anexo 1 1.- aislamiento e identificación de he y...

INFORME TECNICO FINAL ENERO-DICIEMBRE 2007

PROYECTO: Búsqueda, aislamiento e identificación de hongos y nemátodos entomopatógenos de suelos cultivados con maíz y frijol en Durango. Clave 20070543

DR. CIPRIANO GARCIA GUTIÉRREZ

ANEXO 1

1.- Aislamiento e identificación de HE y nemátodos de suelos Se realizó el aislamiento e identificación de hongos entomopatógenos y nemátodos

provenientes de suelos agrícolas de maíz y frijol del Estado de Durango" para su posterior

identificación y caracterización molecular de las cepas más tóxicas.

1.1. Muestreo de suelos

Se realizó la colecta de suelo en 35 sitios ó áreas predeterminadas por su actividad agrícola

determinando la altitud, temperatura media anual, abundancia y daños del insecto en cultivos

de maíz y fríjol (Figura 1). En todos los sitios se tomaron muestras de suelo en áreas no

cultivadas cerca de las parcelas (Figuras 2 y 3).

Fig 1. Sitios de muestreo de HE y nemátodos en Durango

1




Figs 2 y 3. Suelos de cultivo de frijol y zonas aledañas a cultivos

1.2. Cría masiva de insectos trampa. Se estableció la cría masiva del gusano de la cera G.

melonella Los insectos fueron criados masivamente en el laboratorio usando dieta artificial (225

g de miel de abejas, 150 ml de glicerina, 310 g de salvado de trigo, 90 g de levadura y 45 g de

cera de abejas) (Figura 4). En dicha cría las larvas se desarrollaron hasta el estado de pupa,

luego de esto se pasaron a trozos de madera encerados con agua-miel para la emergencia de

los adultos, los cuales ovipositaron en este lugar. Posteriormente los huevecillos se colocaron

en la dieta y se llevaron a un cuarto con completa oscuridad a una temperatura de 30 0C

durante 35 días aproximadamente.

Fig 4. Cría masiva de G. melonella y S. frugiperda en laboratorio

1.3. Aislamiento de cepas de hongos entomopatógenos. Para la detección de hongos

provenientes del suelo se utilizó la técnica del insecto trampa con larvas del gusano de la cera

G. mellonella L. criadas en laboratorio. Las muestras de suelo (1 kg) se tomaron en superficie

de 10m2 (Figura 4,5 y 6). Las larvas con síntoma de infección por hongos se colocaron en una

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cámara húmeda y en trampas White para la detección de nemátodos. Los sitios de muestreo

fueron geo-referenciados (Estado, municipio; altitud, latitud y longitud) (Figura 1).

Figs 4, 5 y 6. Muestreos de suelos para el aislamiento de HE y nemátodos

El aislamiento y purificación de hongos se realizó en una campana de flujo laminar por

transferencia directa de conidios y/o micelio a tubos de ensayo con medios selectivos,

provenientes de las cajas de petri que contienen al aislamiento (Fig 6-8).

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Fig 6-9. Aislamiento de HE en laboratorio

1.4. Identificación de hongos. La identificación de HE se realizó en base a técnicas de

coloración y crecimiento sobre el insecto huésped y mediante microcultivo y observacioneen

microscopio de contraste de fases siguiendo las claves taxonómicas de Humber, (1997) (Fig

10). La identificación se realizará con base a coloración y crecimiento de los hongos en los

insectos y se corroborará esta en microcultivos y observaciones en microscopio de contraste

de fases de acuerdo a las características morfológicas de crecimiento, formación de

conidióforos en forma de botella en el caso de B. bassiana y conidias características de cada

especie, de acuerdo a las claves de Barnett y Hunter, (1998); Humber, (1997).

Fig 10. Aislamiento Bbc1de HE proveniente de insecto trampa

1.5. Aislamiento de nemátodos. Las muestras de suelo se colectaron de la siguiente manera:

en una superficie de 10 m2 se marcaron 3 puntos en los cuales se colecto una muestra de los

primeros 15 cm de suelo hasta tener aproximadamente 1 kg (Figura 5), las muestras se

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conservaron en bolsas de plástico, debidamente etiquetadas. De cada muestra de suelo se

tomaron aproximadamente 500g los cuales se colocaron en un recipiente de plástico junto con

7 larvas de G. mellonella L. del último estadio de desarrollo incubadas previamente a 27 ± 10C

durante una semana (Figuras 11 y 12.)

Fig 11 y 12. Cría de larvas de G. melonella en dieta artificial

Las larvas fueron revisadas durante los siete días siguientes y las que presentaron síntomas de

infección por nemátodos fueron colocadas en trampas White para colectar a los juveniles

infectivos que invadieron la larva.

Los nemátodos se lavaron primero con agua destilada y por último con solución Ringer,

haciéndolos pasar por tamices de 200 y 500 mallas. En el tamiz de 500 mallas quedaron

retenidos los estadios infectivos del nemátodo (aplicando prueba de Ji cuadrada). Los

nemátodos se mantuvieron almacenados a una concentración de 10, 000 individuos/ml en

solución de Ringer, en frascos de cultivo no aireados y con una lámina de solución que no

supero los 20 mm. El la figura 13 se observan larvas de G. mellonella que aparecieron con

síntomas de infección por nemátodos.

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Fig 13. Larvas de G. melonella infectadas por nemátodos

Los nemátodos entomopatógenos fueron identificados a nivel de género y tanto estos como los

HE se enviaron a especialistas para su identificación especifica.

Las especies introducidas de Steinernema y algunas especies de Heterorhabditis se

mantuvieron a 11 oC (Figura 14). Las otras especies de Heterorhabditis se mantuvieron a

temperatura ambiente (26 oC). Las cepas nativas fueron reproducidas al menos cinco veces

sobre G. mellonella para purificar la cepa.

Fig 14. Nemátodos del suelos

1.6. Identificación de nemátodos. Los nemátodos se identificaron a nivel de género,

utilizando claves taxonómicas (Harry & Stock; Woodring y Kaya, 1988). Duplicados de las

muestras serán enviadas a especialistas para su identificación específica.

2. Aislamiento HE y nemátodos provenientes de Insectos

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2.1. Aislamiento de hongos. Durante el ciclo agrícola de primavera verano de 2007 se

realizaran colectas de adultos de los insectos plaga de interés que presenten crecimiento

superficial algodonoso (micosis superficial visible) en los cultivos de maíz y frijol (Spodoptera

frugiperda y Epilachna varivestis) en los diferentes sitios de muestreo, los insectos se

trasladaran al laboratorio de entomología donde se realizara la transferencia directa de esporas

y/o micelio a cajas de Petri con medio de cultivo a base de extracto de malta, extracto de

levadura, agar bacteriológico y caldo dextrosa saboraud, hasta la obtención del cultivo puro.

3. Efectividad tóxica de hongos y nemátodos entomopatógenos en laboratorio

3.1. Bioensayos. Se utilizaran larvas de los primeros estadios de desarrollo de E. varivestis y

S. frugiperda, las cuales serán recolectados en cultivos de maíz y frijol durante 2007 (Figuras

15, 16 y 17). Los insectos adultos serán criados en invernadero y laboratorio (27 ± 3 0C y 80 ±

10 %HR,). Las plantas serán cultivadas durante 20 días, para alcanzar un tamaño adecuado

necesario para establecer las colonias. La inoculación se hará sobre hojas de plantas de maíz

o frijol. En cada hoja se colocan 30 adultos por jaula. Las hojas o dieta natural del insecto se

cortara con perforadora de 2,5 cm de diámetro, y se colocara en cajas de Petri de 60x15 mm.

En otros casos se utilizó dieta artificial para cada especie (Handbook of insect rearing).

Posteriormente, se asperjaran 3 ml de una suspensión de 1x108 conidios/ml de las cepas

obtenidas. Además de esos tratamientos, se evaluara la formulación Conidia®, siendo

estandarizada a 1x108 conidias/ml de la suspensión original de la formulación. Al testigo se le

aplicarán 3 ml de agua destilada. Todos los tratamientos se asperjaran utilizando una torre de

Potter, calibrada a una presión de 15 libras por pie cuadrado. Después las cajas de Petrí serán

trasladadas a una cámara bioclimática a 26 ± 1°C, 80 ± 5 % HR y 12 h de fotoperiodo.

Figs 15 y 16. Cría masiva de E.varivestis para pruebas de efectividad de HE y nemátodos

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Fig 17. Cría masiva de S. frugiperda utilizada en bioensayos con HE

Las evaluaciones se realizaran diariamente, registrando la mortalidad para cada repetición y la

mortalidad acumulada durante todo el experimento. Se registrará la mortalidad con base a la

presencia del patógeno, para lo cual se retiraran 100 insectos muertos, los cuales serán

colocados en placas de plástico acrílico, con papel filtro estéril. Los insectos se lavaran dos

veces con alcohol a 70% y agua destilada. Posteriormente, se mantendrán en una cámara

húmeda para el desarrollo de la esporulación del hongo sobre los cadáveres del insecto.

Los resultados de las variables evaluadas serán transformados en porcentajes. El diseño

estadístico utilizado será al azar, las medias serán comparadas por la prueba de Tukey al 5%

de probabilidad. Para el análisis estadístico, los datos serán transformados en Log x+3.

3.2. Evaluación de patogénicidad de nemátodos. Se realizara la evaluación de las especies

de nemátodos nativas de acuerdo a lo sugerido por Bedding (1990) para verificar si las larvas

de los insectos plaga fueron susceptibles a los nematodos nativos. Las larvas serán

inoculadas con dos concentraciones (7,000 y 13,000 nematodos/ml) y evaluadas en dos

tiempos (5 y 10 días luego de la aplicación). Cada tratamiento, incluyendo el control, con cuatro

repeticiones con un total de 20 larvas por tratamiento.

A los 5 y 10 días se realizará la evaluación para verificar la presencia o ausencia de

nemátodos, los insectos serán lavados con ADE para comprobar la presencia de nematodos.

Posteriormente, las larvas se disectarán en solución salina estéril bajo el microscopio-

estereomicroscopio, dividiéndose en cinco secciones: cabeza, tórax, abdomen. Se realizará el

conteo aproximado del número de nemátodos que penetren en cada segmento, tanto vivos

como muertos. Las larvas muertas serán conservadas en cámara húmeda y se continuará

observándolas dos meses más, hasta el final del ensayo. Los datos obtenidos, se analizaran

por medio de pruebas ji-cuadrado, para determinar la dependencia entre los factores de

parasitismo y mortalidad (SAS ver. 6.4)

Antes y después de cada ensayo, se prepararán unidades de muestreo idénticas a las de los

tratamientos, pero con 5 larvas del último instar de G. mellonella para comprobar la

patogenicidad y persistencia de los nemátodos empleados.

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Las larvas se revisarán 48 horas después, registrando el número de larvas vivas y muertas,

estas últimas se trasladarán a una cámara húmeda (caja petri + papel filtro Whatman No. 1)

para continuar con el desarrollo de los nemátodos y su posterior recuperación en trampa White.

Resultados Productos técnicos

Se cuenta con una colección de hongos entomopatógenos conformada por 10

aislamientos y colonias de nemátodos aislados de suelo.

Cuadro 1. Origen de aislamientos de hongos entomopatógenos en Durango, México.

Aislamiento

Sitio Altitud Temp.media anual

Temp máx Origen Hospedero

Bb1 Carlos Real 1,871 27 30 Suelo Bb2 Nazas 1,264 25 33 - S. frugiperda

Bb3 Madero 2,128 23 35 Suelo Bb4 Poanas 1,873 22 32 Suelo BbC5 Morcillo 2,001 24 38 Suelo Mtz1 Carlos Real 1,871 26 38 Suelo Mtz2 Nazas 1,264 26 39 Suelo Mtz3 Madero 2,128 22 33 Suelo Mtz4 Poanas 1,873 20 32 D. balteata Mtz5 Morcillo 2,001 25 30 Suelo

Se generó además una base de datos con información agroecológica del origen de los

hongos entomopatógenos y nemátodos asociados a las principales plagas de maíz y frijol

en Durango.

4.1. Caracterización molecular de cepas de HE. Las cepas de HE serán propagadas por

fermentación difásica (estudiando las condiciones de mezclado del fermentador y tipo de

impulsores que permitan el mayor rendimiento de cepas de HE) y el cultivo masivo de

nemátodos se realizará “in vivo” utilizando al insecto huésped, en ambos cultivos para realizar

estudios de efectividad tóxica en laboratorio (ventana de respuesta biológica y determinación

de DL y CL 50), usando insectos blanco (principales plagas del maíz y frijol) provenientes de

una cría masiva establecida en laboratorio.

B. bassiana creciendo en sustrato sólido

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Imágenes de hifas y esporas de Beauveria bassiana en microscopio de barrido.

Nemátodos. Lista de nemátodos

Cuadro 2. Especies y sinonimias de Steinernema y Neosteinernema

Género Especie y Sinonimia

Steinernema S. krausseii (Steiner 1923) Travassos, 1927.

= Aplectana krausseii Steiner 1923.

=Steineria krausseii (Steiner 1923) Travassos, 1927.

=Oxysomatium krasseii (Steiner 1923) Skrjabin, Shikhobalova, Mozgovoi, 1951.

S. S. arenarium (Artyukhovsky, 1967) Wouts, Mrácek, Gerdin y Bedding, 1982.

=Neoaplectana arenaria Artyukhovsky.

=Neoaplectana anomali Kosodoi, 1984.

S. S. anomalae (Kosodoi, 1984) Curran 1989.

S. S. afinae (Bovien, 1937) Wouts, Mrácek, Gerdin y Bedding, 1982.

=Neoaplectana affinis Bovien, 1937.

S. S. bicomutum Tallosi, Peters y Ehlers, 1995.

S. S. carpocapsae (Weiser, 1955) Wouts, Mrácek, Gerdin y Bedding, 1982).

=Neoaplectana carpocapsae Weiser, 1955.

=Neoaplectana feltiae sensu (Stanuszek, 1974, Nec Filipjev, 1934).

=Neoaplectana feltiae pieridarum (Stanuszek, 1974).

S. S. feltiae pieridarum (Stanuszek, 1974) Wouts, Mrácek, Gerdin y Bedding, 1982.

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=Neoaplectana carpocapsae pieridarum Stanuszek, 1974.

=Neoaplectana dutkyi Turco, Thames y Hopkins, 1971.

S. S. dutkyi (Turco, Thames y Hopkins, 1971) Wouts, Mrácek, Gerdin y Bedding, 1982.

S. S. caudatum Xu, Wang y Li, 1991.

S. S. ceratophorum Jian, Reid y Hunt, 1997.

S. S. cubanum Mrácek, Hernández y Boemare, 1994.

S. S. feltiae (Filipjev, 1934) Wouts, Mrácek, Gerdin y Bedding, 1982.

=Neoaplectana feltiae Filipjev, 1934.

=Neoaplectana bibionis Bovien, 1937.

S. S. bibionis (Bovien, 1937) Wouts, Mrácek, Gerdin y Bedding, 1982.

=Neoaplectana leucaniae Hoy, 1954.

S. S. leucaniae (Hoy, 1954) Wouts, Mrácek, Gerdin y Bedding, 1982.

S. S. glaseri (Steiner, 1929) Wouts, Mrácek, Gerdin y Bedding, 1982.

=Neoaplectana glaseri Steiner, 1929.

S. S. intermedium (Poinar, 1985) Mamiya, 1988.

=Neoaplectana intermedia Poinar, 1985.

S. S. karii Waturu, Hunt y Reid, 1997.

S. S. kushidai Mamiya, 1988.

S. S. longicaudatum Shen y Wang, 1992.

S. S. monticolum Stock, Choo y Kaya, 1997.

S. S. neocurtillae Nguyen y Smart, 1992.

S. S. oregonense Liu y Berry, 1996.

S. S. puertoricense Romin y Figueroa, 1994.

S. S. rarum (De Doucet, 1986) Mamiya, 1988.

=Neoaplectana rara De Doucet, 1986.

S. S. riobrave Cabanillas, Poinar y Raulston, 1994.

S. S. ritteri Doucet y Doucet, 1990.

S. S. scapterisci Nguyen y Smart, 1990.

=Neoaplectana carpocapsae “raza Uruguay” Nguyen y Smart, 1988.

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Neosteinernema Neosteinernema longicurvicauda Nguyen y Smart, 1994.

Cuadro 3. Especies y sinonimias de Heterorhabditis.

Género Especie Heterorhabditis H. bacteriophora. Poinar, 1976. =Cromonema heliothidis Khan, Brooks y Hirschmann, 1976. H. H. argentinensis. Stock, 1993. H. H. brevicaudis. Liu, 1994. H. H. hawaiiensis. Gardner, Stock y Kaya, 1994. H. H. indica. Poinar, Karunaka y David, 1992. H. H. marelatus. Liu y Berry, 1996. =H. Hepialius. Stock, Strong y Gardner, 1996. H. H. megidis. Poinar, Jackson y Klein, 1987. H. H. zealandica. Poinar, 1990 *Fuente: Hominick et al., 1997.

Análisis de RAPD en Beauveria bassiana

Se analizaron 10 aislamientos de B. bassiana. Un total de 153 bandas fueron determinadas, de las cuales 97,2% fueron polimórficas. El número de bandas varió entre 3 (OPM-01) y 15 (OPA-13), con un promedio de 8,7 bandas por partidor. El rango de estos resultados concuerda con los datos de B. bassiana, lo cual indica la consistencia y utilidad de estos marcadores en estudios de diversidad genética. El dendograma de B. bassiana agrupó aislamientos con un promedio de similitud de 42,3%. En la figura2 se observan dos grupos principales. El primero de ellos incluye aislamientos, este grupo incluyó aislamientos colectados en el norte del Estado. El promedio de similitud de este grupo fue de un 77%, lo cual indica una variabilidad genética intermedia a baja. Veintiséis de estos aislamientos fueron colectados en suelos y dos en insectos huésped.

Cuadro 3. Toxicidad de cepas de Hongos Entomopatógenos y Nemátodos

Aislamiento

CL50 UI/ml

Bb1 1.2x109 H. megidis 2x103 Bb2 3.4x108 H. brevicaudis 1x104

Bb3 3.4x109 S. bibionis 2x103 Bb4 2.4x109 S. feltiae p 2x104 BbC5 1.5x109 N. feltiae 3x103 Mtz1 1.4x109 S. anomalae 3x104 Mtz2 3.2x107 S. longicaudatum 2x103 Mtz3 3.7x108 N. longicurvicauda 1x103 Mtz4 1.2x108 S. carpocapsae 2x102 Mtz5 1.4x109 H. Hepialius. 2x103

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Conclusiones.

Se cuenta con una colección de cepas de las principales especies de hongos entomopatógenos, provenientes de suelos e insectos plaga del estado de Durango, las cuales se encuentran caracterizadas molecularmente, así como una colección de colonias de nemátodos identificados a nivel de principales grupos taxonómicos. En ambos casos las colecciones formadas son de referencia para estudios básicos y aplicados posteriores, mientras que la información inherente a las mismas constituye una fuente de información importante para ingresarla en una base de datos de valor taxonómico, y una contribución al conocimiento de la biodiversidad de estos organismos en la región de Estudio en Durango, México.

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anexo 1 1.- aislamiento e identificación de he y...

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