análisis toxicológico de la colchicina en sapos de tabasco

1 | P á g i n a

Análisis Toxicológico de Colchicina en células de Chaunus marinus

INMUNOLOGÍA

INMUNOTOXICOLOGÍA

Análisis Toxicológico de Colchicina en células de Chaunus marinus, 2009 | Javier Hernández-Guzmán (jhernandez

INMUNOTOXICOLOGÍA

Análisis toxicológico de la colchicina (C22H25NO6) en células somáticas y gonádicas de dos poblaciones de Chaunus marinusBufonidae) de Tabasco, México

([email protected])

toxicológico de la colchicina ) en células somáticas y gonádicas de

Chaunus marinus (Anura: Bufonidae) de Tabasco, México

Universidad Juárez Autónoma de Tabasco – División Académica de Ciencias Biológicas


2

Análisis toxicológico de la colchicina (C22H25NO6) en células somáticas y gonádicas de dos poblaciones de Chaunus marinus (Anura: Bufonidae) de Tabasco, México

Javier Hernández-Guzmán

Laboratorio de Acuicultura, Área de Genética en Acuicultivos División Académica de Ciencias Biológicas - Universidad Juárez Autónoma de Tabasco

[email protected]

RESUMEN El sapo común Chaunus marinus es un organismo perteneciente al grupo de los anfibios en el orden anura, es una especie de gran importancia biológica, ecológica, económica y cultural. Eta especie presenta una distribución muy amplia en el continente americano. Los estudios toxicológicos en anfibios son de gran importancia para conocer nuevas perspectivas sobre sustancia altamente tóxicas como la colchicina, la cual es causante de alterar la división celular de la mitosis y de la meiosis en cualquier organismo vivo. La prueba de toxicidad estuvo conformado por una concentración de colchicina de 30 µg/g de peso aplicado a un total de 28 especímenes de C. marinus. Se determinó que la concentración aplicada de colchicina no es mortal para los organismos tratados con la sustancia, sin embargo, se presentó la detención del ciclo celular mitótico y meiótico en la fase de la metafase. También se encontraron evidencia de espermatozoides alterados por la aplicación de la colchicina, por lo que es un registro de gran importancia para el conocimiento en la aplicación de este medicamento a los pacientes. Palabras claves: Chaunus marinus, anfibios, tóxicos, colchicina, ciclo celular



3

INTRODUCCIÓN

Los anfibios son un grupo de organismos que se caracterizan por poseer dos estadios de

desarrollo completamente diferente como lo es la fase larvaria (en hábitats acuáticos) y la

etapa juvenil-adulta (en hábitats terrestres) de organismos pertenecientes al orden Anura,

son de gran importancia para el equilibrio ecológico, económico y cultural. Estudios

previos han descubierto un drástico declive de anfibios enfocándose mayormente hacia el

orden de los anuros reduciendo el número de especies registradas en el continente

americano (Maxon, 1984; Rivera, 2006; Macíp-Ríos y Casas-Andreu, 2008).

El grupo de los sapos que habitan en el estado de Tabasco se encuentran ubicado en el

orden Anura, en la familia Bufonidae y Rhinoprhynidae. El sapo común Chaunus marinus

se ubica taxonómicamente en la familia de los bufónidos, es una especie de amplia

distribución geográfica en el continente americano, desde el sur de Sudamérica en países

como Chile y Brasil hasta el Norte de América en México y Estados Unidos de América;

los sapos son anfibios de importancia biológica, ecológica, cultural y económica en algunos

municipios del estado de Tabasco (Seebacher y Alford, 1999; Caro-Cruz y Ardila-Robayo,

2006; Lynch, 2006).

Las dos etapas de desarrollo de los sapos han permitido que se realicen diversos estudios a

nivel internacional, mencionando algunos de ellos el origen de la clonación a partir del

desove de estos organismos, experimentación de organismos triploides, estudios de

ecotoxicología y de análisis citogenéticos de sapos (Rodríguez-Piazze, 1995; Kasahara et

al. 1996; Castañén et al. 2003).

La toxicología es definida como una rama de las ciencias médicas que estudia los agentes

tóxicos sobre los sistemas inmunológicos de los organismos (Izaguirre et al. 2006). La

contaminación actual de los ambientes ha ocasionado gran daño en el número de las

poblaciones de sapos en el estado de Tabasco. Los estudios toxicológicos o

genotoxicológicos son de gran utilidad para saber más sobre la biología básica de muchos

anfibios.

Debido a la falta de estudios toxicológicos se realizaron pruebas y análisis del efecto de la

colchicina sobre células mitóticas y meióticas en la especie del sapo común C. marinus de

Tabasco, México.

Universidad Juárez Autónoma de Tabasco


4

MATERIALES Y MÉTODOS

Recolecta de especímenes del sapo común.

Se recolectaron un total de 28

siendo sexados a través de la diferenciación gonádica entre hembras y machos, de los

cuales 15 fueron colectados en la Villa Luis Gil Pérez los cuales fueron sexados como

ocho hembras y siete machos

colectaron trece especímenes siendo cinco hembras y ocho machos.

Colchicina (C22H25NO6).

La colchicina es un alcaloide utilizado en el tratamiento de la artritis gotosa. La

intoxicación por colchicina, aunque es infrecuente, se asocia con una alta

A altas dosis inhibe la divisió

como el tracto gastrointestinal y la médula ó

cardiotóxico utilizado generalmente en pacientes con prob

cancerígenas (González-Anglada

La estructura química de la colchicina se encuentra conformada por la fó

22 CARBONOS + 25 HIDRÓGENOS + 1 NITRÓGENO + 6 OXIGENOS

Figura 1. Estructura química de la colchicina (C



MATERIALES Y MÉTODOS

Recolecta de especímenes del sapo común.

Se recolectaron un total de 28 especímenes distribuidos en tres poblaciones del sapo com



ocho hembras y siete machos, mientras que en el fraccionamiento Brisas del Carriz

colectaron trece especímenes siendo cinco hembras y ocho machos.


n por colchicina, aunque es infrecuente, se asocia con una alta

A altas dosis inhibe la división celular, afectando a órganos con rápido

tracto gastrointestinal y la médula ósea. Además, la colchicina

utilizado generalmente en pacientes con problemas de enfermedades

Anglada et al. 1998; Larrubia-Marfil et al. 2003).

La estructura química de la colchicina se encuentra conformada por la fó


Estructura química de la colchicina (C22H25NO

especímenes distribuidos en tres poblaciones del sapo común



, mientras que en el fraccionamiento Brisas del Carrizal se


n por colchicina, aunque es infrecuente, se asocia con una alta morbi-mortalidad.

pido movimiento celular

s, la colchicina tiene un efecto

lemas de enfermedades

2003).

La estructura química de la colchicina se encuentra conformada por la fórmula siguiente:


NO6).



5

Procedimiento citológico.

La técnica empleada para la evaluación toxicológica de la colchicina es el procedimiento

tradicional de citogenética empleado por Arias-Rodríguez (2006, 2007 y 2008 modificado)

que consiste en inyectar intraperitonealmente a los especímenes del sapo común con una

concentración de colchicina al 0.1% diluido en citrato de sodio al 1%, aplicando un

cantidad de 30 µg/g de peso dejando a exposición aproximadamente seis horas.

Posteriormente los individuos del sapo común fueron sacrificados a través de muerte por

hipotermia, en donde seguidamente fueron extraídos los tejidos de médula ósea (médula

espinal y fémur), bazo y corazón y gónada. Una vez extraído los tejidos, estos fueron

sometidos a hidratación para que se realizara un choque hipotónico en las células a través

de la aplicación de citrato de sodio en una concentración de 2% con una exposición de una

hora a una temperatura de 30 ± 1 ºC. Lugo los tejidos fueron colocados en tubos de

eppendorf de 2 ml a los que se les agregó 1 ml de fijador para el prefijado en proporción

4:1 (cuatro de metanol y uno de ácido acético) dejando reposar durante 72 horas.

Posteriormente las muestras fueron centrifugadas a 4ºC, 6000 rpm durante 10 minutos en

cuatro o más repeticiones ó hasta que el tejido quedara totalmente limpio. Una vez que el

tejido estuviese blanco o limpio, fueron goteadas las muestras en portaobjetos en frío

sujetos a alcohol al 70% sobre una plataforma de madera de 30 x 25 cm a una altura de

aproximadamente de 1.80 mts para que las células reventaran y se pudiesen observar

campos celulares somáticos y gonádicos con mayor dispersión. Las preparaciones celulares

fueron teñidas con giemsa al 10% diluida en buffer fosfato a pH de 7.0.

Análisis microscópico.

Las preparaciones fueron observadas a través de un microscopio Zeiss Axiostar Plus con

los objetivos de 10x y 40x para localizar los campos celulares y con el objetivo de 100x

para tomar las fotografías con una cámara digital SONY (DSC-W30).

Análisis toxicológico.

Las fotografías celulares fueron contabilizadas y analizadas a través del software Adobe

Photoshop CS3 para determinar el efecto de la colchicina en la división celular mitótica y

meiótica (C22H25NO6), se determinó el número modal de las fases de división celular en la



6

que la concentración de 30 µg/g de peso hace su mayor efecto, así como los posibles daños

toxicológicos a través de ideogramas de frecuencia.

RESULTADOS

Especímenes de la Villa Luis Gil Pérez.

Efecto de C22H25NO6 en células somáticas.

Se analizaron 30 preparaciones celulares de las cuales se estableció el número modal de

fases mitóticas a partir del conteo de 191 campos cromosómicos, de los cuales 180

representaron el 89% del total de campos contabilizados en metafase, mientras que en el

resto se distribuyeron campos de otras fases de la división celular muy bajos (Figura 2).

Figura 2. Representación gráfica del efecto tóxico de la colchicina en una concentración de

30 µg/g de peso, así como el número modal (M) en las fases mitóticas.

El efecto de la aplicación de la colchicina en células somáticas fue sobre la segunda fase de

la división celular, deteniendo el ciclo celular en la fase de metafase. Debido a la aplicación

de la técnica citológica de Arias-Rodríguez (2006, 2007 y 2008 modificado), se pudieron

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

Profase Metafase Anafase Telofase Otras fases

Co

nta

bil

iza

ció

n d

e c

élu

las

som

áti

cas

Fases de la división celular somática

M= 89%

5% 1% 1% 4%



7

0

10

20

30

40

50

60

70

80


Nú

me

rod

e c

élu

las

con

tab

iliz

ad

as

Fases de la división celular meiótica

localizar dispersiones cromosómicas que permitieron determinar el efecto toxicológico de

la colchicina en células mitóticas (Figura 3).

Figura 3. Campos celulares en diferentes etapas del ciclo celular mitótico (A y C), campos cromosómicos en metafase (B y D).

Efecto de C22H25NO6 en células gonádicas.

Se analizaron 24 preparaciones celulares de los cuales se estableció el número modal de

fases meióticas a partir del conteo de 102 campos celulares, de los cuales 68 representaron

el 67% del total de campos contabilizados en metafase, mientras que en el resto se

distribuyeron campos de otras fases de la división celular muy bajos (Figura 4 y 5).

Figura 4. Efecto de la colchicina sobre la división celular meiótica, teniendo mayor frecuencia (M) la metafase.

M= 67%

22%

4% 2% 6%



8

0

10

20

30

40

50

60

70

80


Nú

me

ro d

e c

élu

las

con

tab

iliz

ad

as

Fases de la división celular mitótica

Figura 5. Campos de división celular en metafase dispersos (A y B), campos celulares con dispersiones bajos (B y C).

Especímenes del Fraccionamiento Brisas del Carrizal.

Efecto de C22H25NO6 en células somáticas.

Se analizaron 64 preparaciones celulares de las cuales se estableció el número modal de

fases mitóticas a partir del conteo de 154 campos celulares, de los cuales 70 representaron

el 45% del total de campos contabilizados en metafase mientras que en el resto se

distribuyeron campos de ostras fases de la división celular con números de cromosomas

muy bajos (Figura 6 y 7).

Figura 6. Efecto de la colchicina en las fases de la división celular mitótica y el número modal (M) de la fase más frecuente.

M= 45%

14%

3%

15%

23%



9

0

10

20

30

40

50

60


Nú

me

ro d

e c

éu

las

con

tab

iliz

ad

as

Fases de la división celular meiótica

Figura 7. Cromosomas normales en la división celular del sapo (A y B) y cromosomas afectados por colchicina en la división mitótica del sapo común.

Efecto de C22H25NO6 en células gonádicas.

Se analizaron 15 preparaciones celulares de los cuales se estableció el número modal de

fases meióticas a partir del conteo de 68 campos celulares, de los cuales representaron el

71% del total de campos contabilizados en metafase, mientras que en el resto se

distribuyeron campos de otras fases de la división celular muy bajos (Figura 8 y 9).

Figura 8. Fase de la división celular gonádica más afectada por colchicina y su porcentaje como número modal.

M= 71%

18%

1% 1% 7%



10

Figura 9. Células gonádicas normales (A y B) y células gonádicas afectadas por colchicina (C y D).

DISCUSIÓN

Las especies de anfibios son organismos que generalmente son utilizados en pruebas de

toxicidad subcrónica y crónica. Los reportes existentes sobre sustancias tóxicas en anfibios

son basados en estudio a nivel de laboratorio en donde organismos como ranas arborícolas,

sapos y salamandras son las principales especies utilizadas en pruebas y análisis

genotoxicológicos y respuestas inmunotoxicológicas de diversos agentes ambientales.

De acuerdo a Kasahara et al. (1996); Mercadal y Barrio, (2002); Beçak y Setsuo (2004) y

Amaro-Ghilardi et al. (2008) la colchicina en diversas concentraciones por gramo de peso

aplicado a diferentes organismos pertenecientes al orden Anura afecta

genotoxicológicamente a los cromosomas de células somáticas así como en células

gonádicas. La aplicación de colchicina actúa directamente en la división celular,

generalmente sobre la fase de metafase haciendo que el huso mitótico y meiótico (acción

sobre las proteínas citoesqueléticas del huso) detengan el proceso celular antes de que los

cromosomas lleguen a la etapa de anafase, ya que el objetivo de utilizar la sustancia

C22H25NO6 es detener la producción celular y la división celular específicamente en

metafase para observar a los cromosomas totalmente desarrollados, para utilizarlos con



11

fines de estudios citogenéticos, en donde se reorganizan los cromosomas de acuerdo a su

tamaño, forma y clasificación para la elaboración del cariotipo a través de la búsqueda de

los pares homólogos en el caso de cromosomas somáticos y la búsqueda de cromosomas

sexuales (Figura 10).

Figura 10. Cromosomas de sapo hembra (A), cromosomas de sapo macho (B), Efecto tóxico de colchicina en sapo hembra “triploide” (C) y efecto de la colchicina en células somáticas de sapo macho.

En altas concentraciones la sustancia tóxica de colchicina puede ocasionar daños no

solamente en células somáticas y en células gonádicas, sino también puede llegar alterar la

producción y la morfología de espermatozoides en individuos en los que se aplique.

Algunas de las manifestaciones que se pueden presentar en los espermatozoides es la

lentitud del desplazamiento y alteraciones en el contenido genético (Figura 11).

Figura 11. Comparación de espermatozoides de Leptodactylus sp. (A) y Chaunus marinus

de Tabasco (B).

A B



12

CONCLUSIÓN

El conocimiento de la aplicación de la colchicina en humanos es muy amplio,

encontrándose algunos efectos colaterales como alteraciones digestivas como la diarrea,

náuseas, vómitos, hipotensión arterial, alteraciones cardiovasculares. Esta sustancia a través

de una intoxicación puede llegar a provocar sintomatología gastrointestinal, depleción

hídrica y leucocitosis. El tratamiento de la intoxicación aguda es básicamente de soporte,

con reposición hidroelectrolítica, lavado gástrico y administración de carbón activo.

También ocasiona mielodepresión, fallo multiorgánico, distrés respiratorio, hipocalcemia,

afectación neuromuscular y supresión medular con alta tasa de morbimortalidad. La prueba

toxicológica en sapos prueba que la concentración de 30 µg/g de peso no es letal para

ocasionar mortandad, sin embargo, ocasiona la detención de los ciclos celulares de mitosis

y meiosis; ya que para los humanos una concentración de 30 a 60 µg/kg de peso es

altamente mortal. Además, ocasiona alteraciones en la producción de espermatozoides así

como daños en fenotipo y genotipo en los organismos.

LITERATURA CITADA:

Mercadal, I.T. y Barrio, A. (2002). Tetraploidía en Ceratophrys (Anura, Leptodactylidae),

análisis del registro fósil. Iheringia. 92(3): 17-31.

Amaro-Ghilardi, R.C., De Jesus-Silva, M.J., Trefaut-Rodrígues, M. y Yonenaga-Yassuda,

Y. (2008). Chromosomal studies in four species of genus Chaunus (Bufonidae, Anura):

localization of telomeric and ribosomal sequences after fluorescence in situ hybridization

(FISH). Genetica. 134: 159-168.

Kasahara, S., Zampieri, A.P. y Haddad, C.F.B. (1996). Chromosome banding in three

species of Brazilian toads (Amphibia-Bufonidae). Brazilian Journal of Genetics. 19(2):

237-242.

Beçak, M.L. y Setsuo, L. (2004). Evolution by polyploidy and gene regulation in Anura.

Genetics and Molecular Research. 3(2): 195-212.



13

Rivera, M. 2006. La citogenética: un aporte más al conocimiento de los anfibios

ecuatorianos. Nuestra Ciencia. 8: 27-30.

Maxon, L.R. 1984. Molecular probes of phylogeny and biogeography in toads of the

widespread genus Bufo. Molecular Biology and Evolution.1(4): 345-356.

Macíp-Ríos, R. y Casas-Andreu, G. 2008. Los cafetales en México y su importancia para la

conservación de los anfibios y reptiles. Acta Zoológica Mexicana. 24(2): 143-159.

Caro-Cruz, F.A. y Ardila-Robayo, M.C. 2006. Aportes al conocimiento de la fauna

Amphibia de la Orinoquí colombiana. Acta Biológica Colombiana. 11(1): 133-176.

Lynch, J.D. 2006. The amphibian fauna in the Villavicencio region of eastern Colombia.

Caldasia. 28(1): 135-155.

Seebacher, F. y Alford, R.A. 1999. Movement and microhabitat use of a terrestrial

amphibian (Bufo marinus) on a Tropical Island: seasonal variation and environmental

correlates. Journal of Herpetology. 33(2): 208-214.

González-Anglada, M.I., Juárez-Alonso, S., Capillo-Pueyo, R., Cobo-Mora, J. y Torres, E.

1998. Envenenamiento por colchicina: una intoxicación grave poco conocida. Urgencias.

10(5): 325-326.

Larrubia-Marfil, Y., Villamañán-Bueno, E., Jiménez-Caballero, E., Diazaraque-Marín, R.,

Lucendo-Villarín, A., Fernández-Capitán, C. y Arnalich-Fernández, F. 2003. Intento

autolítico con colchicina. Farmacia Hospitalaria. 27(3): 188-190.

Arias-Rodríguez, L., González-Hermoso, J.P., Fletes-Regalado, H., Rodríguez-Ibarra, L.E.

& Del Valle-Pignataro, G. 2007. Cariotipo de los caracoles de tinte Plicopurpura pansa y

Plicopurpura columellaris. Rev. Biol. Trop. 55: 853-866.

Arias-Rodríguez, L., Ibarra-Castro, L. & Páramo-Delgadillo, S. 2008. Los cromosomas

mitóticos del pez tropical Petenia splendida (Cichlidae). Rev. Biol. Trop. 56: 895-907.

Arias-Rodríguez, L., Páramo-Delgadillo, S. & Durán-González, A.L. 2006. Caracterización

citogenética del pez tropical de agua dulce Parachromis managuensis (Pisces: Cichlidae).

Rev. Biol. Trop. 54: 35-42.



14

Rodríguez-Piazze, M.E. 1995. Cariotipo y patrones de bandas C en Bufo spinulosus

arequipensis (Amphibia: Anura). Rev. Ecol. Latinoam. 2(3): 5-11.

Castañén, P.M., Topalián, M.L., Cordero, R.R. y Salibián, A. 2003. Influencia de la

especiación de los metales pesados en medio acuático como determinante de su toxicidad.

Revista de Toxicología. 20: 13-18.

Izaguirre, M.F., Marín, L., Vergara, M.N., Lajmanovich, R.C., Peltzer, P. y Casco, V.H.

2006. Modelos experimentales de anuros para estudiar los efectos piretroides. Ciencia,

Docencia y Tecnología. 32(17): 181-206.

análisis toxicológico de la colchicina en sapos de tabasco

Documents