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16 de marzo de 2011

Página 1

Analisis de

Contaminantes Orgánicos

Emergents per UHPLC/MS

Jaume C. Morales

Especialista Productos LC/MS

Agilent Technologies

16 de marzo de 2011

Página 2

La Gran Problemática en Análisis de

Aguas: los Contaminantes

Emergentes

• La gran cantidad de potenciales

contaminantes “desconocidos” que

pueden llegar a emerger.

• La sensibilidad en los Q y QqQ se va

reduciendo con el nº de compuestos a

controlar que coeluyen.

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Triazine & phenyl urea herbicides

Chlorinated phenoxy acid herbicides

Glyphosate

Asulam

Surfactants

Oestrogenic Steroids

Organophosphorus compounds

Paraquat, Diquat, Chlormequat

Carbamates

Acrylamide

Veterinary drug residues

Pharmaceutical residues

PFOS/PFOA

Brominated flame retardents

Natural products

PCP Personal care products

Bis phenol A

Toxins

PROGRAMA: Análisis

de Contaminantes

Orgánicos Emergentes

por UHPLC/MS:

• Retos Analíticos

• Tipos de Enfoque Analítico

• Herramientas (según enfoque) y

Posibilidades.

Ejemplo Aplicación:

• Cuantificación y screening de

productos farmacéuticos y de

higiene personal en aguas de

consumo humano (PPCPs)

mediante Triple Cuadrupolo y

sistemas de Tiempo de Vuelo

TOF/QqTOF.

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Retos Analíticos en Análisis de Aguas

• Sensibilidad y Selectividad: Muy bajos niveles (especialmente en

aguas debido a su elevada ingesta).

– Uso MS y preconcentración.

• Rapidez y reducción supresión ionización.

– Mejorar con UHPLC la cromatografía sin incrementar el tiempo.

– Reducir los tiempos con UHPLC manteniendo la resolución

cromatográfica.

• El elevado número de potenciales contaminantes

conocidos y “desconocidos” que pueden llegar a emerger:

“Screening” de cientos/miles de compuestos.

• Automatización preconcentración y “clean-up”.

• ………

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Tipos de EnfoqueAnalítico

Análisis de

Contaminantes


por UHPLC/MS:

Enfoque Específico:

• Cribado y Cuantificación de

contaminantes Diana:

“Targets”.

Enfoque Genérico:

• Cribado Masivo (“ilimitado”) de

Contaminantes: “Non Targets” +

“Targets”

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“Targets”.

• Requiere un MS Sensible, Específico y

Muy Rápido

• Equipo ideal: QqQ en modalidad MRM.

• Alternativas TOF/ QTOF en modo MS.

• Virtudes modalidad MRM:

• Sensibilidad: hasta zeptomoles inyectados.

• Rapidez: hasta 300 MRM‟s/segundo.

• Robustez.

• Limitaciones modalidad MRM:

• Requiere patrones/muestras para optimizar

MRM’s y conocer sus tiempos de retención.

• Pierde sensibilidad al aumentar el nº de

contaminantes coeluyentes

170 210 250 290

210

222

268 280165

Espectro con

iones del “fondo”(API: ESI, APCI,…)

Q1 sólo deja pasar

el ión “precursor”

210 pass

190 210

210

Q3 monitoriza sólo los

fragmentos 158 y 191

característicos del ión

210 para cuantificar y

cualificar con máx.

sensibilidad

160

158

190

191

sin “fondo químico”

Espectro de

una

fenilurea

Celda Colisión

rompe el ión

210 (y sus

productos)

150 170 190 210

210158

191

Transición: 210 158

MRM (Multiple Reaction Monitoring) para Cuantificar con Máxima

Sensibilidad, Selectividad y Rapidez

QqQ

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Enfoque Genérico:

• Cribado Masivo (“ilimitado”)

de Contaminantes: “Non

Targets” + “Targets”

• Requiere un MS:

• Universal y Muy Selectivo.

• Masa Exacta y Fidelidad Isotópica*.

• Masa Exacta independiente de la

concentración del analito

• Sensible y Rápido.

• Equipo ideal:TOF/ QTOF en modo MS.

• Alternativas: ninguna adecuada*

• Virtudes TOF/ QTOF en modo MS.

• Se puede detectar cualquier compuesto

ionizado Cribados ilimitados (no se

requieren patrones).

• Rapidez: admite picos de tan sólo

0,5-1 segundo de ancho en línea de base.

• Limitaciones :

• Menor sensibilidad que QqQ en MRM de gama

equivalente.

• Ficheros de tamaño considerable.*Tampoco hibridas con masa exacta.

MS/MS con Q-TOF para Cuantificar y Cualificar con Máxima Selectividad e Independencia de Compuestos Coeluyentes

170 210 250 290

210

222

268 280165

Espectro con

iones del

“fondo” (API:

ESI, APCI,…)

Q1 sólo deja

pasar el ión

“precursor”

210 pass

190 210

210

Celda Colisión

rompe el ión

210 (y sus

productos)

Tubo de Vuelo monitoriza con “masa exacta” TODOS los

fragmentos característicos del ión 210 para cuantificar y cualificar con máxima

información y seguridad.

sin “fondo químico” y con “masa exacta”

DC Quad

Octopole 2

Ion Pulser

Ion Mirror

Detector

Tur

bo

Filtro Masa: Cuadrupolo 1 (Q1) Celda Colisión

150 170 190 210

210.222

158.123

191.321

Espectro completo

QTOF

TOF

slide

Página 9

“El poder la Masa Exacta ROBUSTA”: Selectividad

Cuantitativa tipo MS/MS con Cromatogramas de MS con Iones

con Masa Exacta. Ejemplo: 2ng/ml (2ppb) Clenbuterol en Orina

IC: 277.1 m/z - Ventana Extración 1 Da

Clenbuterol S/N = 14

Rango extracción típico Cuadrupolo /TRAP /QqQ /QTRAP

IC: 277.087 m/z - Ventana Extración 0.016 Da +/- 30ppm

S/N = 102

LC/MS-TOF Agilent 6210

Ejemplo con 6210

Página 10

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Página 11

PROGRAMA: Análisis de


Emergentes por

UHPLC/MS:



• Herramientas y Posibilidades.



productos farmacéuticos y de higiene

personal en aguas de consumo

humano (PPCPs) mediante Triple

Cuadrupolo y sistemas de Tiempo de

Vuelo TOF/QqTOF.




“Targets”.

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Herramientas para Solventar Retos en Análisis

Aguas:

• LC/MS más sensibles y rápidos:

– Agilent 6490/6460 i-Funnel /Jet Stream-QqQ.

• Herramientas de software que optimizan la eficiencia del proceso de medida:

– DMRM: Dynamic MRM, Nuevo tMRM

– MRM Optimizer

• Cromatografía más rápida y eficiente: UHPLC/MS:

– Nuevo Agilent UHPLC/RRLC: 1290/1260 Infinity.

• Disponibilidad de Kits de Aplicaciones(y de preparación muestras).

• Herramientas de automatización, “Screnning” masivo,..……

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Aguas:





– MRM Optimizer





¿Límites de Sensibilidad Actuales con Triple Cuadrupolo?:

Agilent QqQ-6490 con iFunnel Technology

Hexabore Capillary

• Capilar con 6 entradas.

• Muestrea x10 más gas

rico en iones de la fuente.

• Captura la mayor parte del

gas de la región de la

fuente.

Agilent Jet Stream

• Confinamiento térmico

de la pluma de ESI.

• Muy eficiente

desolvatación para crear

iones en fase gaseosa.

• Crea una zona rica en

iones.

Dual Ion Funnel

• Elimina el gas, pero

captura los iones

• Elimina el ruido de

neutros

• Prolonga la vida útil de

la bomba turbo

Página 14

Nuevo: Agilent Jet Stream. Thermal Gradient Focusing Technology

Gas de

nebulización

Capilar de

resistivo

Gas de

secado

Flujo colimado de

gotas nebulizadas

generan un mejor

rendimiento en fuente

Entrada LC

Sheath gas

calentado (hasta 400ºC)

Elevada mejora en Sensibilidad.

Mejora en la Nebulización.

Mejora en la Desolvatación.

Iones Focalizados en una zona

colimada por contención térmica.

Mejora en la Eficiencia de la

Ionización y Muestreo.

Página 15

Antes de Calentar el “Sheath Gas” en

Jet Stream: modo electrospray convencional

Sin calentar el “Sheath Gas”

Página 16

Con el “Sheath Gas” calentado

Con el “Sheath Gas” Calentado

modo “Jet Stream”

QqQ-6490

Hexabore

capillary

¿Cómo Funciona el Ion Funnel?

The RF Voltage

focuses the ions

to the center.

The DC Voltage

accelerates the

ions to the exit.

RF Drive

DC Drive

Unfocused

Ions and Gas

Enter

Focused

Ions Out

La tecnología iFunnel

del 6490 permite una

muy rápida

conmutación (30ms) de

polaridad + / -

Página

18

10-20m

200 zeptomoles

90 atogramos

Verapamil

Injectados en-columna

Acquisition Time (min)

+ MRM (455.3 -> 164.9)

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9

1x10

4.2

4.3

4.4

4.5

Triple Cuadrupolo 6490 Proporciona

Limites Detección Zeptomolares

Página 19

¿Qué es un Zeptomol?

¿¿¿¿ Zepto ???FACTOR POR EL QUE HAY QUE MULTIPLICAR

LA UNIDADMULTIPLO PREFIJO

ABREVIATU

RA

0,1 mol 10-1 mol decimol dM

0,01 mol 10-2 mol centimol cM

0,0001 mol 10-3 mol milimol mM

0,0000001 mol 10-6 mol micromol μM

0,0000000001 mol 10-9 mol nanomol nM

0,0000000000001 mol 10-12 mol picomol pM

0,0000000000000001 mol 10-15 mol femtomol fM

0,0000000000000000001 mol 10-18 mol attomol aM

0,0000000000000000000001 mol 10-21 mol zeptomol zM

0,0000000000000000000000001 mol 10-24 mol yoctomol yM

Page

20

602 moleculas

< 1molécula

Página 20

Re

se

rpin

e R

es

po

ns

e

(Sig

nal/N

ois

e)

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010

AB/Sciex

Agilent

New Agilent 6490

Ag

ile

nt

64

60

Ag

ile

nt

64

30

Ag

ile

nt

64

10

T R I P L E Q U A D R U P O L E I N S T R U M E N T S P E C I F I C AT I O N S

¿Qué Aporta Disponer la Enorme Sensibilidad de

un Triple Cuadrupolo?

Página 22

• Poder simplificar el proceso de preparación de muestra mediante

una simple dilución con un factor muy elevado.

• Poder abordar en buenas condiciones las analíticas más

exigentes en sensibilidad, evitando el uso de pre-concentración.

• Poder disponer de una “buena”* sensibilidad en modo Scan (aunque

mucho peor que en MRM) comparada con otras técnicas tradicionalmente

más sensibles en modo barrido.

* Pero sin la selectividad de la masa exacta

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Aguas:





– MRM Optimizer





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Página 24

x3 x4 x4 x3 x4 x2 x1

Cycle time

Rt

QqQ-dMRM “Dynamic Multiple Reaction Monitoring”:

Mayor Sensibilidad

= nº Concurrent dMRM

dMRM:

• MRM Dinámico con ventanas de

monitorización individuales

creadas automáticamente a partir

del tiempo de cada compuesto.

• Permite mejorar la

sensibilidad (↑ dwell time) o la

frecuencia de adquisición de datos

para poder reducir tiempo de análisis.

dMRM

RSD%

requeridoPtos./pico

necesarios

<1% 15

1-3% 12

10-12% 8

“Triggered MRM (tMRM) Data Dependent”: ~“Scan”

Especifico con la Sensibilidad y Rapidez de un MRM

Cuantificar e Identificar con la sensibilidad y rapidez de un MRM

“Espectro MS/MS compuesto para analito b”

co

un

ts

100 200 300 m/z

Product %MRM

Ion Scan Sensitivity

Time

QTRAP

5500~ 100 msec ~ 10%

Vantage ~ 150 msec ~ 2%

Xevo ~ 150 msec ~ 2%

6460/90 ~ 30 msec 100%

1 MRM de monitorización por compuesto dispara hasta 8 MRM de

confirmación de cada uno de los compuestos detectados

Muy útil para cuantificación y confirmación masiva de analitos con

Triple Cuadrupolo: péptidos, metabolitos, análisis multiresiduos, …

Página 25

Mass Hunter Optimizer : La Solución para el Desarrollo

Automatizado de Métodos MRM (QqQ) con Centenares de

Compuestos. Compound Entry & Method Setup

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Medioambiental:


– Agilent 6460 Jet Stream-QqQ.


– Nuevo DMRM: Dynamic MRM.

– Nuevo MRM Optimizer


– Nuevo Agilent UHPLC: 1290 infinity.

• Disponibilidad de Kits de Aplicaciones(y de preparación muestras) Nuevo!!.

• Herramientas automatización, “Screnning” masivo,..……

7m

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La Importancia de una Buena Separación incluso con LC/MS Altamente Selectivos

30:70 agua/metanol, 0.2 % ácido acético

Inte

nsity

, cps

Difenhidramina

m/z 256.17

Ketoprofeno

m/z 255.10

Time, min

0.0

6.0e4

1.2e5

1.8e5

2.4e5

3.0e5

3.6e5

4.2e5

4.8e5

0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 1.10 1.20 1.30 1.40

Difenhidramina

m/z 256.17

0.0

6.0e4

1.2e5

1.8e5

2.4e5

3.0e5

3.6e5

4.2e5

4.8e5

Inte

nsity

, cps

0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00

Time, min

Ketoprofeno

m/z 255.10

5:95 agua/metanol, 0.2 % ácido acético

1/7 respuesta (-85%)

Una buena cromatografía

puede mejorar

considerablemente la

sensibilidad y robustez de

los resultados por LC/MS

¿Porqué es Importante la Velocidad en UHPLC / RRLC?El poder de separación de elevadas velocidades lineales

Cromatogramas con escala de tiempo alineada a primer y último picoI.D. & I.M - Waldbronn 5/2009

Columna: ZORBAX RRHD SB-C18 2.1 x 100mm 1.8 µm

Gradiente: ACN/H2O 30/70 a 100/0 a 40ºC Cromatogr. A: 0.5mL/min en 3.0min // B: 0.833mL/min en 1.8min

Inyección: 1µL (Uracilo, Fenol, Metil/Etil/Propil/Butil/Heptil-parabens).

P máx. grad. A= 590bars. B= 905 bars

A 0.5mL/m gr.. 3.0min

K„ = (87 x F x Tg) / ( % x V0 x S)

FxTg = 0.5x3 = 0.833x1.8 = 1.5

B 0.833mL/m

gr. 1.8min

3min Si el producto de Flujo x Tgrad se mantiene

constante el poder de separación no variará (utlizando la misma columna y sin variar los %

solvente orgánico)

1.8min

↑Flujo: Reduce tiempo análisis y mejora

capacidad de separación en gradientes

A 0.5mL/m gr.. 3.0min

B 0.833mL/m

gr. 1.8min

Columnas RRHD & RRHT permiten subir el

flujo SIN reducir resolución para:

- Reducir tiempos (subiendo flujo)

- Aumentar resolución (sin sacrificar tiempo)

Página: 29

0

200

400

600

800

1000

1200

0 1 2 3 4 5

1290 Infinity

1200 Infinity Series: Aumentado los Estándares

y Compatibilidad en HPLC y UHPLC

bar

ml/min

Standard LC

Vendor A1.7µm columns

Agilent RRLC: 1220 & 1260

Infinity Series Columnas 1.8µm

Vendor B1.9µm columns

Vendor C

Vendor D

1290 Infinity le permitirá la máxima reducción de sus tiempos de

análisis y/o aumento de la resolución de sus aplicaciones

52

1200

HPLC Estándar

RRLC

Agilent 1100 y 1200

600

Página: 30

Página: 31

1260

Infinity LC

Modular

600bar

80Hz

2-10x Sensibilidad UV

Precio HPLC–Prestaciones RRLC

100% Compatible con HPLC

1220

Infinity LC

Integrado

600bar

80Hz

2-10x* Sensibilidad UV

Most affordable

HPLC and RRLC

1290

Infinity LC

Modular

1200bar

160Hz

Las Mejores Prestaciones

Máxima FlexibilidadCostes Mantenimiento de HPLC

*2x for build-in VWD, 10x via add-on 1260/1290 DAD

Nueva Serie Agilent 1200 Infinity: Mejorando los

Estándares en HPLC – Mayor Valor para Cualquier Presupuesto

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Bombas 1290 Infinity “versus” 1200/1260 Infinity-El más bajo volumen de retardo para una más rápida cromatografía.

1200 Series

Channel A

Passive Damper

0 - 300 µl

Passive Mixer

400 µl

1200 Series

Channel B

1290 Inifinity

Chanel A

1290 Inifinity

Chanel B

Very Low Noise

~ 800 µl

+ =Active Damping

10µl

Jet Weaver Mixer

35µl

Lowest Noise

• min. 50% lower

Delay Volume

• 10µl / 45µl

• 80x / 20x lower

1290 Infinity

Agilent 1290 Infinity el mejor UHPLC para LC/MS

11

00/1

200/ 1

22

0 &

12

60

In

f.

La Solución: Fibra no recubierta (sílice fundida)

V

V

mD

LFr

24

42

1290 Infinity DAD: Mejora hasta x10 Sensibilidad-1290 Infinity DAD: 11.4 x 1200 Series DAD SL

1290 DAD

60 mm

1200 DAD SL

10mm

Height [mAU] 28.87579 4.93845

Noise [mAU] 0.009806 0.01908

Signal/ noise 2944 259

Sensitivity

increase

+11.4

Columns: 150 x 4.6mm Zorbax SB C18, 5µm

Sample: Anthracene: 835 pg/µL

Mobile phase: A: Water, B: Acetonitrile

Elution: isocratic 80 % B

Injection volume: 5 µL

Flow: 1.5 mL/min

DAD: 251/4nm, Ref= 450/80nm,

2.5Hz, slit width 4nm

min0 1 2 3 4 5

mAU

0

5

10

15

20

25

30

1290 Infinity DAD

1200 Series DAD SL1290 DAD

60 mm

1200 VWD

10mm

Height [mAU] 28.87579 4.79998

Noise [mAU] 0.009806 0.01894

Signal/ noise 2944 253

Sensitivity

increase

+11.61290 Infinity DAD

el detector UV/VIS más sensible del mercado

Página: 33

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Página 34


Medioambiental:


– Agilent 6460 Jet Stream-QqQ.


– Nuevo DMRM: Dynamic MRM.

– Nuevo MRM Optimizer


– Nuevo Agilent UHPLC: 1290 infinity.

• Disponibilidad de Kits de Aplicaciones(y de preparación muestras) Nuevo!!.

• Herramientas automatización, “Screnning” masivo,..……

11m

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5990-4254EN

Kits de Aplicaciones para

LC/MS-QqQ

Kits Base de Datos DMRM

• Adaptables a la cromatografía del usuario.

• Chequeo opcional de la aplicación on-site.

• Kit 600 pesticidas incluye:

– Columna y mezcla de test específica.

– QuEChERS Trial pack para preparación muestra.

– DVD con los parámetros del métodos/s (LC y MS).

– Nota de aplicación y guía de inicio rápido.

– Ejemplos con distintas configuraciones y HPLC‟s.

• Kit 200 compuestos de interés Toxicológico incluye:

– Columna y mezcla de test específica.

– DVD con los parámetros del métodos/s.


– Contiene esencialmente drogas de abuso y fármacos PPCP’s

5990-4253EN

16 de marzo de 2011

Página 36

Etapas en la creación de un Método de Adquisición

dMRM propio a partir de la Base de Datos*.

Create a Dynamic MRM method

Import the results generated in the custom report into acquisition method

Specify delta retention time window

Analizar mezclas de estándares de concentración media

fixed dwell time for each MRM transition using one time segment

MHW Quantitative Data Analysis gets retention times

Obtener MRM desde base de datos

Nombres de compuestos, ISTD (opcional)

MRM transiciones, fragmentor , energías de colisión

*Los métodos dMRM también se pueden crear manualmente.

Crear un método MRM Dinámico (dMRM)

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PROGRAMA: Análisis de


Emergentes por

UHPLC/MS:



• Herramientas y Posibilidades.





consumo humano (PPCPs) mediante

Triple Cuadrupolo y sistemas de

Tiempo de Vuelo TOF/QqTOF.

Enfoque Genérico:

• Cribado Masivo (“ilimitado”)

de Contaminantes: “Non

Targets” + “Targets”

Base Heramientas:

• Masa Exacta ROBUSTA

• Independiente de la

concentración de Analito

• Buena Fidelidad Isotópica

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Screening por Extracción de Cromatogramas de Iones con Masa Exacta: SCAN MS con Selectividad Cuantitativa tipo MS/MS

TIC de mta nº119

BPC

1.4 x 108

1.2 x 106

La extracción de iones en un rango muy estrecho de masa (m/z: <0.1) proporciona una Excelente Selectividad y Sensibilidad para el análisis de “compuestos diana”

Muestra Agua Residual ESI+ TOF

EIC Agua Residual

m/z: 237.0-237.1

EIC Agua Residual

m/z: 256.1-256.2

TIC Agua Residual

0.2 ppb Carbamecepina

0.2 ppb Difenhidramina

4.0 x 105

4.0 x 105

1.4 x 108

x350

El “Poder” la de la Masa Exacta: Análisis a

“Posteriori” de Compuestos No Esperados

Laboratorio Químico Microbiológico - Murcia

• Los Agilent TOF/QTOF

proporcionan unas excelentes

prestaciones CUANTITATIVAS.

• El aspecto diferencial de los

TOF/QTOF es su capacidad

cualitativa.

DIURON

Fórmula empírica: C9H10Cl2N2O

Masa Exacta : 243.0243 (El software incluye una calculadora de masas)

Fase 1.- Localización de Potenciales Positivos:

- Extraer IC‟s de “masa exacta” (muy finas ventanas de extracción)

- NO se requieren patrones.

Diuron

Fase 2.- Confirmación /Cuantificación

de Positivos:

- Confirmar con patrones por Tr y

relaciones de iones de “pseudo MS/MS”

- Posibilidad de cuantificar reprocesando

retrospectivamente mediante “factores

de respuesta relativos” (sin tener que

reanalizar la muestra)

Laboratorio Químico Microbiológico - Murcia

El “Poder” la de la Masa Exacta: Análisis a

“Posteriori” de Compuestos No Esperados

Espectros Clenbuterol: en canal a bajo fragmentador se observa el “íón precursor” aislado

cromatográficamente. En el de elevado fragmentador (fig. inferior) se puede observar el “pseudo espectro de

MS/MS” obtenido por Disociación Inducida por Colisión (CID)

+TOF MS: Experiment 2, 5.688 to 5.849 min from lowhigh03.wiff Agilent

Max. 1.9e5 counts.

100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290

m/z, amu

0.01.0e42.0e43.0e44.0e45.0e46.0e47.0e48.0e49.0e41.0e51.1e51.2e51.3e51.4e51.5e51.6e51.7e51.8e51.9e5

132.0624168.0385 203.0076

205.0046

121.0520170.0359

149.0898133.0675

140.0202

Inte

nsity,

counts

+TOF MS: Experiment 1, 5.672 to 5.833 min from lowhigh03.wiff Agilent

Max. 5.4e5 counts.

100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 2900.0

2.0e45.0e4

1.0e5

1.5e5

2.0e5

2.5e5

3.0e5

3.5e5

4.0e5

4.5e5

5.0e5

5.4e5

Inte

nsity, co

un

ts 277.0868

279.0839

121.0510

Fragmentador: 140 volts

Fragmentador: 250 volts

NH

NH2

Cl

Cl

OH

CH3

CH3CH3

ClenbuterolC12H18Cl2N2O [M+H]+=277.0874 Error masa: - 2.2ppm

Error masa: - 2.1ppm

“pseudo espectro de MS/MS”con masa exacta

“ión precursor”

El Agilent TOF Series 1100 puede adquirir señales simultáneas a varios voltajes de fragmentador

La elevada resolución espectral permite confirmar identificación del compuesto por comparación de "pseudo espectro de MS/MS" con masa exacta con patrón (aunque no exista una buena separación cromatográfica)

Confirmación Identificación con LC/MS-TOF por Espectros Simultáneos Con y Sin Fragmentación (“pseudo MS/MS”)

MassHunter Qual. Máxima Productividad en

Extracción de Información: Productividad x 10-100 veces!!

Opcionales

Página 42

“Compound-centric” Data Processing”



Opcionales

Foco presentación:

Automatización de la

Extracción de Información

“Non target” y

Comparación de

Resultados basada en

masa exacta

TOF & Q-TOF

Página 43

16 de marzo de 2011

Página 44

Extracción Automática de la Información Relevante:

Agilent “Molecular Feature Extractor” (MFE)

TCC Procesado con MFE

Gráfico 3D

Original

TIC Original

(modo MS)

Gráfico 3D

Procesado con MFE

M.F.E.

M.F.E.

Reducción de Datos (MFE): suma juntos las intensidades de isótopos, aductos,

“clusters” e Iones con múltiples cargas.

Algoritmo de Data Mining patentado por Agilent

Technologies. Mucho más que un simple reporting de

presencia de iones con datos de masa exacta

m/z

min.

ECC‟s de las “Features”

extraídos por MFE

Avanzado Algoritmo de Deconvolución “Mass Hunter

Molecular Feature Extractor (MFE)”: proporciona la Masa

Exacta de ”todos” los Compuestos Ionizados.

Página 45

Espectros Deconvolucionados

TICIC‟s0

Forma parte del soft. de TOF y Q-TOF

MFE: software clave en

“non target” análisis,

metabolómica o

comparación de muestras.



Opcionales

Foco presentación:

Automatización de

Búsquedas en Bases de

Datos de masa exacta TOF &

Q-TOF Bibliotecas MS/MS

Página 46

5990-4252EN

Kits Aplicaciones para “Screenings”

Masivos por LC/MS-TOF/QTOF

5990-4251EN

Kits Base de Datos de Masa Exacta*• Adaptables a la cromatografía del usuario.

• Chequeo opcional de la aplicación on-site.

Kit 1600 pesticidas incluye:– Columna y mezcla de test específica.

– QuEChERS Trial pack para preparación muestra.

– DVD con los parámetros del métodos/s (LC y MS).


– Ejemplos con distintas configuraciones y HPLC‟s.

Kit 7300 compuestos de interés Toxicológico*:– Columna y mezcla de test específica.

– DVD con los parámetros del métodos/s.


– Contiene esencialmente drogas de abuso, alcaloides, fármacos, pesticidas, disruptores endocrinologicos….

Los TOF y QTOF facilitan mucho la ampliación del alcance del laboratorio (nº compuestos a monitorizar)

*versión con Bibliotecas de espectros MS/MS de 2600 compostos.

Página 47

16 de marzo de 2011

Página 48

Agilent 6230 TOF /QTOF- 20K resolution

- 5 decades in-scan

- Low pg Sensitivity

TIC

Bases de Datos de Masa Exacta. La Solución para Cribados

“ilimitados” de Compuestos:

Agilent TOF /QTOF P.C.DB.:

• 27000 metabolitos endógenos (METLIN).

• 7300 comp. Forénsicos / Toxicología.

• 1600 Pesticidas.

• Bases de Datos propias.

FBF

Find by

Formula

Ejemplo Resultados Búsqueda en Base de Datos

de Pesticidas y Cálculo Fórmula Empírica.

La fidelidad isotópica es

una herramienta clave

en la correcta

asignación de fórmulas

empíricas

Resultados del “Screening” usando

MFE + PCDB de pesticidas

COMPUESTOS TARGET - RTs conocidos – Estándares inyectados

COMPUESTOS NO TARGET - RTs desconocidos pero presentes en la DB – Estándares no inyectados

Página 50



Opcionales

Foco presentación:


Identificación de Desconocidos

basada en masa exacta

TOF & Q-TOF / Espectros

MS/MS

Página 51

?

¿Qué Significa “Masa Exacta en “Pequeñas/ Medianas” Moléculas?

Disponer de Masa Exacta reduce enormemente el nº de posibles

fórmulas empíricas.

Algunos AAS tienen m/z muy parecidas: Leu=Ile=113.084 / Lys=128.095 Gln=128.058

Para poder obtener “masa exacta” se requerirá la adición en continuo de algunos compuestos como referencia interna para m/z.

45.5272 seg

Sistema medida Tiempo de Vuelo Basado en conversor AD

Exactitud Masa

(ppm)

Nº posibles fórmulas

empíricasTecnología

165 ppm 209 QUAD/TRAP

10ppm 13

5 ppm 7

2 ppm 2 TOF /Q-TOF

Comp.: Reserpina (C33H40N2O9). [M+H]+: 609.281 m/z

• En LC/MS NO existen bibliotecas universales de espectros.

• La identificación de desconocidos en LC/MS se base en la masa exacta

Página 52

TOFs

La Importancia de disponer de “Masa Exacta” para “centrar” la búsqueda:

Al aumentar la Exactitud de la masa analizada se reducen muy considerablemente el nº de posibles composiciones elementales que pueden dar la masa en cuestión.

En moléculas pequeñas el poder determinar el peso molecular con la tercera cifra decimal permite típicamente definir una fórmula empírica inequívoca.

Exactitud Masa(u.m.a)

5.687

10

100

1000

1

0,1 0,05 0,01 0,005 0,001 0,0005 0,0001

176

386

882

1347

1672

5687

P.M.

882

176

386

1347

1672

P.M.(uma) para 2ppm100uma250uma5001.000

P.M.(uma) para 10ppm100uma2505001.000uma

Nº

Posib

les F

órm

ula

s

Em

pír

icas

QUADs

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Página 54

Identificación por Asignación de Fórmulas

Empíricas a partir de la Masa ExactaPara la asignación de la fórmula empírica más probable se considera:

1.- Exactitud de masa

2.- Fidelidad con la distribución isotópica teórica (tanto en intensidades relativas como en masas y en separación entre ellas)

- El parámetro de DBE (equivalencia en nº de dobles enlaces) puede ayudar a corroborar la asosicación de una fórmula empírica con una estructuras molecular

3.- Con MS/MS exacta (QTOF): asignación de fórmulas empíricas a los fragmentos coherentes con la del ión precursor

…. DBE

753.3092

754.3125

Counts vs. Mass-to-Charge (m/z)751 752 753 754 755 756 757

755.3095

756.3098

*

*

*

Se requiere una Buena y

Robusta Fidelidad

Isotópica para confirmar

una identificación

16 de marzo de 2011

Página 55

MS/MS una Herramienta Adicional en la

Asignación de Fórmulas Empíricas: Menor nº

Formulas potenciales, Mejor Discriminación

Scores MS Scores MS/MS

Espectro MS

Espectro MS/MS prec.

• 4.- La fórmula empírica resultante se buscará en

bases de datos de fórmulas moleculares:

NIST, Index Merck, Chemspider, ChemIDlus,....

• 5.- Se confirmaría ID mediante cromatografía del

patrón con QTOF:MS/MS // TOF: Vfrag. elevado

Fragmento: C8H16NS

Pérd. Neutra: CH2O2

Precursor (H+): C9H17NO2S

+



Opcionales

Foco presentación:


Extracción de Información

y Comparación de

Resultados basada en

masa exacta

TOF & Q-TOF

Página 56

4 Ensayos con Arroz transgénico1

2

3-INF

4

5

6-RES

7-INF

3-INF

7-INF 6-RES

5

2

3-INF7-INF

6-RES

5

2

mod. genet.

“bacteria salvaje”

“control”

“sin tratar”

+info: Nota de Aplicación Metabolomic Profiling of Bacterial Leaf Blight in Rice: 5989-6234EN

LCMS-ESI: ~ 1900 compuestos/mta ANOVA replicados 564 estadísticamente fiables

3 Ensayos con Arroz salvaje

Estudios de Impacto Medio-Ambiental: Correlación entre Composición y Propiedades de las Poblaciones Comparadas

mediante Análisis Estadístico Multivariante y Masa Exacta:

Requiere:

• Obtener de cada compuesto ionizado mediante

deconvolución 3D su:

• Tiempo de retención

• Masa exacta

• Intensidad de señal específica

• Comparar resultados normalizados de las diversas

poblaciones, mediante “Análisis de Componentes

Principales” (PCA) buscando correlaciones entre:

• Concentraciones de determinados compuestos

• Propiedades de la poblaciones comparadas

16 de marzo de 2011

Página 58

PROGRAMA: Análisis

de Contaminantes


por UHPLC/MS:



• Herramientas.





consumo humano (PPCPs)

mediante Triple Cuadrupolo y

sistemas de Tiempo de Vuelo

TOF/QqTOF.

16 de marzo de 2011

Página 59

Target Screening de PPCP’s en matrices

acuosas por LC/MS/MS QQQ & QTOF (/TOF)• Los PPCPs (Pharmaceuticals and Personal Care Products): cualquier producto químico relacionado con la salud, cosmética o higiene personal, o con el mundo de la agroquímica y similares para favorecer el crecimiento o el mantenimiento de la salud de plantas y ganado.

• El término PPCPs comprende miles de substancias químicas incluyendo fármacos, fragancias, drogas veterinarias o cosméticos.

• Los PPCPs se encuentran frecuentemente en ambientes acuáticos al disolverse con facilidad y no evaporarse a temperatura ambiente. El uso de lodos de alcantarillado como fertilizantes (sewage sludge) o aguas de riego recicladas ponen en contacto los PPCPs con suelos y vertederos.

15m

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Página 60

EPA 1694 - Identificación de PPCP’s en

aguasIbuprofen

Isochlortetracycline (ICTC)

Lincomycin

Lomefloxacin

Metformin

Miconazole

Minocycline

Naproxen

Norfloxacin

Norgestimate

Ofloxacin

Ormetoprim

Oxacillin

Oxolinic acid

Oxytetracycline (OTC)

Penicillin V

Penicillin G

Ranitidine

Roxithromycin

Sarafloxacin

Sulfachloropyridazine

Sulfadiazine

Sulfadimethoxine

Sulfamerazine

Sulfamethazine

Sulfamethizole

Sulfamethoxazole

Sulfanilamide

Sulfathiazole

Tetracycline (TC)

Thiabendazole

Triclocarban

Triclosan

Trimethoprim

Tylosin

Virginiamycin

Warfarin

Other standards

Acetaminophen

Albuterol

Ampicillin

Anhydrochlortetracycline (ACTC)

Anhydrotetracycline (ATC)

Azithromycin

Caffeine

Carbadox

Carbamazepine

Cefotaxime

Chlortetracycline (CTC)

Cimetidine

Ciprofloxacin

Clarithromycin

Clinafloxacin

Cloxacillin

Codeine

Cotinine

Dehydronifedipine

Demeclocycline

Digoxigenin

Digoxin

Diltiazem

1,7-Dimethylxanthine

Diphenhydramine

Doxycycline

Enrofloxacin

4-Epianhydrochlortetracycline

(EACTC)

4-Epianhydrotetracycline (EATC)

4-Epichlortetracycline (ECTC)

4-Epioxytetracycline (EOTC)

4-Epitetracycline (ETC)

Erythromycin

Erythromycin anhydrate

Flumequine

Fluoxetine

Gemfibrozil

Antibioticos

Esteroides

Antidepresivos

Analgésicos

EPA Method 1694:

Pharmaceuticals and

Personal Care Products in

Water, Soil, Sediment, and

Biosolids by HPLC/MS/MS

16 de marzo de 2011

Página 61

Screening rápido de PPCP’s target con el nuevo Agilent

Jet Stream 6460 Triple Cuadrupolo + UHPLC 1290-Infinity

Sensibilidad on-column a nivel subfemtogramo

Linealidad superior a cinco órdenes de magnitud

rango de masas: 3,000 m/z

Pos/Neg switching, 30 msec

Nueva Method Development Tool – MH Optimizer

“Dynamic Multiple Reaction Monitoring” para establecimiento de MRMs en base al RT de los picos y NO por segmentos

16 de marzo de 2011

Página 62

UHPLC - PPCPs de EPA 1694 (Polaridad Positiva)

3 min analisis,

112 transiciones

65 compuestos

(agua del grifo)

Zorbax Eclipse C18

2.1x50mmx1.8um

Min dwell=4.3ms

1.8min

UHPLC

16 de marzo de 2011

Página 63

UHPLC - PPCPs de EPA 1694 (Polaridad Negativa)

130 segundos de analisis,

9 transiciones

6 compuestos

(agua del grifo)

Zorbax Eclipse C18

2.1x50mmx1.8um

Anchura de pico = 0.7sec.

Tiempo total + & -

análisis < 5 min

1.25min

16 de marzo de 2011

Página 64

N= 5 (@100fg), %RSD (area) = 5.4%

Precisión cromatográfica (1290/6460, dynamic MRM)

Albuterol, 100fg en columna. Agua del grifo fortificada.

R2=0.99517 niveles de calibración

por quintuplicado

Transiciones QUANT/QUALcon tolerancias del 20%

N= 35 (all Cal levels), %RSD (RT) = 0.52%

16 de marzo de 2011

Página 65

N= 5 (@100fg), %RSD (area) = 6.9%

Precisión Cromatográfica (1290/6460, dynamic MRM)

Amfetamina, 100fg en columna. Agua del grifo fortificada

R2=0.99866 niveles de calibración

por quintuplicado

Transiciones QUANT/QUALcon tolerancias del 20%

N= 35 (all Cal levels), %RSD (RT) = 0.50%

Screening “ilimitado” de PPCP’s en Aguas por

LC/MS/MS Qq-TOF

16 de marzo de 2011

Página 66

App. Note: 5989-7339

Muestra de agua superficial (Colorado-US) 1L recogido en 0,5gr. Sorbente

Eluido 1mL metanol

Iyectan 5µL

Agilent 1100/6510-QTOF

Listado de PPCP’s Monitorizados:

16 de marzo de 2011

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16 de marzo de 2011

Página 68

Resultados LC/MS-QTOF (/TOF): Localizados

8 compuestos del listado.

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Página 69

Resumen Herramientas Agilent para Maximizar el

Rendimiento y Productividad en Análisis de Aguas

• LC/MS-QqQ proporcionará la máxima sensibilidad y repetibilidad

para cuantificar hasta unas pocas centenas de compuestos

– Agilent 6490 con i-Funnel/ 6460 con Jet Stream

• Cromatografía más rápida y eficiente con UHPLC/MS:

– Nuevo Agilent UHPLC: 1290 infinity

• LC/MS-TOF o QTOF permitirán cribados masivos “ilimitados”

– Agilent 6540 con 0.5ppm exactitud, Resolución 40K y tecnología

Jet Stream para una excelente sensibilidad cuantitativa.

• Con masa exacta son claves las herramientas de software que

automatizan la eficiencia de extracción de Datos:

– Molecular Feature Extractor (MFE).

– Bases de Datos de Masa Exacta /Bibliotecas de espectros MS/MS

– EFG: Generador de Fórmulas Empíricas.

– …….

•……

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