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ANLISIS BACTERIOLGICO DE AGUAS RESIDUALES RIVERA DEL RIO

TOROCOCHA

EJECUTORES:

CALLA PAMPA, Tania, CONDORI CHAMBI, Eliana, GUTIRREZ SALAS Edith Nlida. MOLINA COAQUIRA Yelka, TORRES VEGA, Alex Fabricio, TORRES MAMANI, Marco, VIZCARRA HUANCAPAZA, Agustn

RESUMEN: La prctica tuvo como escenario el laboratorio de la Universidad Andina Nstor Cceres Velsquez Juliaca, cuyo objetivo general es Determinar la presencia de microorganismos aerobios o coliformes totales y fecales en aguas residuales muestra tomada en el punto N 3 (Buzn de

Desage) a riveras del Rio Torococha, para llevar a cabo este

anlisis empleamos las tcnicas del nmero ms probable

(NMP) o tubos mltiples de fermentacin y las respectivas normas establecidas, del cual obtuvimos como resultado la no

existencia de coliformes totales y fecales en el punto de la muestra tomada.

Empleando para ello los siguientes materiales: Matraz Erlenmeyer de 250 ml, Pipetas de 5 ml, Bureta de 100 ml, tubos de ensayo, tubos durjan. El trabajo fue desarrollado en

4 fases, iniciando con la esterilizacin de los materiales y los equipos a emplear, aplicando para ello las normas de

bioseguridad tomamos la toma de muestra en el punto N 03 (Buzn de Desage) ubicada a la rivera del Rio Torococha,

para luego realizar los respectivos anlisis bacteriolgicos en 3 pruebas: Pruebas Presuntiva, confirmativa,

complementaria, esta ultima no la realizamos debido a que en las 2 fases anteriores obtuvimos como resultado la no

presencia de coliformes.

PALABRAS CLAVE: Microorganismos, agua, coliformes totales, coliformes termotolerantes, bioseguridad,

ABSTRACT

The practice took place at the laboratory of the Universidad

Andina "Nestor Caceres Velasquez" - Juliaca, whose overall objective is to determine the presence of aerobic

microorganisms and total and fecal coliforms in wastewater sample taken at point No. 3 (Box Drain) to banks of the Rio

Torococha to carry out this analysis we use the techniques of

most Probable Number (MPN) or multiple tube fermentation and the respective standards, which we obtained as a result

of the absence of total and fecal coliforms at the point of the sample taken.

Employing the following materials: 250 ml Erlenmeyer flask, 5 ml pipettes, 100 ml burette, test tubes, pipes Durjan.

The work was developed in 4 phases, starting with the sterilization of materials and equipment to be used, applying the standards of biosecurity take the sample at point No. 03

(Box Drain) located on the banks of the Rio Torococha, then perform the respective bacteriological analysis in 3 tests:

presumptive, confirmatory, complementary, the latter did not perform because in the previous 2 phases obtained as a result

the non-presence of coliforms.

KEY WORDS: organisms, water, total coliforms, thermotolerant, lactose broth and lauryl sulfate broth.

I) INTRODUCCIN

La contaminacin existente en el Rio Torococha la misma que esta ubicada en la ciudad de Juliaca, que en sus inicios pues era un rio lleno de vida y no como lo vemos actualmente un rio muerto, totalmente contaminando con residuos solidos, orgnicos y otros, lo cual causa un gran problema social, ya que genera malestares a la poblacin juliaquea, ms que todo a los moradores o vecinos que viven en sus riveras. Creemos que esos pobladores se han acostumbrado a vivir y son parte de esta contaminacin, esto lo decimos por que durante el trabajo de campo observamos que estos usan las riveras del rio como letrina as como tambin desechan sus residuos solidos en ella, esta problemtica pues pareciera no importar a nadie ya que ni las autoridades toman cartas sobre el asunto. Sabemos tambin que la disposicin no controlada de estos residuos puede crear problemas tales como contaminacin de aguas subterrneas, contaminacin atmosfrica y diversas enfermedades.

En los ltimos aos se han desarrollado nuevas tcnicas basadas en la utilizacin de medios de cultivo que eleva la sensibilidad y la rapidez de deteccin de los microrganismos en agua. La deteccin y cuantificacin de coliformes totales y E. coli como microrganismos indicadores de contaminacin fecal tiene gran importancia en el control microbiolgico de la calidad sanitaria de las aguas. Es anlisis bacteriolgico de las aguas es llevado a cabo por el mtodo del numero ms probable o tubos mltiples de fermentacin, todo ello basado en la capacidad que tiene los microrganismos coliformes de producir cido y gas a partir de la

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lactosa, empleando para la deteccin directa de estos microrganismos medios de cultivo, los cuales contienen sustratos que son utilizados por enzimas especificas del grupo coliformes y E.coli respectivamente. Este mtodo es altamente especfico y senible, adems de brindar la posibilidad de ofrecer los resultados en solo 24h. Por ello el presente trabajo tiene como objetivo determinar la presencia de microrganismos aerobios o coliformes totales y fecales en aguas residuales en el punto N 3 (Buzn de Desage) en rivera del rio torococha mediante la tcnica de tubos mltiples de fermentacin utilizando como medio de cultivo (Caldo lauril sulfato, Caldo Bilis Verde Brillante y caldo EC) en aguas contaminadas.

Los coliformes son una familia de bacterias que se encuentran comnmente en las plantas, el suelo y

los animales, incluyendo a los humanos. El grupo de bacterias coliformes incluye a las aerbicas y a las

anaerbicas facultativas, bacilos Gram negativos no esporulados que fermentan la lactosa con formacin de

gas despus de 48hr de incubacin a 37C. La presencia de bacterias coliformes en el suministro de agua es

un indicio de que el suministro de agua puede estar contaminado con aguas negras u otro tipo de desechos

en descomposicin.

Generalmente, las bacterias coliformes se encuentran en mayor abundancia en la capa superficial del agua o

en los sedimentos del fondo. Los coliformes fecales, que se encuentran en los intestinos de los humanos y

otros animales de sangre caliente, son un tipo de bacterias coliformes. Se pueden hacer pruebas

especficamente para coliformes fecales o para el total de bacterias coliformes que incluye todos los tipos de

bacterias coliformes y que puede indicar contaminacin fecal. Los niveles recomendados de bacterias

coliformes fecales segn las normas establecidas por los Estndares de Calidad Ambiental son:

o Agua Potable: menos de 0 colonias por 100 ml de la muestra de agua

o Natacin: menos de 200 colonias por 100 ml de la muestra de agua

o Navegar/Pescar: menos de 1,000 colonias por 100 ml de la muestra de agua

II) OBJETIVOS

Objetivo General

Determinar la presencia de microrganismos aerobios o coliformes totales y fecales en aguas

residuales en el punto N 3 (Buzn de Desage) a rivera del rio torococha, mediante el mtodo

del nmero ms probable o tubos mltiples de fermentacin.

Objetivos Especficos.

Determinar la cantidad de microrganismos coliformes totales, fecales y Escherichia coli

presentes en el agua residual del punto N 3 (Buzn de Desage) a rivera del rio

Torococha a travs del mtodo del numero ms probable o tubos mltiples de

fermentacin.

Diferenciar los organismos coliformes totales de los microorganismos coliformes

fecales.

Evaluar la calidad sanitaria de muestras de agua mediante la bsqueda de

microorganismos coliformes totales, coliformes fecales y Escherichia coli.

Organizar e interpretar los resultados.

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III) MATERIALES:

EQUIPOS:

Autoclave Horno Balanza

MATERIALES:

Matraz Pipeta Tubos de ensayo Pipetas bacteriolgicas para distribuir 10 ml, con tapn de algodn. Las pipetas

pueden ser graduadas en volmenes iguales a una dcima de su volumen total. Frascos de vidrio de 250 ml con tapn de rosca. Tubos de cultivo 20 x 200 mm y de 16 x 160 mm con tapones metlicos o de rosca. Campanas de fermentacin (tubos de Durham). Pipetas bacteriolgicas graduadas de 10 y 1 ml. Gradillas Asa de platino

REACTIVOS:

Caldo lauril sulfato Caldo verde bilis brillante Caldo EC Agar Mc

IV) METODOLOGA

1. EQUIPO DE SEGURIDAD PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO

As como se deben de contar con normas de seguridad e higiene en un laboratorio, de igual manera

se debe de contar con un equipo de seguridad para el trabajo, a continuacin mencionamos algunos

elementos indispensables para la seguridad en el laboratorio:

Mandil manga larga, con botones o broches de presin. Se recomienda que sea

blanca.

Barbijo, protector facial transparente de 20 cm. de largo.

Guantes de ltex para manejar cidos dbiles y cetonas.

Guantes de PVC para manejar cidos y bases dbiles.

Gorras

2. MATERIALES MICROBIOLGICOS Y SU ESTERILIZACIN

Fundamento

Se define como esterilizacin al proceso que se lleva a cabo para la eliminacin o muerte de todos

los microrganismos que contiene un objeto o sustancia, y que se encuentran acondicionados de tal

forma que no pueden contaminarse nuevamente, para llevar a cabo esta accin existen distintos

procesos o mtodos; a continuacin se mencionamos el mtodo empleado por el grupo.

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Al aplicar a un determinado material vapor de agua a una presin de 15 lb (121C) por un tiempo de

15 minutos, se produce la destruccin total de los

microrganismos viables presentes en el mismo.

Esterilizacin por vapor

La esterilizacin por vapor a presin se lleva a cabo en una

autoclave. Estos equipos emplean vapor de agua saturado, a

una presin de 15 libras lo que esterilizacin usualmente es de

15 minutos a 121C, sin embargo, en algunas oportunidades,

dadas las caractersticas del material, es necesario variar el

tiempo de esterilizacin.

Equipo:

Autoclave

Materiales a esterilizar:

Matraces Erlenmeyer

Tubos de ensayo

Pipetas

Placas petri de vidrio

Campanas durham

Bureta

Frascos para toma de muestra

SUSTANCIAS:

Caldo nutritivo lauril sulfato

Composicin:

Cloruro de sodio (5g). Lauril sulfato de sodio (0.10g). Fosfato dipotsico (2.75g).

4Metilumbeliferil--D-glucornido (0.05g). Fosfato monopotsico (2.75g). Lactosa (5g). Peptona de

casena (20g). pH 6.8 0.2

Foto2. Material esterilizado

Foto 1. Auto clave, con materiales a esterilizar

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Caldo nutritivo verde brillante bilis

Bilis de buey deshidratada (20g). Peptona especial (10g). Lactosa (10g). L-Triptfano (1g).

4-Metilumbeliferil--D-glucornido (0.1g). Verde brillante (0.0133g). pH 7.2 0.2

Caldo nutritivo EC

Cloruro de sodio (5g). 4-Metilumbeliferil--D-glucornido (0.05g). Fosfato dipotsico (2.75g).

Peptona biotriptasa (20g). Fosfato monopotsico. (2.75g). Lactosa. (5g). Sales biliares (1.5g). pH 6.9

0.2

Medio Agar de Mac Conkey

Composicin: Peptona de casena (17g), peptona de carne (3g), lactosa (10g), mezcla de

sales biliares(1.5g), NaCl (5g), rojo neutro (0.03g), cristal violeta (0.001g), agar-agar (13.5g).

*pH (37C) = 7.1 0.1

Procedimiento y resultados:

Caldo nutritivo lauril sulfato

Rehidratar 35.65 g del medio en un litro de agua destilada. Reposar 10 a 15 minutos. Calentar

agitando frecuentemente hasta el punto de ebullicin durante 1 minuto para disolverlo por completo.

Distribuir en tubos de ensayo con campana de Durham, en volumen de 10 ml para muestras de 1 ml o

menos. Esterilizar en autoclave a 121C (15 lbs de presin) durante 15 minutos. Conservar antes de

utilizar, verificar que en la campana no existan burbujas de aire

Caldo nutritivo verde brillante bilis

Rehidratar 41.1 g del medio en un litro de agua destilada. Reposar 10 a 15 minutos. Calentar

agitando frecuentemente hasta el punto de ebullicin durante 1 minuto para disolverlo por completo.

Distribuir en tubos de ensayo con campana de Durham. Esterilizar en autoclave a 121C (15 lbs de

presin) durante 15 minutos. Conservar antes de utilizar, verificar que en la campana no existan burbujas

de aire

Caldo nutritivo EC

Rehidratar 37 g del medio en un litro de agua destilada. Reposar 10 a 15 minutos. Calentar

agitando frecuentemente hasta el punto de ebullicin durante 1 minuto para disolverlo por completo.

Distribuir en tubos de ensayo o frascos con campana de Durham. Esterilizar en autoclave a 121C (15 lbs

de presin) durante 15 minutos. Conservar antes de utilizar, verificar que en la campana no existan

burbujas de aire

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Medio Agar de Mac Conkey

Rehidratar 50.1 g del medio en un litro de agua destilada. Reposar 10 a 15 minutos. Calentar

agitando frecuentemente hasta el punto de ebullicin durante 1 minuto para disolverlo por completo.

Esterilizar en autoclave a 121C (15 lbs de presin) durante 15 minutos. Enfriar aproximadamente a

45C. Vaciar en cajas de Petri estriles.

3. TCNICAS Y MTODOS DE TOMA DE MUESTRA

Se debe de tomar en cuenta que los resultados de los anlisis dependen en gran medida de la buena toma de muestras, esta puede ser manual, es decir tomada por una persona o automtica, tomada por una maquina programada. Las tcnicas de muestreo varan dependiendo del lugar de donde se va a extraer la muestra:

Cuando se toma una muestra de un pozo se debe de enjuagar el envase con el agua del pozo 3 veces y se debe de dejar un espacio entre la muestra y la tapa del envase.

En pozos, se prende la bomba se deja trabajar, se apaga y se toma la muestra. En ros, se toma la muestra de la parte media de estos, lo mismo se realiza en el caso de lagos y lagunas.

De la llave, (de tuberas) se deja caer el agua unos segundos y se toma la muestra.

PARA ANLISIS MICROBIOLGICO

Deben ser Frascos de vidrio con tapn esmerilado, frascos estriles desechables o bolsas estriles con cierre hermtico y capacidad de 125 o 250mL.

ROTULADO

Para la identificacin de las muestras deben etiquetarse los frascos y envases con la siguiente informacin:

Nmero de control para identificar la muestra, independientemente del nmero de registro del laboratorio.

Fecha y hora de muestreo.

REGISTRO

Para el control de la muestra debe llevarse un registro en formato establecido previamente con los datos anotados en la etiqueta del frasco o envase, as como la siguiente informacin:

Identificacin del punto o sitio de muestreo. Temperatura del agua. pH. Cloro residual libre. Tipo de anlisis a efectuar. En su caso, reactivo empleado para la preservacin. Nombre de la persona que realiz el muestreo.

Los sellos de los envases deben de ser de plstico o adheribles. El muestreador debe de contar con una bitcora, que contenga los datos de las etiquetas.

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Cuando se reciben las muestras en el laboratorio, estas deben de ser registradas, indicando el tipo de anlisis que se va a llevar a cabo, y se designa el lugar de almacenamiento, ya sea en un refrigerador a 4C o en un almacn.

4. METODOLOGA PARA EL PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS

A continuacin indicamos las tcnicas bacteriolgicas que se utilizaron en la determinacin de coliformes totales y fecales en las muestras de aguas residuales tomadas en el punto n 3 buzn de desage

FUNDAMENTO:

La determinacin de microorganismos coliformes totales por el mtodo del Nmero ms Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo microbiano de fermentar la lactosa con produccin de cido y gas al incubarlos a 35C durante 48 h., utilizando un medio de cultivo que contenga sales biliares. Esta determinacin consta de tres fases, la fase presuntiva, fase confirmativa y la fase complementaria.

En la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril sulfato el cual permite la recuperacin de los microorganismos daados que se encuentren presentes en la muestra y que sean capaces de utilizar a la lactosa como nutriente. Durante la fase confirmativa se emplea como medio de cultivo caldo verde brillante bilis y el caldo EC el cual es selectivo y solo permite el desarrollo de aquellos microorganismos capaces de tolerar las sales biliares.

La determinacin del nmero ms probable de microorganismos coliformes fecales se realiza a partir de los tubos positivos de la prueba presuntiva y se fundamenta en la capacidad de las bacterias para fermentar la lactosa y producir gas cuando son incubados a una temperatura de 44.5 C por un periodo de 24 a 48 h.

Finalmente, la bsqueda de Escherichia coli se realiza a partir de los tubos positivos de caldo EC, los cuales se siembran por agotamiento en medios selectivos y diferenciales (Agar Mac Conkey) y posteriormente realizando tincin de gram.

MTODO DEL NMERO MS PROBABLE O TUBOS MLTIPLES:

El mtodo se basa en que las bacterias coliformes, fermentan la lactosa incubadas a 37C durante 24 a 48 horas, resultando una produccin de cidos y gas el cual se manifiesta en las campanas de fermentacin.

Foto: Punto n 3 buzn de desage toma de muestra

Foto. Muestra del agua residual - rotulada

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PROCEDIMIENTO;

90 ml de h2o

destilada

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10

-6 10-7

1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml

10ml 10ml 10ml 10ml 10ml 10ml 10ml

10-1 10-2

10-1 10-2

Caldo verde brillante

bilis al horno por 24

horas a 37C

Caldo EC en bao

mara por 24 horas a

44,5 C

MUESTRA

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Prueba Presuntiva:

1. Con los materiales esterilizados y la respectiva toma de muestra con las precauciones correspondientes, procedemos a realizar la primera fase del anlisis bacteriolgico.

2. Para preparar las diluciones se esterilizo 8 matraces con 90 ml de agua destilada y 10-7

tubos con el caldo Lauril sulfato como medio de cultivo, procedimos al cultivo con la muestra del agua problema

3. Seguidamente se procedi a preparar 21 tubos con 9 ml de agua destilada esterilizada y aadindole 1 ml de la muestra a cada tubo etiquetndolo con (10-1) y (10-2) y as sucesivamente hasta (10-7), cada tubo contiene tubos durhan invertidos.

4. Finalmente se coloco en la incubadora de marca Digisystem Laboratory a o 37 C por el tiempo de 48 horas.

Prueba Confirmativa:

Caldo verde brillante bilis

1. Se observo las muestras de la prueba presuntiva, de los cuales uno de los tubos (10-1) se muestra de color lechoso, se presume la presencia de coliformes.

2. En 6 tubos con 9 ml de medio de cultivo caldo verde brillante bilis con los respectivos tubos durham invertidos, procedimos a tomar la muestra de los resultados de la fase presuntiva esto se realizo con el aza de colli esterilizado el en mechero

Foto. Material esterilizado listo para el cultivo

con el caldo lauril sulfato

Foto2. Preparando con el medio de cultivo lauril sulfato

Foto2. Tubos

Foto2. Material esterilizado

Foto:

Foto2. Material esterilizado

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3. Finalmente se coloco en la incubadora de Digisystem Laboratory a 37C por el tiempo de 24 horas obteniendo del cual negativos en todos.

Caldo EC

1. En 6 tubos con 9 ml de medio de cultivo caldo EC con los respectivos tubos durham invertidos, procedimos a tomar la muestra de los resultados de la fase presuntiva esto se realizo con el aza de colli esterilizado el en mechero.

2. Finalmente se llevo a bao mara a una T 44,5C por el tiempo de 24 horas obteniendo como resultado negativo en todos.

V) RESULTADOS

Los resultados que obtuvimos negativos tanto en la determinacin de coliformes totales como fecales: Prueba presuntiva: En el primer grupo de 3 tubos 10-1 aparecido un viraje del color debido a la produccin de cido y en la

campana Durhan puede apreciarse con gas en su interior, pero en el resto del grupo todos negativos.

Los resultados son positivos en 1 de los 7 primeros grupos de tubos; con estos datos vamos a las tablas

del nmero ms probable (NMP) y tenemos: 4 M.P.N. por cada mL de agua problema. Como sta

prueba ha sido positiva, realizaremos las pruebas confirmativas, de haber resultado negativas las

primeras, damos por terminado el anlisis.

Foto2. Material esterilizado

Foto2. Material esterilizado

Foto2. Material esterilizado

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Prueba confirmativa: La siembra en los 7 tubos de ensayo con verde brillante bilis. Tras la incubacin a 37 C y con el caldo

EC en bao mara por 48 horas a una temperatura de 44,5C, en estas pruebas los resultados obtenidos

fue negativo

No se present formacin de colonias en nuestra muestra por lo tanto: