anÁlisis de la diversidad y distribuciÓn genÉtica de
TRANSCRIPT
ANÁLISIS DE LA DIVERSIDAD Y DISTRIBUCIÓN GENÉTICA DE
BACTERIAS DIAZÓTROFAS EN SUELOS DE LA AMAZONÍA
COLOMBIANA.
Mariana Rodríguez Melo
Tesis presentada como requisito parcial para
la obtención del t itulo de Biólogo
Director: María Mercedes Zambrano
Corporación CorpoGen
Codirectores: Silvia Restrepo
Lucía Lozano
Universidad de los Andes
Departamento de Ciencias Biológicas
Facultad de Ciencias
Universidad de los Andes Bogotá D.C. Julio de 2007
AGRADECIMIENTOS
Quiero agradecer en primer lugar a Maria Mercedes Zambrano, mi directora,
por su orientación, sus continuos aportes y todo lo que me enseñó durante la
realización de este trabajo.
A Patricia del Portillo por sus oportunas recomendaciones y sugerencias.
A todos los miembros de la Corporación Corpogen por su enorme
colaboración y su compañía. Especialmente a Claudia Burbano por abrirme
las puertas al proyecto, ser una gran maestra y un ejemplo a seguir, y a
Alejandro Reyes por su invaluable colaboración en este trabajo y su apoyo
incondicional.
A Silvia Restrepo y Lucía Lozano, por aceptar codirigir este trabajo y por toda
su colaboración.
Al Instituto Amazónico de Investigaciones Científicas (SINCHI) por toda la
colaboración prestada, especialmente a Gladys Cardona y Andrea Mantilla
por el trabajo en equipo.
A Colciencias por la financiación de este proyecto.
Finalmente a toda mi familia por su inmensa confianza, compresión y
permanente estímulo.
0
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Ciclo del nitrógeno...............................................................................................6
Figura 2. Estructura atómica del Nitrógeno atmosférico (N2). ......................................9
Figura 3. Ecuación de la fijación biológica de nitrógeno..............................................10
Figura 4. Esquema del proceso enzimático para la fijación de nitrógeno.................11
Figura 5. Esquema de genes nif de Klebsiella pneumoniae. .....................................12
Figura 6. Sistema de regulación por NtrC para la fijación de nitrógeno....................13
Figura 7. Distribución filogenética de nifH......................................................................23
Figura 8. Localización de sitios de muestreo.................................................................26
Figura 9. Ecosistemas estudiados ...................................................................................27
Figura 10. Descripción de la estrategia de muestreo. ..................................................28
Figura 11. Esquema muestreo al interior de cada UE..................................................28
Figura 13. Línea de trabajo empleada para el análisis de secuencias......................34
Figura 14. Extracción de ADN comunitario de suelos..................................................37
Figura 15. Amplificación del gen nifH de las 36 muestras de ADN extraído. ..........38
Figura 16. PCR con iniciadores M13 confirmando la inserción del fragmento de nifH
en los clones obtenidos. ....................................................................................................39
Figura 17. Topología construida con base en Neigbour-Joining.................................41
Figura 18. Topología de secuencias nifH de referencia con base en nucleótidos...45
Figura 19. Topología de secuencias nifH de referencia con base en aminoácidos.46
Figura 20. PCA de la composición genética de nifH entre diferentes ecosistemas.
...............................................................................................................................................49
Figura 21. Agrupación de los sitios de muestreo según su composición genética..50
Figura 22. Curva de rarefacción de filotipos observados en cada sitio de muestreo.
...............................................................................................................................................53
Figura 23. Curvas de rarefacción por ecosistema.........................................................54
Figura 24. Esquema de interacción entre variables......................................................55
Figura 25. Valores medios de diversidad por ecosistema. ..........................................56
Figura 26. Asociación entre variables y componentes principales.............................58
Figura 27. Ubicación geográfica de los sitios de muestreo. ........................................60
Figura 28. Mapa factorial generado por PCA de parámetros fisicoquímicos............60
Figura 29. Agrupación de los sitios de muestreo según su diversidad genética......62
1
LISTA DE TABLAS
Tabla1: Etapas de la Nitrificación.......................................................................................8
Tabla 2. Reservorios de nitrógeno.....................................................................................9
Tabla 3. Nitrogenasas alternativas, clusters metálicos y genes asociados..............19
Tabla 4. Resumen del muestreo realizado en suelos bajo diferentes coberturas en
el Sur del Trapecio Amazónico.........................................................................................30
Tabla 5. Oligonucleótidos para la amplificación de nifH...............................................32
Tabla 7. Matriz de distancia filogenética entre sitios de muestreo por el método
Kimura dos parámetros......................................................................................................47
Tabla 8. Numero de clones, filotipos y diversidad estimada en cada sitio de
muestreo...............................................................................................................................52
Tabla 8. Análisis fisicoquímicos para cada sitio de muestreo....................................57
Tabla 10. Correlación entre distancia geográfica, parámetros fisicoquímicos y
diversidad.............................................................................................................................61
Tabla 11. Correlación entre distancia geográfica, parámetros fisicoquímicos y
distancia filogenética..........................................................................................................63
2
TABLA DE CONTENIDO
I. INTRODUCCIÓN............................................................................................................4
II. MARCO TEÓRICO........................................................................................................6
1. CICLO DEL NITRÓGENO................................................................................................... 6 1.1 Amonif icación.......................................................................................................... 7 1.2 Inmovilización o asimilación ................................................................................... 7 1.3 Nitr if icación ............................................................................................................. 7 1.4 Denitrif icación ......................................................................................................... 8 1.5 Fijación Biológica del Nitrógeno ............................................................................. 8
2. CARACTERÍSTICAS GENERALES DEL COMPLEJO NITROGENASA.................................... 10 2.1 Genética del Complejo Nitrogenasa .................................................................... 12 2.2 Regulación Transcripcional de la Nitrogenasa .................................................... 12 2.3 Regulación Post traduccional............................................................................... 14
3. DIVERSIDAD DE ORGANISMOS DIAZÓTROFOS................................................................ 14 3.1 Fijación Simbiótica del Nitrógeno ......................................................................... 14 3.2 Simbiosis Rhizobia-Leguminosa .......................................................................... 15 3.3 Fijación de Nitrógeno en Asociaciones no simbióticas........................................ 15 3.4 Diazótrofos de Vida Libre ..................................................................................... 16 3.5 Nitrogenasas Alternativas..................................................................................... 18
4. MÉTODOS PA RA ESTUDIAR LA DIVERSIDAD MICROBIA NA ............................... 19 4.1 Polimorfismos de longitud en fragmentos de restricción (RFLP) ........................ 19
5. ESTIMACIÓN DE LA DIVERSIDAD DE ORGANISMOS DIAZÓTROFOS.................................. 21
III. OBJETIVOS ................................................................................................................25
1. OBJETIVO GENERAL ................................................................................................ 25 2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...................................................................................... 25
IV. MATERIALES Y MÉTODOS ...................................................................................26 1. FASE DE CAMPO........................................................................................................... 26
1.1 Ubicación de sitios de muestreo .......................................................................... 26 2. FASE DE LABORATORIO................................................................................................ 31
2.1 Extracción de ADN comunitario ........................................................................... 31 2.2 Amplif icación Selectiva del gen nifH .................................................................... 31 2.3 Clonación y secuenciación de los fragmentos del gen nifH. ............................... 33 2.4 Análisis de Secuencias......................................................................................... 34 2.5 Análisis Filogenético............................................................................................. 35
3
2.6 Estimación de la diversidad genética de nifH en los diferentes ecosistemas ..... 36 2.7 Pruebas de Correlación y Análisis de Estadístico ............................................... 36
V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.................................................................................37 1. Extracción de ADN y Amplif icación Selectiva del gen nifH ....................................... 37 2. Clonación y Secuenciación de los fragmentos del gen nifH...................................... 39 4. Análisis de la Distribución de Secuencias nifH en los Ecosistemas Estudiados ...... 48 5. Estimación de la Diversidad Genética de nifH para cada Ecosistema ..................... 50 6. Pruebas de Correlación y Análisis Estadístico .......................................................... 55
VI. CONCLUSIONES ......................................................................................................65
VII. BIBLIOGRAFIA ........................................................................................................67
4
I.INTRODUCCIÓN
El suelo sostiene una gran cantidad y diversidad de microorganismos que son los
principales responsables del reciclaje de materia orgánica y que, gracias a su
enorme versatilidad metabólica intervienen en numerosas etapas de los ciclos del
carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y otros elementos, cumpliendo un papel
fundamental en el mantenimiento de los ciclos biogeoquímicos (Kirk, J L, et al.,
2004).
Los factores bióticos y abióticos que interactúan en un ecosistema influencian los
patrones de distribución de los microorganismos dentro del mismo (Larocque, J R,
et al., 2004). Sin embargo, a pesar de la influencia que tiene la diversidad y la
composición de las comunidades bacterianas en los procesos naturales, se conoce
muy poco acerca de la biogeografía de los microorganismos y la forma cómo
diferentes factores ambientales afectan su distribución (Fierer, N y Jackson, R B,
2006). Por ejemplo, aunque han surgido varios estudios que pretenden evaluar el
efecto que generan actividades humanas como la deforestación de bosques y el
uso excesivo de fertilizantes químicos sobre la diversidad de microorganismos
(Nogales, B, 2004), no se ha determinado de manera concisa el impacto de los
problemas medioambientales en las comunidades microbianas y su relación con el
funcionamiento del ecosistema.
Mediante el estudio comparativo de la diversidad microbiana en ambientes
contrastantes, es posible evaluar el efecto generado por las transformaciones en un
ecosistema en la composición y distribución de estas comunidades. Estos análisis
constituyen una herramienta que puede ser empleada para predecir o monitorear
impactos futuros sobre el ambiente.
El proceso de fijación biológica del nitrógeno constituye uno de los aportes más
importantes que llevan a cabo algunos organismos procariotas en la naturaleza y
consiste en la transformación del nitrógeno atmosférico (N2) en amonio (NH4),
siendo éste último, a diferencia del primero, un compuesto biológicamente
5
disponible para las plantas y los microorganismos (Poly, F, et al. 2001). Estos
microorganismos conocidos como diazótrofos componen un grupo funcional muy
diverso fisiológicamente y su actividad es fundamental en ecosistemas naturales
donde el nitrógeno es un factor limitante para el crecimiento vegetal.
En el presente estudio se realiza un análisis comparativo de la diversidad genética
de microorganismos diazótrofos, bajo tres ecosistemas contrastantes en el sur de la
amazonía colombiana. Esta región se caracteriza por una alta diversidad en
especies de flora y fauna, sin embargo se encuentra amenazada por fenómenos de
deforestación para el desarrollo de actividades agrícolas y ganaderas. Dentro de las
consecuencias más evidentes generadas por esta intervención se encuentra la
disminución de especies forestales y el aumento en los procesos erosivos del suelo,
lo cual genera un desequilibrio ecológico que muy probablemente repercute sobre
las comunidades microbianas bajo el suelo (Cardona, G I, 2004).
En general, los suelos de la amazonía colombiana presentan una alta acidez y baja
fertilidad. Bajo estas condiciones el aporte que realizan diferentes microorganismos
como los diazótrofos, al aumentar las reservas de nitrógeno disponible, es esencial
para el funcionamiento del ecosistema. Por esta razón, es importante estudiar la
forma cómo actividades humanas influencian la composición de organismos
diazótrofos en el ambiente para evaluar la sostenibilidad de estos ecosistemas
(Widmer, F, et al., 1999). El propósito de este trabajo es identificar mediante
técnicas moleculares la variabilidad genética de estos organismos frente a
diferentes condiciones ambientales, bajo suelos de ecosistemas intervenidos
(pastizales y sistemas de cultivo indígenas) y no intervenidos (bosques maduros).
6
II. MARCO TEÓRICO
1. Ciclo del Nitrógeno
El nitrógeno es un elemento esencial para el desarrollo de cualquier organismo
vivo, pues es el componente básico de las proteínas, los ácidos nucleicos y otros
elementos celulares como vitaminas, antibióticos, polímeros de la pared celular e
intermediarios metabólicos. Este elemento forma parte de una gran cantidad de
compuestos y presenta varios estados de oxidación, por esta razón en el ciclo del
nitrógeno intervienen varios procesos complejos, de los cuales la gran mayoría se
llevan a cabo mediante la interacción con diferentes grupos de microorganismos
(Sylvia, D M). El estudio del ciclo del nitrógeno (Figura 1) es fundamental para el
entendimiento de los procesos que ocurren en los ecosistemas naturales y los
posibles impactos que se pueden generar si se altera cualquier etapa del ciclo.
Etapas Básicas del Ciclo del Nitrógeno:
Figura 1. Ciclo del nitrógeno
7
1.1 Amonificación
La segunda reserva más abundante de nitrógeno en la tierra, después del
nitrógeno atmosférico, se encuentra en el suelo como nitrógeno orgánico
formando parte de numerosos compuestos como aminoácidos, proteínas y ácidos
nucleicos, entre otros.
El proceso de amonificación consiste en la conversión de nitrógeno orgánico en
amonio (NH4+), mediante enzimas extracelulares producidas por diferentes
microorganismos. Diversos compuestos orgánicos son degradados por enzimas
como: quitinasas, proteinasas, endonucleasas, exonucleasas, ureasas, etc.,
obteniendo como resultado la producción de amonio, el cual es incorporado
nuevamente por microorganismos y plantas, en el proceso de asimilación
(Orozco, F H, 1999)
En el suelo el amonio tiene tres destinos principales: absorción vegetal,
asimilación microbiana y oxidación a nitrato.
1.2 Inmovilización o asimilación
En este proceso, que es el inverso a la amonificación, los organismos asimilan el
amonio incorporándolo en glutamato mediante dos vías principales: glutamin-
glutamato sintetasa (GOGAT), en condiciones en las cuales el amonio es escaso y
vía glutamato deshidrogenasa cuando hay una mayor cantidad de sustrato en el
suelo (Sylvia, D M, 1998).
1.3 Nitrificación
Este es el proceso de oxidación del amonio a nitrato y consiste en dos etapas
catalizadas por dos grupos de microorganismos diferentes. En el primer paso el
amonio se transforma en nitrito (NO2-), gracias a bacterias de los géneros
8
Nitrosomonas, Nitrospira y Nitrosococcus. Luego el nitrito es oxidado a nitrato
(NO3), por bacterias del género Nitrobacter, Nitrococcus y Nitrospira.
1. NH3 + O2 → NO2− + 3H+ + 2e−
2. NO2− + H2O → NO3− + 2H+ + 2e−
Tabla1: Etapas de la Nitr if icación
El proceso de nitrificación es influenciado principalmente por factores como la
presencia de oxígeno, la disponibilidad de sustrato y el pH del suelo. Bajo
condiciones aerobias el proceso depende principalmente de la concentración de
sustrato en el suelo [Kowalchuk, et al. 2002.
1.4 Denitrificación
La denitrificación se conoce también como denitrificación respiratoria y constituye el
proceso contrario de la fijación de nitrógeno. En ambientes anóxicos algunos
organismos emplean el nitrato como aceptor de electrones y se reduce a N2 y N2O.
El proceso se lleva a cabo en cuatro etapas principales catalizadas por las enzimas:
Nitrato reductasa (Nar), nitrito reductasa (Nir), reductasa de óxido nítrico (Nor) y de
óxido nitroso (Nos). La mayoría de los organismos denitrificantes pertenecen al
género Pseudomonas [Sylvia, et al. 1998]
1.5 Fijación Biológica del Nitrógeno
La mayor reserva de Nitrógeno se encuentra en la atmósfera en forma de
dinitrógeno atmosférico (N2) (Tabla 2). La atmósfera terrestre esta compuesta en un
79% de gas N2, 20% de O2 y 1% por otros gases Ar, Ne, etc.
9
Tabla 2. Reservorios de nitrógeno.
Tomada de Madigan, et al. 1997.
COMPONENTE RESERVORIO
(g x 1015) ATMOSFERA
N2 3.800.000
NH3 - NH4 0,003
Nitrógeno Orgánico 0,001
TIERRA Nitrógeno Inorgánico 16
Nitrógeno Orgánico 300
Biomasa 0,3
OCEANO
N2 22.000
Biomasa 0,2
El nitrógeno atmosférico esta compuesto por dos átomos de nitrógeno unidos
mediante un triple enlace (Figura 2). Debido a su estructura el N2 se comporta como
una molécula prácticamente inerte.
Figura 2. Estructura atómica del Nitrógeno atmosférico (N2). Tomado de: www.windows.ucar.edu
El proceso de fijación biológica del nitrógeno consiste en la conversión de N2 a NH3+
(Figura 3), incorporándolo al ciclo en una forma biodisponible para las plantas y para
la mayoría de las bacterias. Este proceso constituye la fuente más importante de
nitrógeno en ecosistemas naturales y se lleva a cabo únicamente por algunas
bacterias y archaeas. En términos energéticos la fijación del nitrógeno es un
10
proceso muy costoso y requiere un alto potencial reductor y disponibilidad de ATP
(Halbleib, C M y Ludden, P W).
N2 + 8H+ + 8e− + 16 ATP → 2NH3 + H2 + 16ADP + 16 Pi
Figura 3. Ecuación de la fijación biológica de nitrógeno.
Los organismos que pueden emplear N2 como única fuente de nitrógeno se
conocen como diazótrofos y conforman un grupo funcional filogenéticamente
heterogéneo y muy diverso fisiológicamente (Burgmann, H, et al.). La única
característica que comparten todos los organismos diazótrofos es el complejo
enzimático responsable de la fijación biológica del nitrógeno, conocido como
complejo nitrogenasa.
2. Características Generales del Complejo Nitrogenasa
El complejo nitrogenasa está constituido por dos metaloproteínas altamente
conservadas en secuencia y estructura: dinitrogenasa reductasa y dinitrogenasa.
(Steenhoudt, O y Vanderleyden, J, 2000). La enzima dinitrogenasa, conocida
también como proteína MoFe contiene el sitio activo para la reducción del N2 y está
constituida por una tetrámero de 230kDa, codificado por los genes nifD y nifK. La
dinitrogenasa reductasa es el donante de electrones de la dinitrogenasa y es
codificada por el gen nifH. Este es un dímero compuesto por dos subunidades que
pesan en total 64kDa. Se conoce también como proteína-Fe (ferroproteína), pues
está constituida por un cluster metálico (Fe4S4) directamente implicado en la
transferencia de electrones hacia la dinitrogenasa.
El mecanismo de fijación biológica del nitrógeno se puede resumir en 5 pasos
fundamentales (Figura 4):
1. Reducción de la ferroproteína por parte de agentes reductores como
ferredoxinas o flavodoxinas.
11
2. Asociación de dos MgATP a la Fe proteína.
3. Formación del complejo entre la Fe proteína y FeMo proteína.
4. Transferencia de electrones (uno por ciclo), acoplado con la hidrólisis de las
dos moléculas de MgATP en dos MgADP+Pi.
5. Disociación del complejo y repetición del ciclo hasta cuando la proteína FeMo
acumula 8 electrones necesarios para la reducción del N2.
Figura 4. Esquema del proceso enzimático para la fijación de nitrógeno. Tomado de: Dixon y Kahn, 2004.
En general el complejo enzimático nitrogenasa presenta características que exigen
ciertos requerimientos fisiológicos para que se lleve a cabo la reacción (Sylvia, D M,
1998):
• Las enzimas son altamente sensibles a la presencia de oxígeno, ya que
concentraciones mínimas de este elemento son letales para la nitrogenasa.
• Requiere ion Mg2+ para su actividad
• Se inhibe por altas concentraciones de ADP
• Reduce H+ a H2
12
2.1 Genética del Complejo Nitrogenasa
Los genes que codifican para las enzimas dinitrogenasa y dinitrogenasa reductasa,
al igual que genes accesorios para transferencia de electrones, clusters metálicos,
síntesis y regulación conforman el cluster nif, el cual agrupa alrededor de 20 o más
genes. El conocimiento sobre el sistema nitrogenasa se deriva principalmente de
estudios realizados en Klebsiella pneumoniae (Figura 5).
Figura 5. Esquema de genes nif de Klebsiella pneumoniae. Genes nifH, nifD y nifK codifican para el complejo enzimático nitrogenasa (Bloques amarillos). Tomado de: http://www.mun.ca/biochem/courses/3107/Topics/Site_specific_Recomb.html
2.2 Regulación Transcripcional de la Nitrogenasa
La fijación de nitrógeno se regula a nivel transcripcional principalmente en respuesta
a los niveles de oxígeno y nitrógeno orgánico presentes en el ambiente (Halbleib,
C M y Ludden, P W, 2000). Debido a que la nitrogenasa es muy lábil ante la
presencia de oxígeno, resulta ventajoso evitar su trascripción cuando los niveles de
oxígeno son muy altos. Por otro lado, teniendo en cuenta que el proceso de fijación
es altamente costoso en términos metabólicos, éste sólo se lleva a cabo cuando no
hay otras fuentes de nitrógeno disponibles en el ambiente. El nivel al cual cada uno
de estos factores afecta la transcripción, depende de las características de cada
organismo en particular. Por ejemplo, los diazótrofos de vida libre son mucho más
sensibles a los niveles intracelulares de amonio que los organismos simbióticos.
El sistema de control de la fijación de nitrógeno más conocido se denomina Ntr
(Nitrogen regulation system) y ha sido estudiado principalmente en K. pneumoniae.
La regulación mediada por NtrC (Figura 6) ocurre a nivel transcripcional, y depende
de la concentración de nitrógeno orgánico intracelular.
13
Figura 6. Sistema de regulación por NtrC para la fijación de nitrógeno. Tomado de: Dixon y Kahn, 2004.
En ausencia de amonio o de nitrógeno orgánico, especialmente glutamina, la
enzima uracidiltransferasa (GlnB) fosforila, a través de la histidina kinasa (NtrB) el
regulador de respuesta (NtrC), el cual activa la trascripción de los genes nif. El NtrC-
P se ensambla corriente arriba del operon nifLA activando su trascripción. El operon
nifLA regula directamente la transcripción de los genes nif y su expresión se
determina tanto por NtrC como por el factor de transcripción NrtA (Dixon R. , K D,
2004)
14
2.3 Regulación Post traduccional
A diferencia de los mecanismos de regulación transcripcional, sólo unos pocos
organismos diazótrofos presentan regulación a nivel post-traduccional. Este sistema
previene el proceso de fijación en presencia de fuentes de nitrógeno disponibles o
bajo limitaciones energéticas. Mediante este mecanismo el complejo nitrogenasa se
inactiva de forma reversible por ADP-ribosilacion de la ferroproteína. La ADP-
ribosilacion ocurre únicamente sobre una de las subunidades del dímero que
conforma la enzima y previene la asociación del complejo entre la ferroproteína y la
proteína Fe-Mo.
3. Diversidad de Organismos Diazótrofos
Los genes que codifican para el complejo nitrogenasa se encuentran ampliamente
dispersos a lo largo de diversos géneros en los Dominios Bacteria y Archaea. Por lo
tanto, una gran variedad de microorganismos tienen la capacidad de fijación y se
han encontrado establecidos en una gran cantidad de nichos ecológicos. Se pueden
encontrar diazótrofos de vida libre, mientras que otros viven en simbiosis
asociativas u obligadas con algunas plantas.
3.1 Fijación Simbiótica del Nitrógeno
La asociación simbiótica para la fijación de N2 involucra un organismo procariota
capaz de fijar nitrógeno y un hospedero eucariota fotosintético, por lo general
plantas leguminosas aunque también ocurre con algas y líquenes. El N2 fijado en
NH4 beneficia el hospedero, mientras que el microsimbionte encuentra un ambiente
de protección y una fuente de nutrientes para su desarrollo. Se ha calculado que la
fijación simbiótica aporta hasta un 85% del nitrógeno requerido por las plantas
hospederas.
15
La simbiosis mutualista para la fijación del nitrógeno requiere el reconocimiento
entre el huésped y el hospedero para el desarrollo de estructuras específicas que
permitan su interacción.
3.2 Simbiosis Rhizobia-Leguminosa
Desde el puno de vista agronómico las leguminosas han sido consideradas desde
tiempos ancestrales como acumuladoras de nitrógeno y su cultivo se ha empleado
como estrategia para fertilizar el suelo. En el año 1886 los científicos Hellriegel y
Wilfarth identificaron la presencia de nódulos en las raíces de las plantas,
constituidos por bacterias denominadas rizobios. Estudios posteriores demostraron
que cada especie del genero Rhizobium presenta un rango de hospederos definido.
Con el desarrollo de herramientas moleculares, la clasificación de los rizobios ha
evolucionado hasta la identificación de seis géneros dentro del grupo Rhizobium :
Azorhizobium, Bradyrhizobium, Mesorhizobium, Allorhizobium, Sinorhizobium y
Rhizobium
3.3 Fijación de Nitrógeno en Asociaciones no simbióticas
Existe una gran cantidad de asociaciones entre organismos diazótrofos y plantas de
diferentes especies, en las que no se generan modificaciones morfológicas como la
formación de nódulos. En general estas asociaciones surgen como resultado del
establecimiento de los diazótrofos en ambientes ricos en nutrientes generados por
la presencia de las raíces. Diazótrofos endofíticos de raíz se han encontrado en
cultivos de caña de azúcar y de arroz inundado. Teniendo en cuenta la sensibilidad
de la nitrogenasa frente al oxígeno, las raíces de las plantas y los cultivos
inundados pueden constituir un ambiente favorable para la fijación (Sylvia, D M,
1998):.
16
3.4 Diazótrofos de Vida Libre
Los organismos diazótrofos de vida libre cumplen un papel muy importante en
ecosistemas en los cuales las fuentes de nitrógeno biodisponibles son limitadas.
Estos microorganismos llevan a cabo la incorporación del N2 en amonio al suelo
independientemente de la presencia de hospederos específicos como ocurre en la
fijación simbiótica. Los organismos diazótrofos no simbióticos presentan una gran
diversidad fisiológica que les permite ocupar prácticamente cualquier nicho
ecológico, aportando nitrógeno fijado para su asimilación por parte del resto de
organismos no fijadores. Se han encontrado diazótrofos aerobios, microaerófilos y
anaerobios, al igual que heterótrofos, quimioautótrofos y fotoautótrofos.
Factores que influencian el proceso de fijación de nitrógeno.
• Fuentes de energía
El proceso de fijación es altamente costoso en términos energéticos; se requieren
16 ATP por cada molécula de N2 reducida. Por esta razón la ausencia de una fuente
abundante de energía limita generalmente la fijación, especialmente en el suelo
donde los diazótrofos deben competir con todos los microorganismos edáficos por
los pocos nutrientes disponibles.
• Fuentes adicionales de nitrógeno
La eficiencia a la cual se asimila el amonio es casi el doble que la eficiencia en la
fijación de nitrógeno, por lo tanto en presencia de amonio u otras fuentes de
nitrógeno como nitrato o nitrógeno orgánico se inhibe la síntesis y la actividad de la
nitrogenasa.
• Oxígeno
La nitrogenasa es muy sensible ante el contacto con oxígeno molecular, siendo
destruida de forma irreversible. Cada grupo de organismos diazótrofos ha
17
desarrollado diferentes estrategias para proteger la nitrogenasa del oxígeno
dependiendo del ambiente en el cual se desarrolla, sin embargo este factor influye
fuertemente en la tasa de fijación de nitrógeno, por lo tanto las mayores tasas se
han reportado en suelos inundados donde la concentración de oxígeno es baja.
En general los mecanismos de protección ante el oxígeno consisten en (Sylvia, D
M, 1998):
Protección respiratoria:
Este mecanismo es empleado por organismos aerobios en los cuales las altas tasas
respiratorias evitan el contacto entre el oxígeno y la nitrogenasa. Sin embargo,
como consecuencia los microorganismos consumen una gran cantidad de sustrato y
el crecimiento resulta muy ineficiente en términos del carbono consumido.
Polisacáridos extracelulares:
Otra estrategia empleada por diazótrofos aerobios es la producción de polisacáridos
extracelulares que funcionan como barreras para el paso del oxígeno. La eficiencia
de este mecanismo ha sido cuestionada pues la barrera de polisacáridos
funcionaría también como barrera para el nitrógeno gaseoso.
Protección conformacional:
Este mecanismo consiste en un cambio conformacional de la nitrogenasa a una
forma temporalmente inactiva, gracias a su unión con la proteína Fe2S2 en
presencia de oxígeno. Cuando las condiciones son adecuadas la nitrogenasa
recupera su conFiguración inicial y continúa el proceso de fijación.
Producción de células especializadas:
18
Diazótrofos fotosintéticos como las cianobacterias presentan células especializadas
con paredes aislantes llamadas heterocistos, en los cuales se ubica la nitrogenasa
para evitar el contacto con el oxígeno generado por la fotosíntesis.
Separación temporal o espacial del proceso de fijación de nitrógeno y fotosíntesis:
Las cianobacterias que no forman heterocistos separan temporalmente la fijación de
nitrógeno de la fotosíntesis, fijando en los períodos de oscuridad. Por otro lado, se
pueden formar agregados celulares que propician la generación de espacios
microaerofílicos donde se puede proteger la nitrogenasa.
3.5 Nitrogenasas Alternativas
En el año 1980 se descubrió un organismo (Azotobacter chroococcum) capaz de
fijar N2 en ausencia de molibdeno, entonces se hizo evidente la posibilidad de que
otros metales formaran el cluster de la dinitrogenasa. En el caso de A.
chroococcum el molibdeno es reemplazado por vanadio en la síntesis de la
dinitrogenasa, formando una proteína hexamérica. Mas tarde se encontró otra
nitrogenasa alternativa en Azotobacter vinelandii, la cual se sintetiza en ausencia de
vanadio y molibdeno, y los clusters metálicos se componen únicamente de hierro. Al
igual que en la dinitrogenasa sintetizada con vanadio, ésta también forma un
hexámero en vez de un tetrámero como en el caso tradicional.
A pesar de la variación respecto al metal que conforma la enzima dinitrogenasa,
todas las nitrogenasas descritas hasta el momento están compuestas por un
complejo entre dinitrogenasa y dinitrogenasa reductasa, sin embargo los genes
codifican para cada una de las tres nitrogenasa son diferentes (Tabla 3).
19
Tabla 3. Nitrogenasas alternativas, clusters metálicos y genes asociados. Tomado de Sylvia et al. 1998.
Clusters Metálicos Subunidades Genes
Nitrogenasa Convencional Mo – Fe Tetrámero nifH, nifD, nifK
Nitrogenasa Alternativa 1 V – Fe Hexámero vnfH, vnfD, vnfG,
Nitrogenasa Alternativa 1 Fe – Fe Hexámero anfH, anfD, anfG,
4. MÉTODOS PARA ESTUDIAR LA DIVERSIDAD MICROBIANA
Teniendo en cuenta que menos del 99% de los microorganismos que habitan el
suelo son cultivables en el laboratorio, actualmente se emplean estrategias cultivo
independientes basadas en técnicas moleculares para estudiar los microorganismos
presentes en el ambiente. El gen que codifica para la subunidad menor del
ribosoma bacteriano, 16S rRNA es el marcador molecular más utilizado para
estudiar la diversidad, complejidad y dinámica de las comunidades microbianas en
general y constituye la más amplia base de datos de secuencias reportadas (Moyer,
C L, et al., 1994).
En general, la aplicación de técnicas independientes de cultivo para el estudio de la
diversidad microbiana parte de la amplificación de ADN empleando diferentes
procedimientos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), seguidos por
diferentes metodologías para analizar los fragmentos amplificados. Algunas de las
estrategias moleculares más empleadas para el estudio de diversidad microbiana
son:
4.1 Polimorfismos de longitud en fragmentos de restricción (RFLP)
Esta técnica se basa en detectar los polimorfismos entre secuencias de ADN
mediante la digestión con enzimas de restricción. A partir de este procedimiento se
20
generan fragmentos de diferente longitud que se evidencian mediante patrones de
bandeo en un gel de agarosa. Para el análisis de diversidad microbiana en suelos,
por lo general se lleva a cabo la amplificación de una región blanco y el producto
amplificado es digerido por endonucleasas de restricción para luego identificar
diferentes patrones de bandeo.
Polimorfismos de longitud en fragmentos de restricción terminales (T-RFLP)
Esta estrategia constituye una modificación de los RFLPs con el fin de simplificar los
patrones de bandeo obtenidos. En este caso la PCR del gen blanco se lleva a cabo
empleado uno de los iniciadores marcado con fluorescencia, por lo tanto en el
patrón de bandeo sólo se visualiza el fragmento terminal del amplicon. La
abundancia y longitud de cada fragmento es determinado generalmente mediante
un secuenciador.
• Electroforesis en geles de gradiente denaturante (DGGE)
La técnica de DGGE permite separar fragmentos de igual longitud y diferente
composición de bases en geles de poliacrilamida que contienen un gradiente lineal
creciente de concentración de agentes denaturantes como urea y formamida. A
medida que los fragmentos de DNA migran en el gel alcanzan mayores niveles de
agentes denaturantes. Dependiendo de la composición de específica de cada
secuencia éstas sufren una transición estructural que disminuye casi por completo
su movilidad electroforética en un punto determinado del gel. Con el fin de
estabilizar el comportamiento de los fragmentos de ADN y evitar su completa
denaturación, se incorpora un fragmento de aproximadamente 30 pb rico en
guanina-citosina en el extremo 5´ de uno de los iniciadores. Mediante esta
metodología se puede detectar la riqueza de haplotipos en una muestra
determinada, pues cada una de las bandas obtenidas corresponde a un genotipo
diferente.
• Construcción de Librerías y Análisis de Secuencias
21
La construcción de librerías consiste en generar una colección de clones que
contienen un fragmento de un gen amplificado por PCR. El análisis y la
comparación de estas secuencias nucleotídicas, a diferencia de los métodos
mencionados antes, permite no sólo identificar sino clasificar y establecer relaciones
filogenéticas entre organismos. De la misma manera, constituye una herramienta
muy poderosa, mediante la cual se pueden detectar niveles de variabilidad con una
alta resolución.
Mediante estos métodos moleculares es posible también analizar genes funcionales
con el fin de estudiar procesos naturales como la denitrificación, nitrificación y
fijación biológica del nitrógeno.
5. Estimación de la Diversidad de Organismos Diazótrofos
Teniendo en cuenta que los organismos diazótrofos constituyen un grupo muy
diverso fisiológicamente, los métodos convencionales para caracterizar poblaciones
microbianas del suelo, basados en técnicas cultivo dependiente presentan
limitaciones para estimar la diversidad de fijadores de nitrógeno.
El estudio de las comunidades naturales de diazótrofos mediante técnicas
independientes de cultivo se fundamenta en el seguimiento del gen que codifica
para la dinitrogenasa reductasa (nifH), el cual está presente en todos los
organismos diazótrofos que poseen el complejo nitrogenasa convencional (Fe-Mo).
El complejo enzimático nitrogenasa es altamente conservado evolutivamente a nivel
de secuencia proteica y el gen nifH es el gen estructural más conservado dentro del
complejo, por lo tanto es considerado un marcador molecular ideal para identificar
grupos de organismos diazótrofos en la naturaleza (Deslippe, J R y Egger, K N, ,
Zehr, J P, et al.).
Los genes que codifican para la nitrogenasa se encuentran dispersos a lo largo de
diversos clados en los dominios Bacteria y Archaea, por lo tanto se cree que
presentan un origen ancestral o que se pudieron haber dispersado por mecanismos
22
de transferencia horizontal. Sin embargo, algunas investigaciones han encontrado
una alta correlación entre las relaciones filogenéticas establecidas mediante el gen
ribosomal 16S y el gen nifH, dando soporte al uso de este marcador como una
herramienta para el establecimiento de filogenias. Adicionalmente se ha
evidenciado que cada linaje, presenta diferentes tasas de evolución. De esta
manera, los árboles filogenéticos para el gen ribosomal muestran una menor
distancia filogenética entre sus ramas, comparada con las distancias obtenidas a
partir de topologías para el gen nifH, lo que sugiere que el gen para 16S rRNA es el
más conservado entre los dos.
A partir del alineamiento de alrededor de 1500 secuencias reportadas en GeneBank
del NCBI, que codifican para la enzima dinitrogenasa reductasa incluyendo las
secuencias que codifican para las dinitrogenasa altenativas, se ha establecido la
filogenia del gen nifH (Zehr, J P, et al.), en la cual se han identificado 4 grupos
principales denominados Cluster I-IV que consisten básicamente en (Figura 7):
• Cluster I: Agrupa nitrogenasas convencionales de eubacterias, Nif (Mo) y algunas
nitrogenasas alternativas Vnf (V).
• Cluster II: Consiste en nitrogenasas alternativas Anf (Fe) de A. vinelandii y Clostridium pasteurianum y algunas secuencias de archaeas matanógenas.
• Cluster III: Grupo muy diverso de nitrogenasas convencionales de organismos distantes
f ilogenéticamente, la mayor ía anaerobios estrictos.
• Cluster IV: Conjunto de secuencias altamente divergentes similares a Nif de archaeas y
relacionados de manera distante con genes clorofila reductasa, probablemente
nitrogenasas no funcionales.
23
Figura 7. Distribución filogenética de nifH. Clusters básicos I-IV. Tomado de Zerh, 2003.
El gen nifH ha sido empleado ampliamente como marcador molecular para evaluar
la presencia y composición de las comunidades fijadoras de nitrógeno en diversos
ecosistemas naturales incluyendo: ambientes marinos, estuarios, manglares, suelos
cultivados, suelos de bosques, pantanos, intestinos de termitas, etc., (Ohkuma, M,
et al., , Piceno, Y M y Lovell, C R, , Poly, F, et al., , Shaffer, B T, et al., , Zehr, J P, et
al.), los cuales han reportado una gran diversidad genética presente en las
comunidades de diazótrofos.
El análisis de secuencias del gen nifH ha sido reportado como un método práctico y
preciso para clasificar e identificar organismos diazótrofos no cultivables (Widmer,
F, et al.). Además, la base de datos de secuencias para este gen crece rápidamente
y en la actualidad conforma una de las bases de secuencias no ribosomales más
documentadas.
La estimación de la diversidad genética de las comunidades de microorganismos
diazótrofos basada en análisis filogenéticos de nifH, ha reflejado que existen
24
diferentes patrones de distribución de filotipos entre diferentes ecosistemas y se ha
sugerido que la distribución de organismos fijadores de nitrógeno no es aleatoria y
se puede predecir con base en las características del ambiente (Zehr, J P, et al.,
2003).
Varios estudios han evaluado la influencia de patrones ecológicos en la distribución
de organismos diazótrofos. Poly y colaboradores (2001) encontraron que la
composición de especies de diazótrofos varía bajo diferentes tipos de suelo y
proponen que la estructura genética de nifH es el resultado de la adaptación de los
organismos ante ecosistemas que presentan condiciones ambientales estables o
variables. Por otro lado, Shaffer y colaboradores 2000 demostraron que la
comunidad de diazótrofos varía entre el suelo de los bosques y el suelo en los
claros de bosque adyacentes generados por procesos de tala. Sin embargo, es
necesario realizar una mayor cantidad de estudios para poder establecer cómo se
distribuyen los organismos diazótrofos a lo largo de diferentes ecosistemas y que
factores ambientales determinan su abundancia y diversidad.
25
III. OBJETIVOS
1. OBJETIVO GENERAL
Determinar la diversidad y distribución genética de organismos diazótrofos bajo
tres ecosistemas contrastantes en el sur del Trapecio Amazónico Colombiano.
2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Amplificación del gen nifH, a partir del ADN comunitario de las muestras de
suelo colectadas.
- Construir una librería de genes nifH para cada uno de los ecosistemas
estudiados.
- Realizar un análisis filogenético de las secuencias obtenidas.
- Analizar cómo se relaciona la distribución y diversidad de filotipos
encontrados, con los diferentes factores ambientales de cada sitio de
muestreo.
26
IV. MATERIALES Y MÉTODOS
1. Fase de Campo
1.1 Ubicación de sitios de muestreo
Las muestras de suelo procesadas fueron tomadas en el mes de Julio del año 2006
por investigadores de la Corporación Corpogen en conjunto con el Instituto SINCHI
en el sur del Trapecio Amazónico Colombiano (Figura 8).
Figura 8. Localización de sitios de muestreo.
Con el fin de comparar la diversidad de bacterias diazótrofas bajo diferentes suelos
en ecosistemas contrastantes, se colectaron muestras bajo ecosistemas
intervenidos y no intervenidos de la región. Los ambientes poco intervenidos
estudiados fueron parcelas de bosque primario maduro y los ecosistemas
intervenidos fueron sistemas de cultivo tradicionales de la región, conocidos como
chagras, y pastizales empleados para ganadería (Figura 9). Para cada uno de los
sistemas evaluados se colectaron muestras de suelo bajo
27
dos paisajes fisiográficos diferentes: terrenos no inundables (terrazas) e inundables
(llanura aluvial o várzea).
A.
C.
Figura 9. Ecosistemas estudiados: A. Bosque maduro ; B. Chagra; C. Pastizal
1.2 Estrategia de Muestreo
El muestreo se realizó siguiendo un diseño sistemático (Corredor, P, 2000) con
tres réplicas por cada cobertura (chagra, bosque y pastizal) y paisaje evaluado
(terraza y várzea). Para cada réplica se delimitó una parcela de 1ha donde se
ubicó una diagonal y se demarcaron seis puntos de muestreo igualmente
espaciados entre si (20m). Perpendicularmente a la diagonal teniendo como
referencia estos puntos, se tomaron cinco submuestras de 100gr
aproximadamente a una distancia de 5m del punto de referencia, conformando
una muestra compuesta de 500gr (Figura 10). Las muestras se tomaron con
ayuda de un barreno, a una profundidad de 0-20cm.
B.
28
Figura 10. Descripción de la estrategia de muestreo.
Con el fin de reducir el número de unidades experimentales (UE) para trabajar en el
laboratorio, se unificaron en dos grupos los seis puntos muestreados para
conformar dos muestras compuestas por cada una de las replicas.
Figura 11. Esquema muestreo al interior de cada UE
El material recolectado se conservó y se transportó en bolsas plásticas a una
temperatura de 4ºC hasta los laboratorios de la Corporación Corpogen donde se
almacenaron 20 gr de cada muestra a -70ºC para su posterior procesamiento.
Los análisis fisicoquímicos fueron realizados por el Instituto Geografico Agustin
Codazi (IGAC), donde se enviaron 500gr de cada muestra para evaluar la
granulometría, clase textural y parámetros químicos como: pH, fosforo disponible,
capacidad de intercambio cationico (CIC) y bases intercambiables (calcio,
magnesio, potasio y sodio).
100m
100m 20m
5m
29
Adicionalmente, para cada una de las parcelas delimitadas se registró en campo la
siguiente información:
• Ubicación según GPS.
• Edad de la cobertura (ecosistemas intervenidos).
• Espesor de la cobertura orgánica.
En resumen, se tomaron muestras bajo tres coberturas y dos paisajes diferentes,
cada uno con tres réplicas, es decir 18 UE. De cada unidad experimental se
tomaron 2 muestras, por lo tanto en el laboratorio se procesaron un total de 36
muestras (Tabla 4). A cada muestra se le asignó un código de identificación, con el
que se describió el tipo de cobertura, el tipo de paisaje fisiográfico, el número de
réplica y las muestras compuestas que reunían los 6 puntos de observación:
- Primero: Identificación del tipo de cobertura. CH- Chagra; B- Bosque;
P- Pastizal
- Segundo: Paisaje fisiográfico. T- Terraza; V- Várzea
- Tercero: Número de replica. R1 ; R2 ; R3
- Cuarto: Muestra compuesta. 1 ; 2
30
Tabla 4. Resumen del muestreo realizado en suelos bajo diferentes coberturas en el Sur del Trapecio Amazónico
COBER- TURA
PAISAJE UBICACIÓN REPLICA CODIFICACION EDAD (años) Horizonte o(cm.)
TOTAL
CH-T-R1-M1 1 3 1
CH-T-R1-M2 1 3
CH-T-R2-M1 2 3 2
CH-T-R2-M2 2 3
CH-T-R3-M1 2 2
Terraza Vía Leticia-Tarapacá (S04°7'1W69°57'10")
3 CH-T-R3-M2 2 2
CH-V-R1-M1 2 3 1
CH-V-R1-M2 2 3
CH-V-R2-M1 6 2 2
CH-V-R2-M2 6 2
CH-V-R3-M1 7 3
Chag
Várzea Comunidad de San Martín de A(S03°46'45,8", W70°18'07,8")
3 CH-V-R3-M2 7 3
12
B-T-R1-M1 - 3 1
B-T-R1-M2 - 3
B-T-R2-M1 - 3 2
B-T-R2-M2 - 3
B-T-R3-M1 - 3.5
Terraza Pacela Permanente Sinchi- PaAmacayacu
(S3°48'22.297", W70°16'5.601
3 B-T-R3-M2 - 3.5
B-V-R1-M1 - 5 1
B-V-R1-M2 - 5
B-V-R2-M1 - 5 2
B-V-R2-M2 - 5
B-V-R3-M1 - 5
Bosque
Várzea
Comunidad de San Martín de A(S03°46'45,8",
W70°18'07,8")
3 B-V-R3-M2 - 5
12
P-T-R1-M1 28 0 1
P-T-R1-M2 28 0
P-T-R2-M1 28 0 2
P-T-R2-M2 28 0
P-T-R3-M1 28 0
Terraza
3 P-T-R3-M2 28 0
P-V-R1-M1 28 3 1
P-V-R1-M2 28 3
P-V-R2-M1 28 0 2
P-V-R2-M2 28 0
P-V-R3-M1 28 0
Pastizal
Várzea
Finca Villa Claudia e Isla Kore
(S03º58'54.8'',
W70º0.9'41'') Cercanía al resguardo de San
(S03º57'38.3'',
W70º0.9'59.5'')
3 P-V-R3-M2 28 0
12
31
2. Fase de Laboratorio
2.1 Extracción de ADN comunitario
La aplicación de técnicas independientes de cultivo para el estudio de la diversidad
de microorganismos del suelo, requiere como paso inicial la extracción de ADN total
de suelo. La extracción de ADN comunitario de cada uno de los suelos se llevó a
cabo partiendo de 0.5gr de muestra siguiendo las recomendaciones del kit
comercial UltraClean Soil DNA Isolation Kit (MO BIO Laboratorios, Inc.). El protocolo
emplea una combinación entre lisis química y lisis mecánica, mediante SDS
(dodecyl sulfato de sodio) y microesferas de zirconio/sílica con la ayuda de un
homogenizador (bed beater, tipo BX-4 Bio Spec Products). Los ácidos nucleicos son
retenidos en una membrana de silica y posteriormente se resuspenden con un
buffer de elución (Tris10mM).
2.2 Amplificación Selectiva del gen nifH
A partir del ADN total extraído directamente del suelo, se realizó la amplificación por
PCR del gen ribosomal 16S empleando los iniciadores para bacteria 27F (5´-
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3´) y el universal 1492R (5´-
GGTTACCTTGTTACGACTT-3´) reportados por (DeLong, E F, et al., 1989,
Giovannoni, S J, et al., 1988). Este procedimiento se realizó con el fin de tener un
control para descartar la presencia de restos de ácidos húmicos u otros
contaminantes que pudedan inhibir la PCR y posteriormente reportar falsos
negativos respecto a la presencia del gen nifH.
Posteriormente se llevó a cabo la amplificación del gen nifH, mediante una PCR
anidada empleando iniciadores universales y siguiendo las condiciones reportadas
por Widmer et al. (1999) (Tabla 5). Debido a las considerables diferencias
filogenéticas entre los organismos fijadores de nitrógeno, los iniciadores universales
para amplificar nifH requieren un alto grado de degeneramiento en la secuencia de
32
nucleótidos y son diseñados sobre una región que codifica para una secuencia
altamente conservada de aminoácidos. (Figura 12).
Figura 12. Esquema de los iniciadores empleados para la amplificación de nifH. Tomado de:
Burgman et al. 2004.
Tabla 5. Oligonucleótidos para la amplif icación de nifH.
La primera amplificación, a partir del ADN comunitario, se realizó bajo las siguientes
condiciones: 5 minutos de denaturación inicial, seguida de 40 ciclos con
denaturación a 94ºC durante 11 segundos y a 92ºC por 30segundos, anillaje a 48ºC
por 8 segundos seguido de 30 segundos a 50ºC y extensión por 20 segundos a
72ºC y una elongación final a 72ºC durante 10 minutos. La PCR anidada se realizó
bajo las mismas condiciones, pero sólo por 35 ciclos. Las condiciones de la PCR se
muestran en la Tabla 6.
Iniciador Secuencia
forA 5’-GCIWTITAYGGNAARGGNGG -3’
forB 5’-GGITGTGAYCCNAAVGCNGA-3’
rev 5’-GCRTAIABNGCCATCATYTC-3’
R, A/G; Y, C/T; W, A/T; V, A/C/G; B, C/G/T; y N, A/C/G/T, Inosine (I).
33
Tabla 6. Condiciones de PCR nifH.
Primera PCR PCR Anidada Reactivos Concentración Final Concentración Final
Buffer 1x 1x
MgCl2 1,5mM 1,5mM
dNTPs 200uM 200uM
ForA 1uM -
ForB - 0.5uM
Rev 1uM 0,5uM
Taq polimerasa 0,025U/uL 0,025U/uL
BSA 5 mg/ml 0,3mg/ml
DNA 2.5uL 2.5uL
H20 -- --
Volumen final 50ul 50ul
Los productos amplificados fueron observados en geles de agarosa al 1% teñidos
con bromuro de etidio, para de confirmar la obtención de una sola banda del tamaño
esperado (371pb).
2.3 Clonación y secuenciación de los fragmentos del gen nifH.
Los productos de la PCR anidada para cada una de las muestras de suelo
evaluadas fueron clonados empleando el kit de clonación TOPO TA. Cloning kit
(Invitrogen), siguiendo las recomendaciones del fabricante, y transformados en
células de Escherichia coli DH5α químicamente competentes. Los clones fueron
recuperados en LB con antibiótico y X-Gal.
Después de verificar la correcta inserción del producto de PCR en el vector pCR-2.1
TOPO, se seleccionaron aleatoriamente 10 clones de cada muestra para ser
secuenciados. La secuenciación se llevo a acabo mediante la técnica de extensión
34
sencilla (Single extensión) usando los iniciadores universales M13, en los
laboratorios High-Throughput Genomics Unit, University of Washington, Seattle.
2.4 Análisis de Secuencias
Las secuencias fueron analizadas mediante una línea de flujo “pipeline” diseñada
usando el programa EGene (Durham, A M, et al., 2005), esta línea de trabajo
permite enlazar diferentes programas bioinformáticos para el análisis en serie de un
gran número de secuencias. La línea de trabajo es la ilustrada en la Figura 13 y
consiste básicamente en:
Figura 13. Línea de trabajo empleada para el análisis de secuencias.
1. Lectura de los cromatogramas y adjudicación de valores de calidad usando el
programa phred (Ewing, B, et al., 1998)
2. Enmascaramiento de la secuencia del vector TOPO mediante el programa
Crossmatch (Ewing, B, et al., 1998)
3. Filtro de calidad donde el 80% de las secuencias que tengan un valor de
calidad superior a 15 son consideradas válidas.
4. Corte de secuencias terminales de baja calidad o que corresponden a
secuencias de vectores.
35
5. Secuencias que después del paso del corte presentan una longitud menor a
200pb son descartadas, teniendo en cuenta que el fragmento de interés tiene
una longitud de 370pb aproximadamente.
6. Ensamblaje de secuencias válidas mediante la aplicación Phrap (Ewing, B, et
al., 1998). Los parámetros de ensamblaje fueron ajustados con el fin de tener
una astringencia tal, que sólo se permitiera el ensamblaje de secuencias
idénticas.
Las salidas de la línea de flujo incluyen reportes gráficos de los resultados de los
diferentes filtros (calidad, tamaño y enmascaramiento de vectores) al igual que
archivos Fasta con las secuencias validas inválidas y los contigs resultantes. Los
ensamblajes fueron verificados manualmente para confirmar la agrupación
únicamente entre de los pares de secuencias (Forward y Reverse del mismo clon)
en cada contig.
2.5 Análisis Filogenético
Para determinar la identidad de las secuencias obtenidas se realizó un BlastN
(Altschul, S F, et al., 1997) contra todas las secuencias de nucleótidos codificantes
para nifH disponibles en la base de datos de GeneBank del NCBI.
Las secuencias de la base de datos que dieron similitudes mayores al 90% con las
secuencias obtenidas, se usaron junto con otras secuencias de nifH de organismos
conocidos y todas las secuencias obtenidas para realizar un alineamiento múltiple
en el ClustalW (Thompson, J D, et al., 1994). El alineamiento obtenido fue revisado
manualmente en el MacClade (Maddison, W P y Maddison, D R, 1989) para
posteriormente construir un árbol filogenético. El árbol fue generado bajo el criterio
de Neighbour Joining con 100 replicas mediante el programa PAUP (Version 4.0)
Adicionalmente, se agruparon las secuencias según el ecosistema de origen y se
calcularon las distancias filogenéticas entre y dentro de los grupos, utilizando el
programa MEGA Version 4.0 (Tamura, K, et al., 2007) según el modelo de Kimura.
36
2.6 Estimación de la diversidad genética de nifH en los diferentes ecosistemas
Para estimar la riqueza de genes nifH de cada sitio de muestreo se realizó un
análisis de rarefacción mediante el software Analytic Rarefaction (Holland, S, 2003).
Por cada muestra y por cada ecosistema se generaron curvas de acumulación de la
riqueza de filotipos contra el esfuerzo de muestreo o número de clones
secuenciados. La riqueza encontrada también se estimó mediante la siguiente
fórmula:
Riqueza = (F-1) / log N
Donde F corresponde al número de filotipos detectado y N al tamaño de la muestra.
Los valores de diversidad para cada sitio muestreo se calcularon empleando el
índice de diversidad de Shannon. Este índice tiene en cuenta el número y la
frecuencia de cada filotipo o especie y se define de la siguiente manera:
HShannon = -∑lnpi
Donde pi es la frecuencia del elemento i.
Dado que el tamaño de muestra para cada sitio es variable se aplicó la siguiente
corrección:
HShannon/corregido = - ∑i(pilnp i)/lnN
Donde N es el tamaño de la muestra.
2.7 Pruebas de Correlación y Análisis de Estadístico
Mediante el software estadístico XLSTAT se realizaron análisis de varianza
(ANOVA) para encontrar diferencias significativas entre las medias de los valores de
37
diversidad entre ecosistemas. Esta herramienta se utilizó también para establecer la
correlación entre los factores ambientales y la distribución y diversidad de filotipos
de cada muestra mediante las pruebas de correlación de Mantel.
Por otro lado, se empleó el software SPSS (Version 14) para realizar análisis de
componentes principales (PCA) y pruebas de escalamiento multidimensional. Se
aplicaron PCAs con el fin de reducir el número de variables obtenidas por los
análisis fisicoquímicos y agrupar o separar los sitios de muestreo según estas
características. Las pruebas de escalamiento multidimensional se realizaron para
generar gráficos en dos dimensiones de la distancia entre las muestras según sus
valores de diversidad, composición de filotipos y distancias filogenéticas.
V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
1. Extracción de ADN y Amplificación Selectiva del gen nifH
A partir de las muestras de suelo recolectadas se realizó la extracción de ADN
comunitario. Para verificar la obtención de ADN genómico a partir de cada una de
las muestras, los productos de extracción fueron observados mediante
electroforesis (Figura 14).
1 2 3 4 5 6
Figura 14. Extracción de ADN comunitario de suelos. 1. Chagra-Terraza; 2: Chagra-Várzea; 3: Bosque-Terraza; 4: Bosque-Várzea; 5: Pastizal-Terraza; 6: Pastizal-Várzea.
38
Aun cuando no en todos los casos la concentración del ADN extraído permitió su
visualización en el gel, sí fue posible amplificar el gen 16S en todas las muestras
procesadas, lo cual confirma la presencia de ADN bacteriano y la ausencia de
sustancias inhibidoras de PCR .
Posteriormente, se determinó la presencia del gen nifH en todas muestras de suelo
estudiadas mediante su amplificación con los iniciadores universales y las
condiciones sugeridas por Widmer et al. (1999) (Figura 15).
PM C(+ ) C(-) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
PM 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 29 30 31 32 33 34 35 36
Figura 15. Amplificación del gen nifH de las 36 muestras de ADN extraído de los suelos en estudio. 1-6: Chagra-Terraza; 7-12: Chagra-Várzea; 13-18: Bosque-Terraza; 19-24: Bosque-Várzea; 25-30: Pastizal-Terraza; 31-36: Pastizal-Várzea. Control positivo (C+) Azotobacter vinelandii, Control negativo (-).
Con estos resultados se demuestra, mediante la aplicación de técnicas
independientes de cultivo, que en todos los ambientes evaluados se encuentran
organismos que potencialmente presentan la capacidad de fijar nitrógeno
atmosférico.
Teniendo en cuenta la enorme diversidad de microorganismos, tanto cultivables
como no cultivables, en los cuales se ha identificado la presencia del gen nifH, se
espera que los productos amplificados a partir de cada uno de los suelos reúnan
una colección de secuencias de nifH, con base en la cual se determinará la
diversidad y distribución genética del gen nifH en cada ecosistema mediante el
análisis de secuencias.
371 pb 786 pb
786 pb 371 pb
39
2. Clonación y Secuenciación de los fragmentos del gen nifH El producto de amplificación del gen nifH para cada una de las muestras fue
clonado en el vector pCR-TOPO y para verificar la correcta inserción del fragmento
de nifH se realizó una PCR con los iniciadores universales M13. Se consideraron
positivos los clones que presentaron una banda de aproximadamente 571pb (200pb
plasmido + 371bp amplificado de nifH) (Figura 16). Para cada uno de los productos
de la PCR de nifH amplificados a partir del ADN comunitario de cada suelo, se
recuperaron aproximadamente 20 clones positivos.
Figura 16. PCR con iniciadores M13 confirmando la inserción del fragmento de nifH en los clones obtenidos.
Aleatoriamente se tomaron 10 clones por cada sitio de muestreo para ser
secuenciados. En total se secuenciaron 360 clones por ambos sentidos, sin
embargo no todas secuencias presentaron una buena calidad por lo tanto no se
logró alcanzar el mismo número de clones secuenciados por cada sitio de muestreo
(Tabla 6). Se descartaron 31 secuencias debido a que mostraron muy baja calidad,
lo que imposibilitó la lectura precisa de la secuencia. Esta baja calidad se puede
deber a deficiencias en la concentración del producto amplificado del vector, a su
evaporación durante el transporte o a fallas durante el proceso de secuenciación.
Todas las secuencias aprobadas tuvieron un tamaño adecuado, en ningún caso se
secuenciaron quimeras ni artefactos.
3. Análisis de Secuencias y Análisis Filogenético
Las secuencias que pasaron todos los filtros de calidad de la línea de flujo de
trabajo empleada, fueron ensambladas y verificadas generando finalmente 329
contigs.
571 pb
40
Simultáneamente, se realizó una búsqueda en la base de datos GeneBank del
NCBI para identificar todas las secuencias reportadas de nifH, encontrando en total
10463 secuencias que fueron descargadas, para conformar una base de datos de
referencia para análisis posteriores.
Para cada uno de los contigs obtenido se realizó un Blast contra esta base de datos
y en todos los casos se encontraron homologías significativas con diferentes
secuencias de nifH. En general el porcentaje de similitud entre las secuencias
obtenidas y las secuencias reportadas para el gen nifH estuvo entre el 90% y 75%.
Las secuencias que presentaron un mayor nivel de similitud con las obtenidas en
este estudio, provienen de muestras ambientales de organismos no cultivables y no
identificados taxonómicamente. Estos resultados, resaltan la importancia de la
utilización de técnicas independientes de cultivo para el estudio de la diversidad de
bacterias fijadoras de nitrógeno, revelando la inmensa cantidad de organismos no
cultivables que se encuentran en el ambiente.
Con base en los resultados del Blast, se seleccionaron las secuencias que
mostraron una similitud mayor al 90%, encontrándose 11 secuencias en total, todas
ellas de bacterias no cultivables y clasificación taxonómica desconocida. Dado que
ninguna de las secuencias de referencias contaba con clasificación taxonómica
definida, se escogieron 16 secuencias de organismos conocidos de la base de
datos (2 de cada uno de los principales grupos taxonómicos). Todas estas
secuencias: contigs ensamblados, secuencias ambientales más similares y
secuencias de referencia de organismos conocidos, fueron alineadas . A partir del
alineamiento a nivel de nucleótidos se generó la siguiente topología (Figura 17):
41
Figura 17. Topología construida con base en Neigbour-Joining (100 réplicas) a partir de todos los clones secuenciados y algunas secuencias de referencia, triangulos agrupan más de 2 secuencias del mismo filotipo.
42
Las relaciones y agrupaciones que se pueden visualizar en el árbol muestran que
las secuencias provenientes de un mismo ecosistema no son agrupadas por sus
similitudes a nivel de nucleótidos, por lo tanto no es posible identificar clusters de
secuencias que se asocien con un ecosistema específico. Esto sugiere que la
diversidad genética del gen nifH en los diferentes ecosistemas es altamente variable
y que copias similares de este gen están distribuidas a lo largo de los diferentes
ecosistemas (Pastizal, Chagra, Bosque), independientemente de sus
características.
Teniendo en cuenta que el gen nifH ha sido reportado como posible marcador
filogenético (Zehr, J P, et al., 2003), dado que las relaciones filogenéticas
establecidas mediante este marcador, son en términos generales coherentes con la
clasificación de los organismos con base en el gen para 16S rRNA, se incluyeron en
el árbol varias secuencias reportadas de organismos cultivables con clasificación
taxonómica completa para evaluar la posibilidad de adjudicar géneros o especies a
las secuencias obtenidas. Se incluyeron secuencias de los principales phylum
bacterianos y se usó como grupo ajeno una secuencia de la misma región del gen
nifH proveniente de una Arquea.
Sin embargo, el árbol (Figura 17) no mostró agrupaciones entre las secuencias de
referencia según su clasificación taxonómica ya que en varios casos bajo una
misma rama se incluyeron secuencias de diferentes phylum. Muy pocas veces las
secuencias de organismos conocidos se agruparon con las secuencias del presente
estudio y en los casos en que comparten un mismo nodo, las politomías presentes y
las secuencias de diferentes organismos en el mismo nodo hicieron imposible la
asignación de una clasificación taxonómica a las secuencias. Zerh y colaboradores
(2003) anotan que el gen nifH es un gen funcional sujeto fácilmente a transferencia
horizontal y existen casos en los que se presentan múltiples copias dentro del
mismo organismo. Por esta razón es posible que las relaciones filogenéticas entre
secuencias de nifH no permitan obtener clasificaciones taxonómicas coherentes con
16S rRNA, tal como se observó en este caso.
43
Debido a que las secuencias de referencia no agruparon con las secuencias en
estudio, se incluyeron secuencias reportadas de muestras ambientales de cepas no
cultivables. Se puede observar, que éstas si agruparon dentro de clusters definidos
en el árbol lo que sugiere que la gran mayoría de las secuencias obtenidas son
comúnmente recuperadas de muestras ambientales pero distantes de las
secuencias de organismos cultivados. Este fenómeno se puede deber a la
predominancia de secuencias de organismos no cultivables en las muestras
ambientales, o a un sesgo en la amplificación de este tipo de secuencias por la
similitud en el sitio de anillaje de los iniciadores. En varios estudios (Poly, F, et al.,
2001, Zehr, J P, et al., 2003, Zhang, Y, et al., 2006) se ha reportado de la misma
forma que los filotipos extraídos de ambiente no son cercanamente relacionados a
cepas cultivables o caracterizadas y presentan una gran variabilidad. Así pues,
indican la posibilidad de que la mayoría de las bacterias que poseen el gen nifH,
posibles fijadoras de nitrógeno no son cultivables.
Al analizar el origen de las secuencias de organismos no cultivables incluidas en el
árbol, se encuentra que secuencias como la AF099798 (Widmer, F, et al., 1999) que
agrupa con secuencias aisladas a partir de chagras, fue aislada de suelos de
bosque (Dougles fir forest) en Oregon. Por otro lado, la AY829697 encontrada bajo
el suelo de un bosque tropical Venezolano, agrupa con una secuencia obtenida
también bajo el ecosistema de bosque. De la misma forma, la secuencia AJ313269
que agrupa con secuencias recuperadas de pastizales, proviene de la rizósfera de
la planta Molinia Coerulea, una gramínea común en suelos con baja disponibilidad
de nitrógeno (Hamelin, J, et al., 2002). Se puede apreciar entonces que aunque no
haya una segregación evidente de las relaciones filogenéticas entre secuencias de
cada tipo de ecosistema, algunas secuencias aisladas forman grupos pequeños que
implican un ecosistema común sin importar su ubicación geográfica.
Respecto a la discrepancia en las relaciones filogenéticas que presentaron las
secuencias de referencia, se consideró la posibilidad de que podía haber un sesgo
por el bajo número de secuencias seleccionadas y por esta razón los organismos
conocidos no agrupaban según su clasificación taxonómica. Para descartar esta
posibilidad, o en caso contrario elegir otras secuencias como referencia, se
44
descargaron 115 secuencias de nucleótidos de organismos con clasificación
taxonómica completa y se alineó la misma región analizada en las secuencias de
estudio para generar una topología bajo los mismos parámetros (Figura 18). En el
árbol se puede observar que aunque hay un grupo marcado que contiene
únicamente Cianobacterias (excepto por una Epsilon Proteobacteria), hay una gran
politomía que incluye la mayoría de las Proteobacterias con otros grupos
taxonómicos como los Firmicutes o Actinobacteria. Es interesante también que una
secuencia reportada como proveniente de K. pneumoniae (Gamma Proteobacteria)
aparenta estar cercanamente relacionada con bacterias del phylum Spirochaeta;
mientras otra Klebsiella sp. (M63691) se encuentra en la politomía donde están las
demás Proteobacterias, lo cual podría sugerir un posible evento de transferencia
horizontal en K. pneumoniae.
De la misma forma se consideró la posibilidad de que el fenómeno observado
resultara debido a un sesgo por el uso de codones, por lo tanto todas las
secuencias fueron traducidas a aminoácidos y alineadas nuevamente. La topología
generada se observa en la Figura 19. Este árbol, aunque no presenta el mismo
grupo de las cianobacterias si presenta muchas similitudes con el árbol generado
con ADN. La topología y relaciones mostradas en general son las mismas, sin
embargo se observa un menor grado de discriminación debido al mayor número de
politomías encontradas. Esto se explica debido a que al traducir a aminoácidos las
secuencias se hacen mucho más cortas y en este caso resultan secuencias de
aproximadamente 100 aminoácidos, lo cual disminuye considerablemente la
posibilidad de encontrar cambios entre las diferentes secuencias. De esta forma se
justificó la imposibilidad para dar una identidad taxonómica a las secuencias
obtenidas y se confirmaron los conflictos que presenta el análisis filogenético del
fragmento amplificado respecto a la identidad taxonómica basada en el gen 16S
rRNA.
45
Figura 18. Topología de secuencias nifH de referencia con base en nucleótidos.
46
Figura 19. Topología de secuencias nifH de referencia con base en aminoácidos.
47
Tabla 7. Matriz de distancia f ilogenética entre sitios de muestreo por el método Kimura dos parámetros.
Por otro lado, se calculó la distancia filogenética “entre” y “dentro” de los grupos de
secuencias obtenidas a partir de cada uno de los ecosistemas estudiados, usando
el método de Kimura de 2 parámetros que da mayor peso a las transiciones que a
las transversiones. Este método calcula la distancia entre todas las parejas de
secuencias analizadas para posteriormente sacar un promedio por grupo que
constituye la distancia “dentro” de los grupos. La distancia “entre” los grupos se
obtiene a partir de la diferencia entre las distancias promedio de cada uno de los
grupos. De la matriz (Tabla 7) se puede observar que todas las distancias entre los
grupos varían con valores entre 0,1672 y 0,4337 estando la gran mayoría en 0,3, lo
que muestra una gran homogeneidad a nivel de distancia filogenética entre los
diferentes grupos. Estos resultados afirman una vez más lo observado en el árbol
donde no hay claras agrupaciones por ecosistemas.
CHTR 1
CHTR2
CHTR3
CHVR1
CHVR2
CHVR3
BTR1
BTR2
BTR3
BVR1
BVR2
BVR3
PTR1
PTR2
PTR3
PVR1
PVR2
PVR3
CHTR1 0,00
CHTR2 0,33 0,00
CHTR3 0,39 0,38 0,00
CHVR1 0,37 0,34 0,39 0,00
CHVR2 0,36 0,35 0,34 0,37 0,00
CHVR3 0,35 0,22 0,39 0,37 0,34 0,00
BTR1 0,39 0,41 0,39 0,41 0,34 0,37 0,00
BTR2 0,35 0,30 0,40 0,38 0,35 0,32 0,34 0,00
BTR3 0,34 0,17 0,38 0,35 0,34 0,24 0,38 0,30 0,00
BVR1 0,36 0,36 0,37 0,38 0,34 0,36 0,37 0,36 0,34 0,00
BVR2 0,38 0,43 0,42 0,41 0,39 0,41 0,38 0,38 0,40 0,36 0,00
BVR3 0,37 0,37 0,40 0,40 0,38 0,37 0,37 0,36 0,36 0,36 0,34 0,00
PTR1 0,34 0,25 0,37 0,35 0,34 0,29 0,39 0,33 0,26 0,34 0,38 0,35 0,00
PTR2 0,38 0,35 0,39 0,37 0,36 0,36 0,39 0,37 0,35 0,38 0,41 0,40 0,36 0,00
PTR3 0,38 0,38 0,40 0,39 0,37 0,38 0,37 0,37 0,38 0,38 0,40 0,39 0,38 0,38 0,00
PVR1 0,42 0,42 0,42 0,43 0,40 0,40 0,36 0,37 0,40 0,41 0,40 0,39 0,41 0,41 0,40 0,00
PVR2 0,36 0,34 0,39 0,38 0,36 0,35 0,36 0,35 0,34 0,36 0,37 0,35 0,34 0,38 0,38 0,40 0,00
PVR3 0,39 0,40 0,41 0,41 0,39 0,39 0,37 0,37 0,39 0,39 0,39 0,39 0,39 0,40 0,39 0,38 0,38 0,00
48
4. Análisis de la Distribución de Secuencias nifH en los Ecosistemas Estudiados
Varios estudios han reportado diferencias en la distribución del gen nifH entre
diferentes tipos de hábitat o asociados con alteraciones en el ecosistema. Shaffer y
colaboradores (2000) analizaron los cambios en la composición del pool genético de
nifH en bosques y claros de bosque adyacentes generados por la tala de árboles
en Oregon. Mediante el análisis de patrones de restricción (RFLPs), reportaron la
pérdida de un pool de genes en los claros de bosques y sugieren que los procesos
de tala en estos ecosistemas alteran la comunidad de organismos fijadores de
nitrógeno disminuyendo su diversidad.
Un método a partir del cual es posible comparar la composición genética entre
diferentes lugares de muestreo, consiste en el Análisis de Componentes Principales
(PCA). Este procedimiento permite agrupar o separar sitios según el grado de
similitud entre ellos mediante gráficas en dos dimensiones llamadas mapas
factoriales. Un mapa factorial en el cual se grafica la estructura genética de una
comunidad, se realiza a partir de una matriz en la cual se plasma la presencia o
ausencia de cada uno de los filotipos encontrados en cada ecosistema. Esta matriz
arroja componentes principales (PC) que explican la mayor cantidad posible de la
variación detectada en el conjunto de datos, para luego graficarlos sobre un plano y
poder establecer relaciones de similitud entre las muestras.
Poly y colaboradores (2001), al igual que Zhang y colaboradores (2006), analizaron
la estructura genética de la comunidad de organismos diazótrofos en diferentes
ecosistemas, con base en los patrones de agrupamiento generados en un mapa
factorial por PCA (Figura 20). Los dos estudios encontraron diferencias en la
composición genética de la población entre algunos ecosistemas (grupo azul) y
también se evidenciaron semejanzas entre otros (grupo rojo). Según los análisis
que realizaron, no necesariamente los grupos más cercanos congregan los mismos
ecosistemas, sin embargo sí encontraron relaciones entre los grupos generados con
otros factores como el manejo del suelo y la altura del lugar.
49
Figura 20. PCA de la composición genética de nifH entre diferentes ecosistemas. Tomado de: A) Poly, et al. 2001; B) Zhang, et al 2006
En el presente estudio, se llevó a cabo el mismo análisis con base en PCA sobre la
distribución de los filotipos en los diferentes ecosistemas estudiados. No obstante,
las muestras son tan diferentes entre si, respecto a su composición en filotipos, que
la cantidad de variación explicada por los PC fue menor al 20% de la variación total.
Por esta razón fue necesario aplicar otro procedimiento denominado Prueba de
Escalamiento Multidimencional, para correlacionar sobre un plano los patrones
encontrados en cuanto a composición genética en los diferentes ecosistemas. Este
procedimiento funciona de la misma manera que el PCA, pero no asume que las
variables se correlacionan entre sí, entonces explica mediante la gráfica en dos
dimensiones una mayor cantidad de la variación total encontrada en la matriz.
Con base en la Prueba de Escalamiento Multidimencional (Figura 21) se demuestra,
al igual que en los estudios mencionados anteriormente, que los sitios de muestreo
no necesariamente se parecen más en su composición genética según el tipo de
hábitat. Es importante anotar, sin embargo, que los bosques son el ecosistema que
presentó una relación mas estrecha en cuanto a su estructura genética, es decir
que las muestras tomadas en los bosques comparten una mayor cantidad de
filotipos entre ellas. Por otro lado, las diferentes muestras tomadas en los
ecosistemas intervenidos (pastos y chagras) aparecen mucho más dispersas en el
plano, indicando una gran divergencia en cuanto a los filotipos que conforman la
comunidad de organismos diazótrofos en cada caso.
A) B)
50
Prueba de Escalamiento Multidimencional para:
COMPOSICIÓN GENÉTICA
Figura 21. Agrupación de los sitios de muestreo según su composición genética.
5. Estimación de la Diversidad Genética de nifH para cada Ecosistema
Con el propósito de analizar la diversidad genética de los ecosistemas estudiados
se determinó, con base en las secuencias obtenidas, el número de filotipos
encontrados. Para este caso, al igual que en la mayoría de los estudios sobre
diversidad microbiana con base en análisis de secuencias, se asumen como
iguales, y por tanto conforman un filotipo, las secuencias cuyo porcentaje de
similitud es igual o mayor al 97% (Crawford, J W, et al., 2005, Lozupone, C A y
Knight, R). Con base en este criterio se determinó la cantidad de filotipos
51
detectados en cada muestra, a partir de lo cual se estimó la diversidad y riqueza de
secuencias de nifH presente en cada uno de los sitios de muestreo. En total, a partir
de las 329 secuencias se identificaron 129 filotipos. Vale la pena resaltar, que la
gran mayoría de los filotipos agruparon secuencias provenientes del mismo
ecosistema, únicamente 9 filotipos fueron compuestos por secuencias de diferente
origen. Con base en este fenómeno es posible sugerir que existe un endemismo
local fuerte entre las secuencias de nifH, lo cual puede tener implicaciones
importantes en el ambiente. Se encontró también que un 67% de los filotipos,
estaban conformados por una única secuencia.
Con base en la estimación de la cantidad de filotipos diferentes y su abundancia en
cada ecosistema, se calculó la riqueza y diversidad en cada uno ellos. La riqueza de
un ecosistema se define como el número de especies diferentes en una comunidad,
o en este caso el número de filotipos diferentes (Burnett, J H, 2003). Sin embargo,
al momento de comparar valores de riqueza entre diferentes ecosistemas se debe
tener en cuenta el tamaño de muestra de cada uno para evitar sesgos en su
interpretación. Por esta razón, en el presente estudio se realizó un estimativo de
riqueza aplicando una corrección según la cantidad de clones secuenciados.
Por otro lado, la diversidad de cada ecosistema evaluado se calculó empleando el
índice de diversidad de Shannon. Este índice estima la cantidad de orden o
desorden presente en un sistema y determina qué tan difícil resulta predecir la
identidad del siguiente individuo colectado, o en este caso, el siguiente clon
secuenciado (Burnett, J H, 2003). El índice de Shannon tiene en cuenta el número y
la frecuencia de cada filotipo o especie en una comunidad, dado que para cada uno
de los sitios de muestreo se cuenta con un número de secuencias variable, se
empleó el índice de Shannon corregido para estimar la diversidad genética (Tabla
8).
52
Tabla 8. Numero de clones, f ilotipos y diversidad estimada en cada sit io de muestreo.
ECOSISTEMA TERRENO REPLICA Clones
Secuenciados
Riqueza de Filotipos H Shannon/correg
Chagra Terraza 1 16 11 0,284 Chagra Terraza 2 8 3 0,208 Chagra Terraza 3 31 11 0,181 Chagra Várzea 1 23 14 0,255 Chagra Várzea 2 20 14 0,271 Chagra Várzea 3 17 5 0,124 Bosque Terraza 1 18 6 0,182 Bosque Terraza 2 15 6 0,212 Bosque Terraza 3 16 8 0,251 Bosque Várzea 1 16 7 0,189 Bosque Várzea 2 20 7 0,179 Bosque Várzea 3 22 7 0,132 Pastizal Terraza 1 18 14 0,306 Pastizal Terraza 2 18 8 0,230 Pastizal Terraza 3 19 14 0,289 Pastizal Várzea 1 19 11 0,263 Pastizal Várzea 2 18 13 0,283 Pastizal Várzea 3 15 12 0,327
Total 329
De acuerdo con el índice de Shannon corregido por el tamaño de muestra, los
sitios con mayor diversidad de filotipos nifH se encuentran bajo el ecosistema
pastizal, seguido por las chagras y por último los bosques.
Otra manera para realizar comparaciones sobre la riqueza entre sitios que
presentan un tamaño de muestra variable es por medio de curvas de rarefacción.
Estas curvas grafican la riqueza en términos de número de filotipos observado,
contra esfuerzo de muestreo o tamaño de muestra. Conceptualmente, al realizar un
muestreo intensivo, todas las curvas de rarefacción deben alcanzar una asíntota
que equivale al número total de especies o filotipos en una comunidad, lo cual
corresponde a su riqueza total de especies (Kemp, P F y Aller, J Y, 2004).
53
Figura 22. Curva de rarefacción de filotipos observados en cada sitio de muestreo. La flecha indica el punto de comparación entre muestras (menor esfuerzo de muestreo). B: Bosque, P: Pastizal, CH: Chagra, T: Terraza, V: Várzea y R:Replica
La Figura 22 muestra las curvas de rarefacción obtenidas para cada uno de los
sitios de muestreo, evidentemente el esfuerzo de muestreo por sitio no fue
suficiente para alcanzar a determinar la riqueza total de filotipos y por el contrario la
mayoría de la curvas muestran una tendencia lineal. Adicionalmente, el número de
clones secuenciado para algunas muestras fue demasiado reducido, por lo tanto el
punto de comparación entre ellas se encuentra sobre un tamaño de muestra muy
pequeño. Sin embargo, a pesar de que no se alcance a estimar la riqueza total para
cada sitio de muestreo, a partir de estos análisis es posible comparar la riqueza
entre sitios según las tendencias que se observan en cada muestra. Tomando como
referencia el punto donde se ubica el menor esfuerzo de muestreo, es posible
estimar la riqueza potencial de cada sitio.
Dados los resultados obtenidos por las curvas para cada sitio de muestreo, se
realizó un segundo análisis de rarefacción considerando todos los clones
secuenciados por ecosistema (Figura 23). Al aumentar el tamaño de muestra, se
observa como las curvas se acercan un poco más a su punto asintótico, sin
embargo las tendencias en cuanto a la magnitud de la riqueza por ecosistema se
mantienen relativamente estables. Es decir, los ecosistemas de pastizales se
Curvas de Rarefacción
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 5 10 15 20 25
Esfuerzo de Muestreo (Numero de clones secuenciados)
Filo
tipos
esp
erad
os
B-T-R1B-T-R2
B-T-R3B-V-R1B-V-R2
B-V-R3P-T-R1P-T-R2
P-T-R3P-V-R1P-V-R2
P-V-R3CH-T-R2CH-T-R3CH-T-R1
CH-V-R1CH-V-R2CH-V-R3
54
mantienen como los de mayor, riqueza, seguidos por las chagras y finalmente los
bosques.
Esta gráfica demuestra que en ninguno de los casos se alcanzó a determinar la
riqueza total de filotipos de nifH por ecosistema. Estos resultados son comunes en
estudios sobre diversidad microbiana, en los cuales las curvas de rarefacción
presentan en su gran mayoría tendencias lineales debido a la gran diversidad que
caracteriza estas comunidades y en general el pequeño tamaño de muestra con el
que es posible trabajar (Hughes, J B, et al., 2001). Por ejemplo (Borneman, J y
Triplett, E W), realizó un estudio sobre la diversidad bacteriana en suelos del este
de la amazonía, con base en el gen para 16S rRNA, y cada uno de los individuos
que identificó fue diferente del otro, revelando que dada la inmensa diversidad de
microorganismos presentes bajo estos ecosistemas se requiere un tamaño de
muestra grande para poder determinar la riqueza su total.
Curvas de Rarefacción
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 10 20 30 40 50 60
Esfuerzo de Mue streo (Número de clones se cuenciados)
Filo
tipos
Obs
erva
dos CH-T
CH-V
B-T
B-V
P-T
P-V
Figura 23. Curvas de rarefacción por ecosistema. La flecha indica el punto de comparación entre muestras (menor esfuerzo de muestreo). B: Bosque, P: Pastizal, CH: Chagra, T: Terraza, y V: Várzea.
Teniendo en cuenta que la diversidad se relaciona con el número de filotipos, era de
esperarse que las muestras que presentan mayor diversidad presentaran también
mayor riqueza, tal como sucedió en este caso donde los resultados para diversidad
55
y riqueza son coherentes (Tabla 8). Respecto a la diversidad de bacterias
diazótrofas asociadas a plantas gramíneas, se han publicado varios estudios en los
cuales mediante técnicas cultivo dependiente se logra aislar varias especies
fijadoras de nitrógeno, dentro de las cuales se han identificado principalmente los
géneros Azospirillum, Herbaspirillum (Reis, V M y Dobereiner, J, 1998), Azoarcus
spp, Klebsiella y Beijerinckia (Reinhold-Hurek, B, et al., 1993),
6. Pruebas de Correlación y Análisis Estadístico
En el presente estudio se consideraron algunos factores ambientales que pueden
tener algún efecto sobre la diversidad y distribución de los genes nifH a lo largo de
gradientes ambientales. Estos factores fueron: en primer lugar el tipo de ecosistema
(bosque maduro, pastizal y chagra) y el paisaje fisiográfico (terraza, llanura aluvial)
sobre el cual se ubicaban; adicionalmente se tomaron en cuenta algunos
parámetros fisicoquímicos de cada suelo y por último, se consideró el efecto de la
distancia geográfica entre los sitios de muestreo. Con el propósito de establecer la
correlación entre los factores ambiéntales y los resultados obtenidos, se llevaron a
cabo varios procedimientos estadísticos para evaluar las diferentes interacciones
entre las variables ambientales y los parámetros analizados.
En este caso se evaluó la correlación entre las variables de entrada: tipo de
ecosistema, distancias geográficas y parámetros fisicoquímicos evaluados; con las
variables de salida: diferencias en diversidad, riqueza y distancia filogenética
(Figura 24).
Ecosistema
Diversidad
Distancia Geográfica Distancia Filogenética Parámetros Fisicoquímicos
Figura 24. Esquema de interacción entre variables.
Variables de Entrada Variables de Salida
¿?
56
En primer lugar se llevó a cabo un análisis de varianza (ANOVA) para determinar si
las medias de los valores de diversidad entre los diferentes ecosistemas
presentaban diferencias significativas. A partir de los datos obtenidos se encontró
que no hay diferencias significativas entre los valores de diversidad ( p = 0.081) y
riqueza ( p = 0.261) obtenidos para cada ecosistema. En la Figura 25 se muestra el
valor medio de diversidad para cada ecosistema. Se observa que a pesar de que
las diferencias no sean significativas, los pastizales presentaron los valores de
diversidad más altos seguidos por las chagras.
Gráfica de del Valor Medio de Diversidad por Ecosistema
0,224 0,217 0,215
0,167
0,2750,291
0
0,05
0,1
0 ,15
0,2
0,25
0,3
0,35
C hagraTerraza Chag raVá rzea Bo squ eTerra za Bo squ eVárzea Pasti zalTerraza P astiza lVárzea
Ecosistema
Med
ia
Figura 25. Valores medios de diversidad por ecosistema.
A continuación, para poder evaluar si existe una relación entre los parámetros
fisicoquímicos de cada suelo con su diversidad fue necesario reducir el número de
variables mediante un análisis de componentes principales (PCA), para poder
realizar análisis estadísticos posteriores.
Los resultados obtenidos de los análisis fisicoquímicos para cada uno de los sitios
de muestreo se encuentran en la Tabla 8:
57
Tabla 8. Análisis f isicoquímicos para cada sitio de muestreo.
Lugar pH CIC4 CO%5 P1 SB%2 SAI%3 % Arena % Limo % Arcilla CHTR1 3,70 11,20 2 ,20 5 ,50 7 ,30 83,60 55,10 22,50 22,50
CHTR2 3,60 17,40 1 ,40 3 ,00 15,70 77,80 19,30 41,40 39,30 CHTR3 3,40 9 ,20 2 ,10 14,40 7 ,20 85,10 65,50 22,30 12,20
CHVR1 4,00 40,50 2 ,60 3 ,00 8 ,80 82,50 18,20 16,80 65,00
CHVR2 3,80 46,40 5 ,40 19,80 5 ,30 86,00 36,80 12,60 50,50
CHVR3 4,20 33,80 4 ,00 33,10 20,50 55,80 22,80 18,80 58,40 BTR1 4,20 19,00 1 ,10 0 ,21 8 ,60 86,00 18,60 40,70 40,70
BTR2 3,50 29,50 4 ,80 14,90 9 ,30 70,50 32,90 42,70 24,40 BTR3 4,20 16,80 0 ,95 0 ,00 2 ,70 94,90 16,20 48,80 34,60
BVR1 3,50 30,50 5 ,90 9 ,40 3 ,40 94,40 30,00 14,50 55,60
BVR2 3,60 39,40 5 ,40 6 ,40 3 ,00 94,60 31,80 12,40 55,80
BVR3 3,60 36,60 3 ,00 7 ,60 2 ,70 95,20 29,90 14,40 55,70 PTR1 3,90 20,10 3 ,10 3 ,43 39,40 31,40 30,80 42,70 26,40
PTR2 3,80 14,60 1 ,70 68,00 15,60 68,50 47,60 26,20 26,20
PTR3 3,90 18,70 2 ,10 64,00 12,60 75,10 41,00 30,50 28,50
PVR1 3,90 17,90 1 ,90 162,00 21,10 59,50 20,70 50,90 28,50 PVR2 5,00 15,50 1 ,10 50,50 73,20 2 ,20 25,30 50,50 24,20
PVR3 6,80 16,20 1 ,00 84,20 98,30 0 ,00 17,20 64,60 18,20
1: Fósf oro disponible en ppm.
2: Porcentaje de saturación de bases totales. ( ∑Calcio, Magnesio, Potasio y Sodio en meq/100g)
3. Porcentaje de saturación de acidez intercambiable. (∑Aluminio, Protones en meq/100g)
4. Capacidad de intercambio catiónico.
5. Porcentaje de carbono orgánico.
Mediante el software SPSS se redujeron todos los parámetros fisicoquímicos en dos
variables compuestas o metavariables que son generadas como componentes
principales (PC) en los cuales se explica la mayor variación posible del conjunto de
datos. En este caso, el análisis de componentes principales arrojó los componentes
principales PC1 y PC2 (Figura 26), los cuales explican el 53% y 22%
respectivamente, de la variación total y agruparon el siguiente conjunto de variables:
58
PC1 • pH • Porcentaje de saturación de Bases (SB%) • Porcentaje de saturación de acidez intercambiable (SAI%) • Arena • Limo
• Fósforo
Figura 26. Asociación entre variables y componentes principales. Líneas cercanas se correlacionan positivamente y líneas en sentido opuesto presentan correlación negativa. En azul variables agrupadas en el componente 1 (PC1) y en verde variables del componente 2 (PC2).
Una vez se redujo el número de variables, se aplicaron pruebas de correlación de
Mantel para comprobar la correlación entre las variables ambientales y los
resultados de obtenidos. Esta prueba establece correlaciones entre matrices de
distancia por medio de pruebas de permutaciones. A partir de la suma de los
PC2 • CIC
• CO%
• Arcilla
59
productos cruzados de dos matrices (Zm = ∑Xi j Y i j ) obtiene un coeficiente de
correlación de Mantel ( rm ) que determina si se presentan asociaciones positivas o
negativas mas sólidas de lo que se esperaría por azar. El coeficiente de Mantel
varía entre -1 y 1, donde un valor de 1 implica una correlación perfecta entre
matrices. Este coeficiente es apoyado por un nivel de significancia (p), para el cual
un valor menor a 0.05 (p>0.05) implica que las matrices están correlacionadas (*), si
este valor es menor a 0.005 (p>0.005) la correlación es muy significativa (**).
En primer lugar se determinó que la distancia geográfica entre los sitios de
muestreo (Figura 27) está correlacionada con los parámetros fisicoquímicos
asociados en PC1 y PC2. En la Tabla 9 se reporta el coeficiente de Mantel y los
valores de significancia obtenidos para cada correlación, se observa que el la
correlación entre la distancia y PC1 es mucho mas fuerte que la encontrada para
PC2.
Variable 1 Variable 2 r mantel P
Distancia Geográfica Componente Fisicoquímico 1 0,18 0.003** Distancia Geográfica Componente Fisicoquímico 2 0,61 <0.001**
Tabla 9. Correlación entre distancia geográfica y parámetros fisicoquímicos.
Con base en el análisis de componentes principales de los parámetros
fisicoquímicos, se genero un mapa factorial (Figura 28) en el cual se pretende
agrupar las variables que se encuentran más correlacionadas entre ellas.
60
Figura 27. Ubicación geográfica de los sitios de muestreo.
PCA Parametros Fis icoquímicos
-2
-1
0
1
2
3
4
-3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6
PC1 (52,58 %)
PC2
(21,
89 %
)
Figura 28. Mapa factorial generado por PCA de parámetros fisicoquímicos.
61
Mediante la comparación entre los dos mapas (Figuras 27 y 28) es posible
identificar que los lugares más cercanos geográficamente como los bosques várzea,
chagras várzea y pastos terraza son los más parecidos en sus características
fisicoquímicas.
Para explicar la relación entre distancia geográfica y características fisicoquímicas
se pueden tener en cuenta factores como los procesos formativos y la composición
del suelo, que generan similitudes entre sitios cercanos geográficamente.
A continuación se evaluó la correlación entre las variables distancia geográfica y
parámetros fisicoquímicos con la diversidad de cada ecosistema (Tabla 10). Dado
que la distancia física tiene un efecto de sobre las características fisicoquímicas de
cada ambiente, la correlación entre estos parámetros y la diversidad se determinó
mediante una prueba parcial de Mantel. Esta prueba funciona de la misma manera y
bajo los mismos principios que la prueba de Mantel, pero controla el efecto de una
tercera matriz, en este caso la de distancia geográfica.
Tabla 10. Correlación entre distancia geográfica, parámetros f isicoquímicos y diversidad.
Variable 1 Variable 2 r mantel p Distancia Geográfica Diversidad 0,18 0,028*
Componente Fisicoquímico 1 Diversidad -0,163 0,42
Dis
tanc
ia
Geo
gráf
ica
Componente Fisicoquímico 2 Diversidad -0,08 0,317
En la Tabla 10 se observa que ninguno de los dos componentes fisicoquímicos se
correlaciona con la diversidad encontrada para cada ecosistema, a diferencia de la
distancia geográfica la cual sí presenta correlación con la diversidad. Según este
62
resultado, se puede esperar que los sitios más cercanos geográficamente sean más
parecidos en cuanto a su diversidad.
Con el fin de visualizar la similitud entre los diferentes puntos de muestreo según su
diversidad, se realizó una Prueba de Escalamiento Multidimensional (Figura 29),
como la que se aplicó para comparar los sitios de muestreo según su composición
genética (Figura 21). De esta manera, es posible identificar los sitios más cercanos
en su diversidad y se aprecian algunas asociaciones entre ellos. Por ejemplo, el
mapa muestra cómo en términos de diversidad se distinguen relativamente dos
grupos que separan ecosistemas distantes como los pastizales de los bosques y
chagras várzea; agrupando los habitats contiguos.
Prueba de Escalamiento Multidimencional para:
DIVERSIDAD
Figura 29. Agrupación de los sitios de muestreo según su diversidad genética.
Anteriormente, se evaluó la correlación entre las diferentes variables analizadas y
los datos de diversidad genética obtenidos. A continuación (Tabla 11), se muestra la
correlación entre el mismo conjunto variables y la distancia filogenética calculada
entre cada uno de los grupos, con base en la prueba de Mantel.
63
Tabla 11. Correlación entre distancia geográfica, parámetros f isicoquímicos y distancia f ilogenética.
Variable 1 Variable 2 r mantel P Distancia Geográfica Distancia Filogenética -0,016 0,84
Componente Fisicoquímico 1 Distancia Filogenética 0,255 <0.001** Componente Fisicoquímico 2 Distancia Filogenética 0,159 0.042*
En este caso se encontró que la distancia geográfica no se correlaciona con la
distancia filogenética entre los sitios de muestreo, por el contrario las características
fisicoquímicas del suelo, en especial las que se agrupan en el PC1 si muestran una
correlación (p<0.001).
De nuevo, se aplicó una Prueba de Escalamiento Multidimensional para agrupar o
separar los sitios de muestreo según la distancia filogenética entre ellos (Figura 30).
Según ésta, se podría sugerir que los ecosistemas intervenidos (pastos y chagras)
son más cercanos, en términos filogenéticos, entre ellos que respecto a los bosques
nativos. Asimismo los bosques, tanto várzea como terraza, se separan de los
demás ecosistemas conformando los grupos menos dispersos en la gráfica, es
decir los que presentan menor distancia filogenética entre ellos.
En resumen, a partir de las pruebas de correlación de Mantel, se encontró que la
distancia geográfica entre sitios de muestreo tiene un efecto sobre las
características fisicoquímicas del mismo, al igual que sobre su diversidad. Por otro
lado, la distancia filogenética entre los ecosistemas evaluados se correlaciona con
los parámetros fisicoquímicos del mismo y no con las distancias geográficas entre
ellos. De acuerdo a estos resultados se podría proponer, de manera puramente
especulativa, que factores como la diversidad microbiana del suelo en un
ecosistema dado se ven afectados por sucesos a escala macro que afectan por
igual diferentes ecosistemas según su cercanía geográfica. Por el contrario, factores
como la distancia filogenética entre diferentes ambientes parecería estar más
influenciada por características que varían en microescalas y definen las
propiedades de cada microhábitat las cuales determinan la identidad de los filotipos
que se pueden establecer en cada ecosistema, sin importar su ubicación
geográfica.
64
Prueba de Escalamiento Multidimencional para:
DISTANCIA FILOGENÉTICA
Figura 30. Agrupación entre ecosistemas según su distancia fi logenética.
Rescatando todos los análisis estadísticos que se realizaron, vale la pena destacar
la tendencia que mostraron los resultados obtenidos para el ecosistema de bosque
maduro. En primer lugar, se identificó que los bosques son los ecosistemas más
homogéneos respecto a la composición del pool de secuencias nifH.
Adicionalmente, bajo este tipo de hábitat se encontraron los menores valores de
diversidad genética. Por último, este ecosistema presentó los grupos de secuencias
(bosque várzea y bosque terraza) con menor distancia filogenética entre ellas. Estos
resultados sobre la diversidad molecular de genes nifH sugieren una aparente
estabilidad en la comunidad de organismos diazótrofos bajo el ecosistema de
bosque maduro. Es posible argumentar que los largos procesos de formación de
este ecosistema y su uniformidad respecto a algunos factores ambientales, conlleva
una estabilidad en las poblaciones microbianas del suelo, dando como resultado
comunidades genéticas un poco más homogéneas que aquellas bajo ecosistemas
más variables.
65
Por otro lado, en los ecosistemas intervenidos se observó una mayor variabilidad en
cuanto a su composición genética, al igual que valores más altos para diversidad y
también una mayor distancia filogenética entre las muestras. En general, estos
ambientes a diferencia de los bosques, no son tan estables y presentan condiciones
variables que al parecer influyen sobre la estabilidad de las comunidades
bacterianas. Según (Marquez, G, 2002), bajo condiciones estables generadas por
ecosistemas complejos se favorecen especies especializadas que compiten
exitosamente por elementos limitantes. Cuando las condiciones cambian, estas
especies se extinguen rápidamente dando paso a otras que se adaptan a las
nuevas condiciones locales. En este sentido, es posible sugerir que la intervención
sobre ecosistemas naturales, en este caso mediante la deforestación y
establecimiento de nuevas especies vegetales dominantes, genera un impacto
sobre los organismos fijadores de nitrógeno bajo el suelo promoviendo un cambio
en las comunidades de organismos diazótrofos.
VI. CONCLUSIONES
- La creación de librerías de ADN y análisis de secuencias es una herramienta
con un alto poder de resolución para determinar la diversidad genética presente
en muestras ambientales.
- En todos los ambientes evaluados se encontró una gran diversidad de genes
nifH. No se observaron diferencias significativas en los valores de diversidad
entre los diferentes ecosistemas. Esto sugiere que la alteración de los
ecosistemas naturales en el Sur del Trapecio Amazónico Colombiano no
disminuye la diversidad genética de los microorganismos diazótrofos, aunque si
genera cambios en su composición, tal como se demostró mediante Pruebes
de Escalamiento Multidimensional.
- El análisis filogenético de las secuencias no indicó una correlación entre
distribución filogenética de nifH y los diferentes sitios de muestreo, lo cual
66
sugiere que los parámetros que determinan esta distribución son
independientes del tipo de ecosistema estudiado.
- En ningún caso fue posible la identificación taxonómica de las secuencias
obtenidas dado que no se encontraron filotipos cercanamente relacionados a
cepas cultivables o caracterizadas. Adicionalmente todas las secuencias que
presentaron una alta similitud con los filotipos encontrados pertenecen a
organismos ambientales no caracterizados; acorde con lo reportado en
numerosos estudios sobre diversidad molecular de nifH donde la mayoría de
las secuencias ambientales carecen de similitud con secuencias de organismos
conocidos.
- El análisis estadístico constituye una herramienta fundamental para poder
establecer correlaciones entre variables ambientales y la distribución de la
diversidad genética. En este estudio, las pruebas de correlación de Mantel
identificaron la distancia geográfica entre sitios, más que las características
fisicoquímicas de los mismos, como un predictor importante sobre su
diversidad.
- Los ecosistemas intervenidos presentaron una mayor variación en su
composición genética comparada con los ecosistemas naturales sugiriendo que
las nuevas presiones ambientales promueven un cambio genético en la
comunidad de organismos diazótrofos.
- Este estudio constituye un aporte al conocimiento sobre la diversidad
microbiana en suelos amazónicos y sobre el impacto que genera la alteración
de los ecosistemas naturales sobre la composición genética de los organismos
fijadores de nitrógeno.
67
VII. BIBLIOGRAFIA Altschul, S F, Madden, T, Schäffer, A, Zhang , J, Zhang, Z, Miller, W y Lipman, D. 1997. Gapped BLAST and
PSI-BLAST: a new generation of protei n database search programs. N ucleic Acids Res. 25:3389-3402. Borneman, J y Tr iplett, E W . 1997. Molecul ar microbial di versity i n soils from eastern Amazonia: evidence for
unusual microorganisms and microbial population shif ts associated with defores tation. Appl Environ Microbiol 63:2647-53.
Burgmann, H, W idmer, F, Von Sigler , W y Z eyer, J. 2004. New molecular screeni ng tools for anal ysis of free-living diazotrophs in soil. Appl Environ Microbiol 70:240-7.
Burnett, J H. 2003. Fungal populations and speci es. Oxford Uni versity Press, Oxford ; New Yor k.
Cardona, G I. 2004. Evaluacion de la diversidad de ac tinomicetos bajo tres coberturas vegetales en el sur del trapecio amazónico colombi ano. Uni versidad Pontificia Javeriana, Bogota.
Corredor, P. 2000. Estruc tura de l a comunidad edafica del género Streptomyces en bosques relictuales y agroecosistemas del Quindío (Andes C olombianos). Uni versidad Nacional de Col ombia, Bogota.
Crawford, J W , Harris, J A, Ritz, K y Young, I M. 2005. Towards an evolutionar y ecolog y of life in soil. Trends Ecol Evol 20: 81-7.
DeLong, E F, W ickham, G S y Pace, N R. 1989. Phylogenetic stains: ribosomal RNA-based probes for the identification of single cells. Science 243:1360-3.
Deslippe, J R y Egg er, K N. 2006. Molecular di versity of nifH genes from bacteria associ ated with high arctic dwarf shrubs. Microb Ecol 51:516-25.
Dixon R. , K D. 2004. Genetic R egulation of Biol ogical Nitrogen Fixation. Nature 2:621-631.
Durham, A M, Kash iwab ara, A Y, Mat sunaga, F T, Ahagon, P H, Rainon e, F, Varuzza, L y Gruber, A. 2005. EGene: a configurabl e pi peline gener ation system for automated sequence anal ysis. Bi oinformatics 21: 2812-2813.
Ewing, B, Hil lier , L, W endl, M y Green , P. 1998. Basecalling of automated sequencer traces using phred. I. Accuracy assessment. Genome Research 8:175-185
Fierer, N y Jackson, R B. 2006. T he di versity and biogeography of soil bacterial communiti es. Pr oc Natl Acad Sci U S A 103: 626- 31.
Giovannoni, S J, DeLong, E F, Olsen, G J y Pace, N R. 1988. Phylogenetic group-specific oligodeoxynucleotide probes for identification of single microbial cells. J Bacteriol 170:720-6.
Halbleib, C M y Ludden, P W . 2000. Regul ation of biol ogical nitrogen fixation. J N utr 130:1081- 4.
Hamelin, J, Fromin, N, T arnawski, S, Teyssier-Cuvelle, S y Aragno, M. 2002. nifH gene diversity in the bac terial community associated with the rhizosphere of Molinia coerulea, an oligonitrophilic perennial grass. Environ Microbiol 4:477-81.
68
Holland, S. 2003. Anal ytic Rarefaction Version 1.3 <http: //www.uga.edu/s trata/software/>.
Hughes, J B, Hellmann, J J, Ricketts, T H y Bohannan, B J. 2001. Counting the uncountable: s tatistical approaches to es timating microbial di versity. Appl Environ Microbiol 67:4399-406.
Kemp, P F y Aller, J Y. 2004. Bacterial di versity in aquatic and other environments : what 16S rDNA libraries can tell us. F EMS Microbiol Ecol 47:161'177.
Kirk, J L, Beaudette, L A, H art, M, Moutoglis, P, Klironomos, J N, Lee, H y Trevors, J T. 2004. Methods of studying soil microbial di versity. J Microbi ol Methods 58:169-88.
Larocque, J R, B ergholz, P W , Bagwell, C E y Lovell, C R. 2004. Infl uence of host plant-deri ved and abi otic environmental parameters on the composition of the diazotroph assembl age associated with roots of Juncus roemerianus . Antonie Van Leeuwenhoek 86:249-61.
Lozupone, C A y Knight, R. 2007. Gl obal patterns in bacterial di versity. Proc Natl Acad Sci U S A 104:11436-40.
Maddison, W P y Maddison, D R. 1989. Interac tive analysis of phylogeny and charac ter evoluti on using the computer program MacClade. Folia Primatol (Basel) 53:190-202.
Marquez, G. 2002. Ecologia y cultura: cambio ambiental, evol ución biologica y evol ución cultural. Politeia 28:41-56.
Moyer, C L, Dobbs, F C y K arl, D M. 1994. Esti mati on of di versity and community s tructure through restriction fragment length polymorphism distribution anal ysis of bacterial 16S rRNA genes from a microbi al mat at an acti ve, hydrothermal vent system, Loihi Seamount, Hawaii. Appl Environ Microbiol 60:871-9.
Nogales, B. 2004. La microbiol ogia del suel o en la era de la biol ogia molecular. Ecosistemas. R evista Cientifica y Tecnica de Ecologia y M edio Ambiente.
Ohkuma, M, Noda, S y Kudo, T. 1999. Phyl ogenetic di versity of nitrogen fixation genes in the symbiotic microbial community in the gut of di verse termites . Appl Environ Microbi ol 65:4926-34.
Orozco, F H. 1999. Biología del Nitrógeno.
Piceno, Y M y Lovell, C R. 2000. Stability in Natur al Bac terial Communiti es: I. Nutrient Addition Effects on Rhizosphere Diazotroph Assemblage C omposition. Microb Ecol 39:32-40.
Poly, F, Ranjard, L, Nazaret, S, Gourbiere, F y Monrozier, L J. 2001. Comparison of nifH gene pools in soils and soil microenvironments with contrasting properties . Appl Environ Microbi ol 67:2255-62.
Reinhold-Hurek, B, Hurek, T, Claeyssen s, M y van Montagu, M. 1993. Cloni ng, expressi on i n Escherichia coli, and char acterizati on of cellulol ytic enzymes of Azoarcus sp., a root-invading diazotroph. J Bacteriol 175:7056-65.
Reis, V M y Doberein er, J. 1998. Effect of high sugar concentr ation on nitrogenase ac tivity of Acetobacter diazotrophicus. Arch Microbiol 171:13-8.
Shaffer, B T, W idmer, F, Porteous, L A y Seidler, R J. 2000. Temporal and Spatial Distribution of the nifH Gene of N(2) Fixi ng Bacteria in F orests and Clearcuts in Western Or egon. Microb Ecol 39:12-21.
69
Steenhoudt, O y Vand erleyden, J. 2000. Azospirillum, a free-living nitrogen-fixi ng bacterium closel y associated with grasses : genetic, biochemical and ecological aspec ts. FEMS Microbi ol Rev 24:487-506.
Sylvia, D M. 1998. Principl es and applications of soil microbiolog y. Prentice Hall, Upper Saddle Ri ver, N.J .
Tamura, K, Dudley, J, Nei, M y Kumar, S. 2007. MEGA4: Mol ecular Evoluti onary Genetics Análisis (MEGA) software M olecular Biolog y and Evolution 10.1093/molbev/msm092.
Thompson, J D, Higgind, D y Gibson, T. 1994. CLUSTAL W: improving the sensiti vity of pr ogressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, 22:4673- 4680.
W idmer, F, Shaffer, B T, Porteous, L A y Seidler, R J. 1999. Anal ysis of nifH gene pool complexity i n soil and litter at a Douglas fir forest site in the Oregon cascade mountain range. Appl Environ Microbiol 65:374-80.
Zehr, J P, Jenkins, B D, Short, S M y St eward, G F. 2003. Nitrogenase gene diversity and microbial community structure: a cross-system comparison. Environ Microbiol 5: 539- 54.
Zhang, Y, Li, D, W ang, H, Xiao , Q y Liu, X. 2006. Mol ecular diversity of nitrogen-fixi ng bacteria from the Ti betan Plateau, China. FEMS Microbi ol Lett 260:134-42.