Sara Zapata GarcíaManuela Zapata López

Laura Guerrero VásquezCarolina Cartagena Durango

ANALISIS BACTERIOLOGICO DE LA LECHE

RESUMEN

La leche es un alimento muy completo y nutritivo pero adquiere microorganismos desde el momento en que es ordeñada y hasta su procesamiento. La cantidad de microorganismos presentes en la leche puede condicionar su calidad sanitaria. En esta práctica se llevó a cabo el análisis bacteriológico de la leche para ello se emplearon diferentes pruebas las cuales pueden determinar la cantidad de bacterias presentes en una muestra de leche ya sea cruda o pasteurizada, e identificar las diferentes colonias que pueden crecer en un medio de cultivo a partir de una dilución de leche.

PALABRAS CLAVES: Leche, microorganismos, recuento de bacterias, Análisis microbiológico, bacterias mesofilas, coliformes.

MARCO TEORICO

La leche se ha definido como un alimento casi perfecto para el ser humano, debido a su alto valor nutritivo entre los cuales se encuentra proteínas, carbohidratos, grasas, minerales, vitaminas y agua, al mismo tiempo ella es un muy buen medio para la proliferación bacteriana creando una especie de vehículo de enfermedades.(1)

La lactosa, azúcar de la leche, es la principal fuente de energía de las bacterias y puede experimentar diferentes fermentaciones. (2)

Desde el momento en el que se ordeña la leche, esta adquiere microorganismos y de ahí en adelante sigue contaminándose durante el proceso de manejo y procesamiento que esta recibe. (1)

1. Fuentes de contaminación de la leche

La calidad de la leche puede determinarse por la existencia de diversos tipos de contaminantes. Estos se pueden dividir en dos grupos:

1.1 Contaminantes químicos

Derivan del medio que rodean a la leche. En el camino desde el ordeño a su proceso industrial. Es posible encontrar insecticidas, herbicidas, fungicidas, sustancias higienizantes y algunos antibióticos

1.2 Contaminantes biológicos

Existe la posibilidad de que la leche se encuentre afectada de un gran número de agentes microbianos desde el momento de su producción, dependiendo en gran medida de las prácticas de higiene y sanidad observadas en el manipuleo durante la producción, transporte, proceso y venta.

1.3 Contaminación inicial

La contaminación inicial tiene su origen intrínseco en el estado del animal y su ubre. Esta contaminación puede ser a través de dos vías:

1.3.1 Vía ascendente (Microorganismos de origen mamario)

Aunque la leche se obtiene por vacas sanas y en las mejores condiciones asépticas, es raro que sea enteramente

estéril, debido a la anatomía de su ubre (conductos gruesos y poco ramificados que facilitan la penetración de microorganismos por vía ascendentes. El microorganismo que más frecuentemente es posible hallar en las glándulas mamarias es el streptococus coryne bacterium, que rara vez supere los 1000 microorganismos por milímetro.

1.3.2 Vía endógena

Las glándulas mamarias son posibles de infectarse con microorganismos provenientes de la sangre del animal. Entre estos están el Mycobacterium tuberculosis causante de tuberculosis en el hombre; también puede hallarse la Brucellosis causantes de brucelosis en el hombre y provocan abortos en las vacas. El Mycobacterium tuberculosis es muy resistente en medios ácidos y es bastante termoresistente y por eso que el estudio de la pasteurización se hacen basados en la resistencia térmica de este microorganismo.

1.4 Contaminación externa:

Los orígenes de la contaminación externa hay que buscarlos en la ordeña, el medio ambiente, la limpieza del animal, limpieza y salud del personal que trabaja, limpieza de máquinas, equipos y utensilios utilizados y en la calidad del agua. (2)

Se han establecido diferentes métodos para examinar la leche y su calidad, entre estos método encontramos: La Prueba

de Reductasa, el Recuento Total de Bacterias Existentes en la Leche y Determinación Cualitativa y Cuantitativa de Coliformes. (1)

Prueba de la Reductasa: Esta prueba se utiliza para verificar el tiempo de durabilidad de la leche pasteurizada en estado de refrigeración adecuado y se le llama prueba de la reducción por el azul de metileno, dicha prueba se basa en que la leche es ligeramente oxidante cuando reacciona químicamente, la leche pasteurizada es sometida a un calentamiento uniforme a temperatura comprendida entre 72 y 78°C durante no menos de 15 segundos lo que asegura la destrucción de gérmenes patógenos y casi totalidad de la flora microbiana.(3) Las bacterias al crecer y funcionar, usan el oxígeno que se halla disuelto o ligeramente combinado en la leche, reduciendo de esta manera el EH que es el potencial de reducción de oxidación. (4)

El tiempo transcurrido para el cambio de color depende del número de bacterias existentes. Las bacterias necesitan oxígeno para respirar y el uso del oxígeno hace cambiar el color del azul de metileno. La velocidad o tiempo que necesita el cambio de color, está determinado por la población de bacterias en la leche, el consumo de oxígeno y la velocidad de multiplicación de esas bacterias. (5)

Se puede medir utilizando un indicador en el cual la leche cambia de color dentro de los límites de Eh +0.05 a +0.15. Dicho indicador es de azul de metileno, el cual se torna azul en un estado de oxidación e incoloro en un estado de reducción. (6)El indicador es decolorado por algunos microorganismos presentes en la leche, se ha relacionado con el tiempo de decoloración con la carga microbiana así:

1a clase excelente, no se decolora en 8 horas2a clase buena, se decolora entre 6 y 8 horas 3a Clase regular, se decolora entre 2 y 6 horas 4a Clase mala, se decolora en menos de 2 horas

Recuento Total de Bacterias Existentes en la Leche: El número total de microorganismos que se encuentran presentes en la leche es un indicativo de las condiciones sanitarias de manejo, procesamiento, producción y conservación. Los recuentos bacterianos en la leche cruda muy altos son indicativos de contaminación durante las operaciones de ordeño, manipulación o almacenamiento o también la temperatura de refrigeración insuficiente para evitar el crecimiento microbiano. Los valores que se obtienen en los recuentos bacterianos de estos productos se toman como base para su clasificación en diferentes grados de calidad. (7)

El método utilizado es macroscópico, universalmente utilizado para determinar en forma aproximada la carga bacteriana. Esencialmente consiste en determinar el número de colonias que se desarrollan cuando se siembra una cantidad medida o pesada de muestras, en placas de agar preparadas bajo condiciones estipuladas, a objeto de obtener reproductividad en los resultados. (8)

Esta tabla muestra las características microbiológicas que debo cumplir la leche para poder salir al consumo humano.

Indices permisibles

n m M c

Rto. Microorganismos mesofilos ufc/ mi

3 40000 80000 1

Rto. Coliformes ufc/ mi

3 Menor de 1

10 1

Rto. Coliformes Fecales ufc/ mi

3 Menor de 1

- 0

Tabla tomada del decreto 616 del 6 de Febrero del 2006

Este método consiste en hacer diluciones de leche cruda en solución salina peptonada (SSP) y luego sembrar en cajas de Petri en agar-agar cuenta gérmenes el cual sirve para determinar el número total de bacterias que existen en una muestra, cada célula se dividirá en sus múltiples alrededores para producir colonias separadas en el agar y cada célula es llamada unidad formadora de colonias (UFC). Después de la incubación, el número de colonias se reflejará en el número de células UFC originalmente

presentes, después se debe realizar el recuento de las colonias observadas las cuales permiten obtener el número de unidades formadoras de colonias por mililitro o gramo de la muestra. (9)

Determinación cualitativa y cuantitativa de coliformes: La presencia de coliformes en una muestra de leche nos indica contaminación fecal. La E. coli ha sido considerada como un indicador de dicha contaminación. Este análisis consta de tres pruebas: Presuntiva, confirmativa y completa. (1)

Las pruebas de fermentación presuntivas, para establecer la presencia de coliformes en la leche y derivados. Cuando se requiere confirmar la evidencia obtenida en una prueba presuntiva sobre la posible presencia de bacterias coliformes, se acostumbra continuar el análisis con una prueba confirmativa. Cuando se quiere comprobar definitivamente la presencia de los coniformes confirmados mediante las pruebas anteriores, el análisis puede continuarse con las llamadas pruebas completas. Estas prueban son necesarias cuando aún existe cierta duda sobre la identidad de las colonias aisladas.(2)

Los métodos utilizados para determinar las bacterias presentes en la leche cruda fueron macroscópicos. Se utilizaron los siguientes tipos de agar:

Agar EMB (Eosina azul de metileno): Compuesto por peptona, fosfato dipotásico, lactosa, eosina azul de

metileno, agar y agua destilada. Su uso es prácticamente el mismo del agar MacConkey. El azul de metileno actúa como indicador e inhibidor al mismo tiempo. Las colonias fermentadoras de lactosa presentan un tono violeta más o menos intenso. Por ejemplo Escherichia Coli origina colonias muy oscuras, frecuentemente con brillo verde metálico que facilita su detección en aguas contaminadas con materias fecales. (10)

Agar desoxicolato lactosa (DLA): Es enriquecido con lactosa y dexocicolato, es selectivo ya que favorece el crecimiento de coliformes y diferencial porque permite diferenciar las bacterias de colonias coliformes (color rojo oscuro) de otras bacterias que pueden crecer en el medio de cultivo, permitiendo hacer el recuento de colonias rojas pertenecientes al grupo coliformes. (11)

Caldo Lactosa Bilis Verde Brillante (CLBVB): Selecciona bacterias del grupo coliforme, posee bilis que inhibe las bacterias Gram positivas y lactosa que favorece el crecimiento de los coliformes que fermentan la leche en 48 horas a 32 o 35ºC, formando ácido y gas el cual es recolectado en los tubos de fermentación, demostrando el crecimiento de las bacterias coliformes. (2)

METODOLOGIA

En este laboratorio se utilizó la leche pasteurizada y cruda como principal material, para la realización de diferentes pruebas las cuales nos permitían analizar la leche en cuanto a su contenido microbiano.

En la prueba de la Reductasa desinfectamos la bolsa con leche pasteurizada y se tomó 10 ml de leche con una pipeta, dicha muestra fue puesta en un tubo de ensayo y posteriormente se le adiciono 1 ml de azul de metileno, la muestra fue llevada a una incubadora a 35°, para más tarde observar los cambios que se pudieran presentar.

En el recuento total de bacterias existentes en la leche utilizamos leche cruda, cuatro tubos con solución salina peptonada previamente rotulados y una caja de Petri. Se tomó con una pipeta 1 ml de leche y se adiciono al primer tubo-1, la pipeta empleada fue descartada y debimos tomar una nueva la cual empleamos para tomar 1ml de la dilución del tubo-1 y se agregó al tubo-2 así sucesivamente se repitió el mismo

procedimiento hasta la dilución del tubo-

4, se vertió 1 ml de la dilución del tubo -3 y del tubo-4 a una caja de Petri cada una, después se dejó enfriar el agar cuenta gérmenes a una temperatura que se resistiera en la muñeca y cuando esto ocurrió se adiciono este agar a las cajas de Petri que contenían la dilución de leche. Sobre la mesa se agitó suavemente en el sentido de las manecillas del reloj 3 veces y 3 veces en sentido contrario, también 3 veces en forma de un ocho.

Para la determinación cualitativa de coliformes se utilizaron 6 tubos de ensayo cada uno con 15ml de agar cuenta gérmenes estéril (CLVBB: Caldo lactosado verde bilis brillante) más campana de Durham, 5 pipetas de 1ml estériles, 1 ml de leche y un mechero.

Prueba presuntiva: Se hicieron diluciones de 1ml en cada tubo, y por cada dilución se utilizó una pipeta diferente. En total fueron 6 diluciones.

Prueba confirmativa: 48 horas más tarde los resultados salieron positivos, es decir, hubo producción de gas, así que se tomó una muestra de la dilución 10-1 y se sembró en agar EMB (eosina azul de metileno) utilizando el método francés y se incubo a 37ºC por 24 horas, para ver si la leche tenía presencia de E. coli.

Por otra parte, para la determinación cuantitativa de coliformes se utilizaron 3 tubos de ensayo cada uno con agar cuenta gérmenes (CLVBB: Caldo lactosado verde bilis brillante), mas campana de Durham, 2 pipetas, 1ml de leche, mecheros y 2 cajas de Petri estériles, asa de aro y desoxicolato-lactosa agar (DLA).

Se utilizó el mismo método de la prueba anterior, diluciones hasta 10-4.

Luego se tomó 1ml de cada una de las diluciones 10-3 y 10-4 y de cada una se sembró un cultivo en agar DLA. Se incubo a 37ºC por 48 horas.

RESULTADOS Y DISCUSION:

1. Prueba de la reductasa

En esta prueba después de preparar la dilución y llevar la muestra tomada a incubación, observamos por 1 hora con intervalos de 15 minutos el indicador de azul de metileno para garantizar la presencia o no presencia de bacterias en la leche, lo cual fue negativo puesto que

durante este tiempo no hubo ningún cambio de color, siguió manteniendo el mismo azul que da el indicador lo que nos lleva a señalar que no hay una carga micro bacteriana mayor.

2. Recuento total de bacterias existentes en la leche

En el agar DLA con dilución de 10-3 se encontraron 53 mesofilos grandes, circulares, con elevación plana y de color blanco, también se pudo observar 225 mesofilos pequeños los cuales eran fusiformes, con elevación plana y de color blanco.

En el agar DLA con dilución de 10-4 se encontró un filamentoso grande con elevación plana, borde crenado y de color blanco, 16 circulares con borde entero, elevación plana y de color blanco, también un puntiforme con borde entero, elevación plana y color blanco y por ultimo 6 fusiformes, con elevación plana, borde entero y de color blanco.

El recuento total de la muestra 10-3

arrojo 278.000 mesofilos por 1 ml de leche y el de 10-4 230.000 mesofilos por 1ml de leche, según el decreto 616 del 2006 establecido para la leche, la muestra obtenida sobrepasa el rango el cual se encuentra entre 40.000 y 80.000 teniendo en cuenta que dicho aplica para la leche pasteurizada, con esto concluimos que la leche cruda no es apta para el consumo humano debido a la cantidad de mesofilos encontrados.

3. Determinación cualitativa de coliformes

3.1 Prueba presuntiva:

Se revisaron los resultados 48 más tarde y se observó:

10-1: Burbujas en la superficie y precipitado

10-2: Burbujas en la superficie y precipitado

10-3: Burbujas en la superficie y precipitado

10-4: Burbujas en la superficie y precipitado

10-5: Burbujas en la superficie, precipitado y producción de gas

10-6: Burbujas en la superficie, precipitado y producción de gas

Estos resultados nos dicen que la prueba presuntiva salió positiva ya que hubo producción de gas y burbujas en la superficie. Lo que significa que hay una gran posibilidad de que la muestra de leche utilizada tenga presencia de E.coli

3.2 Prueba confirmativa

Los resultados de la muestra tomada de la dilución 10-1 y sembrada en agar EMB dio positivo, la bacteria E.coli creció presentando un brillo verde con negro producido por miembros que fermentan ávidamente lactosa.

La colonia de Scherichia coli presentó las siguientes características:

Forma Puntiforme

Color Verde brillante y negro

Borde Entero

Elevación Convexa

4. Determinación cuantitativa de coliformes

Se revisaron los resultados 48 más tarde y no observó presencia de coliformes.

Según la prueba confirmativa de coliformes, se deduce que durante la siembra de este cultivo hubo algún error técnico o de instrumentos, ya que debía dar positivo y dio negativo.

BIBLIOGRAFIA:

1- Gustavo García; Luis Fernando Velásquez V; Guillermo Gómez G; Fabio Pineda G; Yamillé Saldarriaga O. Manual de Laboratorio de Microbiologia General. Medellin: universidad de atioquia. REIMPRESOS.2010.

2- Gustavo Fernando Merli, Nestor Omar Ricciuti, Noelia Torres, Carlos A. Pistones, Roberto D’Elmar, Gabriel Mujica, José Luis Haure, Mauricio Celis, Daniel Juárez, Ma. Cecilia Montero. Seminario de Procesos

Fundamentales Físico-Químicos y Microbiológicos Especializacón y Maestría en Medio Ambiente Laboratorio de Química F.R. Bahía Blanca – U.T.N. 2009. Editorial de la Universidad Tecnológica Nacional – edUTecNe. [internet]. [consultado 2014/02/20]. Disponible en: http://www.edutecne.utn.edu.ar/sem_fi_qui_micrb_09/microbiologia_leche.pdf

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4- Propuesta integral para el mejoramiento de calidad de la leche; Maga, Fonagro, Gstl, Iica; 1998.[internet].[consultado 2014/02/20].Disponible en: http://books.google.com.co/books?id=v4YqAAAAYAAJ&pg=RA1-PA69&dq=prueba+de+la+reductasa+azul+de+metileno&hl=es&sa=X&ei=kjgFU86xCoTIkAf2koHICw&ved=0CDsQ6AEwAw#v=onepage&q&f=false

5- El queso maduro y sus secretos ; H Torres Egas; Prodar; Peru 2001.[internet].[consultado 2014/02/20]. Disponible en:

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10- García Martos P, Fernández del Barrio M. T, Paredes Salido F; Microbiología Clínica Practica; 2 ed. [internet]. [consultado 2014/02/20]. Disponible en: http://books.google.com.co/books?id=4N8qVKckrUUC&pg=PA59&lpg=PA59&dq=agar+nutritivo&source=bl&ots=MzpORnHtoh&sig=RJfj5PaPQnO8zC14atA0RYHJHtk&hl=es-419&sa=X&ei=fIP1Up-JFe3gsASquIGgAw&ved=0CD8Q6AEwBTgK#v=onepage&q=agar%20nutritivo&f=false

11- Hugo Humberto Montoya Villafañe. Microbiología básica para el área de la salud y afines. 2.a edición. [internet]. [consultado 2014/02/20]. Disponible en: http://books.google.com.co/books?id=5RjS6B0X5RgC&pg=PA75&d

q=agar+dla&hl=en&sa=X&ei=R6MHU5GmGoW-sQSAn4CQDA&ved=0CCoQ6AEwAQ#v=onepage&q=agar%20dla&f=false