo que pueden identificar y contar distintos subtipos de leucocitos. En los laboratorios no orientados a la investigación, se pueden encontrar dos métodos de identificación y recuento de células: uno basado en la medida de la resistencia eléctrica y otro basado en una medida óptica.

1. Contadores de células basados en la medida de la resistencia eléctrica: (ver fotocopia) Se diluye la sangre con un disolvente de alta conductividad (baja resistencia) y se la hace pasar por una cámara de flujo que presenta un pequeño orificio o abertura que provoca que la mayoría de la células pasen alineadas. Posee unos electrodos de platino que permiten medir la resistencia eléctrica durante el período en que un volumen conocido de sangre pasa a través de la abertura.

6

Cuando una célula sanguínea pasa a través del orificio, se incrementa la resistencia eléctrica en dicho orificio ( las resistencia de las células es mucho mayor que las del electrolito que las desplaza). La resistencia medida es la suma de la resistencia de la célula sanguínea y del disolvente no desplazado. Una vez que la célula ha pasado a través de la abertura, ésta se llena con disolvente altamente conductor y la resistencia vuelve a su valor inicial. Se cuenta cada impulso de resistencia que tiene lugar cuando la sangre diluida pasa a través de la abertura. El recuento real viene dado por un contador electrónico. El recuento celular, expresado en nº de células / L se calcula a partir del volumen de sangre diluida medida, el nº de impulsos registrados y el factor de dilución empleado en la preparación de la muestra. Para optimizar los resultados, hay que tener en cuenta que, a veces, pasan dos o más células a través del orificio simultáneamente. La frecuencia con la que esto ocurre está relacionada con el nº de células presentes y el tamaño del orificio. El factor de corrección es predecible y calculable a partir de consideraciones estadísticas. En estos equipos, se pueden distinguir células de diferentes tamaños; ya que al tener volúmenes celulares diferentes generan distintos cambios en la resistencia eléctrica: células pequeñas como las plaquetas generan pequeños cambios en la resistencia, mientras que células más grandes como los glóbulos blancos producen un incremento de resistencia más grande. Se emplean circuitos electrónicos discriminatorios que clasifican los impulsos por tamaños y los integra para responder sólo a células de un determinado tipo.

2. Contadores celulares basados en medidas ópticas. (ver fotocopias) Se basan en la capacidad de dispersión de la radiación electromagnética: la energía radiante sufre una dispersión de bajo ángulo considerable al chocar con las células; lo que se utiliza para realizar recuentos celulares. Se necesita un fotómetro de dispersión de bajo ángulo y una vasija de flujo que obligue a las células sanguíneas a pasar a través de un rayo de luz, una por una. Es necesario conocer el volumen de sangre analizada con el fin de expresar los resultados en nº de células / L sangre. La intensidad y duración de la señal de salida del fotomultiplicador es característica de la célula que pasa a través del volumen activo. Es posible hacer un recuento de células y, en algunos casos, identificarlas. Es también posible estimar el volumen medio de la célula.