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INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL
CENTRO DE DESARROLLO DE PRODUCTOS BIOTICOS
Establecimiento de un cultivo de célulastransformadas de en suspensión
para la producción de triterpenosGalphimia glauca
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
DOCTORADO EN CIENCIAS EN DESARROLLO DE
PRODUCTOS BIOTICOS
ANABEL ORTIZ CALTEMPA
T E S I S
P R E S E N T A
YAUTEPEC, MOR. MAYO 2008
El presente trabajo se llevó a cabo en el
Departamento de Biotecnología del Centro de
Desarrollo de Productos Bióticos del Instituto
Politécnico Nacional y en el laboratorio de
biotecnología de plantas Medicinales, del Centro
de Investigaciones en Biotecnología, de la
Universidad Autónoma del Estado de Morelos
bajo la dirección de los doctores: Maria Luisa
Villarreal Ortega y Mario Rodríguez Monroy.
RECONOCIMIENTOS
A la Universidad Autonoma del Estado de Morelos y en particular al Centro de
Investigación en Biotecnología por el apoyo para realizar los estudios de
Doctorado.
Al Instituto Politécnico Nacional, en particular al CEPROBI, por permitirme ser
un estudiante con lucha y superación académica como lo caracteriza la
excelencia de este centro universitario.
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) (proyectos 43861-Z
y al proyecto CONACYT Ciencia básica (proyectos 59608), así como a la
Secretaria de Investigación y Posgrado del IPN (proyecto 20080146) que
financiaron este trabajo.
Al Programa Institucional de Formación de Investigadores (PIFI), por la beca
que me otorgó para la realización de la tesis.
Al Dr. Jorge Luis Folch Mallol por apoyarme y permitirme trabajar en su
laboratorio la parte Molecular.
Al Dr. Jesús Arellano García por el apoyo cuidadoso y critico en la realización
del Southernt blotting.
A la Téc. académica Lucero Valladares por su apoyo en la realización de este
trabajo.
A mi gran amiga la maestra Laurita Lina por todos sus consejos, paciencia y
principalmente por su gran amor que le caracteriza, AMIGA al fin lo logramos.
A mis compañeros estudiantes del CEPROBI, en particular a Norma y Paúl,
con los que estudié mí último semestre y me enseñaron a trabajar con una
sonrisa siempre.
A cada uno de mis amigos y compañeros del laboratorio de Biotecnología de
Plantas Medicinales, que aportaron un granito de arena para que realizará y
concluyera esta etapa de mi vida en el Doctorado, Deniker, Caleb, Jannet,
Yeni, Kely, Miguel, Rigo, Ivan, Talia, Norma, Jorge, Josué, chavos gracias.
A mi gran amigo Chimal por todos sus consejos y por ese cafecin que siempre
fue y es oportuno.
A mis amigos de siempre, Aurora, Marcelo, Victor Bores, Rita, Esther,
Vero, Adriana, Myriam, Angelitos, Laurita y José Luis por su amistad
sincera y por su apoyo en todos los sentidos Gracias.
En particular dedico este trabajo al Dr. Eduardo Aranda, a ti querido
hermano que me apoyaste siempre que te necesite, aunque me abandonaste
para convenirte en mi angelito, gracias Lalito (Lalombriz) por cada uno de
tus consejos, regaños, pero sobre todo por ese gran amor que me diste y te
caracterizo como mi amigo siempre. Si persistí y aquí esta mi doctorado. A
TU MEMORIA AMIGO.
A MI MOTORCITO
ALAN DANIEL ORTIZ CALTEMPA
A TI HIJO QUE ERES MI VIDA Y EL MOTIVO
MÁS GRANDE DE MI EXISTENCIA
A MIS PADRES
DAVID ORTIZ RIOS Y CASILDA CALTEMPA JAREZ
QUE SON MI HORGULLO Y EL EJEMPLO A SEGUIR.
GRACIAS PAPAS LOS AMO.
A MI EQUIPO DE FUTBOL, MIS 11 HERMANOS
Mere, Chayo, Chole, Chucho, Luisa, Victor, Vivis, Tere,
Ramón, Chino y Layo gracias hermanos por entenderme
y por respetarme en mis decisiones, pero sobre todo por
su apoyo gracias a cada uno de ustedes, los amo mucho.
A
Todos y cada uno de mis sobrinos, que de una u otra forma
colaboraron en esta etapa de mi doctorado, motivándome,
cuidando a mi hijo Alan, soportando mis regaños y mis ausencias
cuando me requerían para sus pachangas, porque tenía trabajo
en el laboratorio. LOS AMO CHIQUILLOS.
A
Sara V, Lidia, Lupe, Silvia, Sara C. Mary, Delia, Gama, Mundo y
Gero cuñados gracias por todo su apoyo.
Indice
INDICE CONTENIDO No. de
Página
i INDICE DE FIGURAS I
ii INDICE DE TABLAS III
iii SIMBOLO Y ABREVIATURAS IV
iV RESUMEN VI
V ABSTRACT VII
1 INTRODUCCION 1
2 ANTECEDENTES 3
2.1 Plantas medicinales con actividad sedante 3
2.2 Terpenos 3
2.3 Biosíntesis de los terpenos 4
2.3.1 Biosíntesis de los nor-friedelanos de la familia Malpighiaceae 7
2.4 El uso de la biotecnología para producir metabolitos secundarios
vegetales
9
2.4.1 Cultivos de células, tejidos y órganos vegetales 9
2.4.2 Cultivos in vitro transformados 11
2.4.3 Comprobación molecular de la transformación genética 14
2.5 Galphimia glauca. 14
2.5.1 Estudios biotecnológicos de Galphimia glauca 17
2.5.2 Propuesta biogenética para la producción de nor-friedelanos en
Galphimia glauca
18
3 JUSTIFICACION 20
4 HIPÓTESIS 22
5 OBJETIVO GENERAL 22
6 OBJETIVOS PARTICULARES 22
7 METODOLOGIA 23
7.1 Obtención del material vegetal 23
7.2 Establecimiento de la línea celular GgBa sin la adición de
fitorreguladores
23
7.3 Viabilidad celular 25
Indice
7.4 Transformación genética. 25
7.4.1 Cepa bacteriana (Agrobacterium rhizogenes) 25
7.4.2 Comprobación molecular de la transformación genética 25
7.4.3 Extracción del ADN bacteriano. 25
7.4.4 Lisis celular 26
7.4.5 Extracción del ADN vegetal 26
7.4.6 Extracción de ADN total 26
7.4.7 Evaluación de la transferencia del T-ADN a G. glauca 27
7.4.8 Southern blotting 27
7.5 Análisis químico 28
7.5.1 Extracción de compuestos triterpenicos de cultivos en
suspensión en sobrenadante y biomasa
28
7.5.2 Métodos cromatográficos 28
7.5.2.1 Análisis de triterpenos por Cromatografía en Capa Fina (CCF) 28
7.5.3 Purificación de triterpenos por cromatografía en columna
abierta
29
7.5.4 Análisis de triterpenos por Cromatografía Líquida de Alta
Presión.
29
7.5.5 Purificación de los triterpenos 30
7.5.6 Análisis de triterpenos por Resonancia Magnética Nuclear
(RMN)
30
7.6 Establecimiento de parámetros cinéticos de crecimiento celular
y producción de triterpenos
31
7.6.1 Cinética de crecimiento de GgBa 31
7.6.2 Cultivo de células transformadas de Galphimia glauca en
biorreactor airlift de 2 l
31
8 RESULTADOS 33
8.1 Establecimiento de un cultivo de células en suspensión
transformado de Galphimia glauca
33
8.2 Comprobación de la transformación genética de la línea GgBa 35
8.3 Análisis químico de triterpenos presentes en el cultivo
transformado de GgBa
41
Indice
8.3.1 Triterpenos presentes en biomasa de la línea celular GgBa 41
8.3.2 Triterpenos presentes en sobrenadante de la línea celular GgBa 43
8.4 Parámetros cinéticos de crecimiento de la línea GgBa 49
8.4.1 Cinéticas de producción de triterpenos presentes en la línea
celular GgBa
50
8.5 Cultivo de células transformadas de Galphimia glauca en
biorreactor airlift de 2 L
52
9 DISCUSIÓN 55
10 CONCLUSIONES 61
11 PERSPECTIVAS 62
12 BIBLIOGRAFÍA 63
13 Anexo Articulo: Transformed Cell Suspensión Culture of
Galphimia glauca Producing Nor-friedelanes. Para ser sometido
a la revista Planta Médica (Thime publishers), Alemania.
67
I
i INDICE DE FIGURAS
Página
1 Rutas biosintéticas de isoprenoides. 6
2 Estructura química de nor-secotriterpenos (galfiminas)
de Galphimia glauca.
8
3 Estructura química del nor-friedelano glaucacetalinas
(A–C), R1 y R2 diferencias en los sustituyentes.
8
4 Mecanismo de la interacción de Agrobacterium con una
célula hospedera durante la transformación genética.
13
5 Propuesta biogenética para glaucacetalinas y galfiminas
de Galphimia glauca.
19
6 Cultivo de raíces transformadas de de Galphimia glauca
y la generación de callos.
23
7 Matraces con bafles, a la izquierda con 3 bafles laterales
y a la derecha el con 4 bafles inferiores.
24
8 Biorreactor airlift de 2 L para el cultivo de células en
suspensión de GgBa.
32
9 Callos de Galphimia glauca sin la adición de
fitorreguladores.
33
10 Cultivos en suspensión de GgBa sin fitorreguladores. 35
11 Perfil electroforético en agarosa mostrando el ADN
purificado de A. rhizogenes y Galphimia glauca.
36
12 Perfil electroforético de las amplificaciones de PCR de
los ADN de A. rhizogenes (ATCC 15834).
37
13 Amplificaciones por PCR de las muestras de ADN de
G. glauca (silvestre) y GgBa.
38
14 Amplificaciones por PCR de las muestras de ADN de
A. rhizogenes (para sonda marcada 32P).
39
15 Gel electroforético de agarosa con productos de ADN
digerido con tres enzimas y su autorradiografía de la
hibridación tipo Southern blotting del ADN genómico
de GgBa.
40
16 Cromatografía en capa fina de los extractos de biomasa 41
II
de GgBa y fracciones de columnas.
17 Cromatografía de la muestra purificada del extracto
AcOEt de biomasas.
42
18 Espectro RMN-1H del ácido maslínico (CDCl3, 500
MHz).
43
19 Cromatografía en capa fina de los compuestos presentes
en sobrenadante de la línea GgBa.
44
20 Cromatograma por CLAP de los extractos del medio de
cultivo de GgBa.
45
21 Espectro RMN-1H de glaucacetalina A (CDCl3, 500
MHz).
46
22 Cromatografía en capa fina de los compuestos
generados en sobrenadante del la línea GgBa.
47
23 Perfil cromatográfico del nuevo triterpeno en CLAP,
con un tiempo de retención de 35.2 minutos.
48
24 Espectro RMN-1H de Glaucacetalina D (CDCl3 500
MHz).
49
25 Cinética de crecimiento en un cultivo de células en
suspensión de GgBa en un régimen de lote, en ausencia
de fitorreguladores.
50
26 Cinética de producción de triterpenos producidos por la
línea celular GgBa
51
27 Células en suspensión de GgBa en biorreactor airlift de
2 L; con 2% g PF L-1 a 0.05 VVM.
53
28 Cromatograma en capa fina de los compuestos
generados en biorreactor airlift de 2 L, presentes en
sobrenadante del la línea GgBa.
54
29 Integración del nor-friedelano (glaucacetalina D) a la
propuesta biogenética de cultivos transformados de G.
glauca.
60
III
ii INDICE DE TABLAS
Página 1 Plantas transformadas genéticamente con Agrobacterium
y su incremento en la producción de metabolitos
secundarios.
12
2 Compuestos activos producidos por G. glauca Cav.
17
3 Diferentes antioxidantes sobre el crecimiento celular de
la línea GgBa.
34
4 Concentración de triterpenos presentes en el cultivo de
GgBa.
52
IV
iii SIMBOLO Y ABREVIATURA δ Desplazamiento químico en ppm µ Velocidad específica de crecimiento µl Microlitros µg Microgramos Ac- CoA Acetil coenzima A B5 Medio de cultivo Gamborg CCF Cromatografía en capa fina CDCl3 Cloroformo deuterado L Litros CHCl3 Cloroformo CH3CN Acetonitrilo CLAP Cromatografía Líquida de Alta Presión CO2 Bióxido de carbono COCH3 Grupo Acetato COSY Espectroscopía de correlación (Correlatión spectroscopy) d Doblete DEPT Exaltación por transferencia de polaridad (Distortionless
enhancement by polarisation transfer) EtOH Etanol GAP Gliceraldehído-3-fosfato GPP Geranilpirofosfato H2SO4 Acido sulfúrico Hin III Enzima de restricción Hz Herz IPP Isopentenilpirofosfato M Molar MEOD Metanol deuterado MeOH Metanol MEP 2.C-metil-D-eritriol-4-fosfato mg Miligramos min Minutos ml Mililitros MS Médio de cultivo Murashige y Skoog MVA Mevalonato NH2 Radical amino nm Nanometro OCH3 Grupo metoxilo OSCs Oxidoescualeno ciclasas PCR Reacción en cadena de la polimerasa ppm Partes por millón R-1000 Cepa Agrobacterium rhizogenes RMN Resonancia magnética nuclear rpm Revoluciones por minuto s Singuento SCs Ciclasa escualeno TBE Tris-boratos EDTA Td Tiempo de duplicación TE Tris-EDTA
V
UV Luz ultravioleta V Voltios GgBa Línea celular de células transformadas de Galphimia glauca VYT Línea celular de raíces transformadas de Galphimia glauca YEB Medio de cultivo extacto de levadura, bacto peptona 1H Protón 13C Carbono 13 PS Peso seco PF Peso fresco Tr Tiempo de retensión PVP Polivinil pirrolidona ATCC 15834 Cepa de colección de Agrobacterium rhizogenes pb Pares de bases nucleotídicas h Horas 32P Fósforo radioactivo GPP Geranilpirofosfato GGPP Geranilpirofosfato FPP Farnesil pirofosfato
Resumen
VI
iV RESUMEN
Galphimia glauca es una especie de interés medicinal que sintetiza triterpenos con
actividades sedante y ansiolítica. La producción controlada y homogénea de compuestos
se puede establecer utilizando cultivos de células en suspensión transformados
genéticamente, que crecen en ausencia de fitorreguladores exógenos. La generación de
dichos cultivos se logra por infección con bacterias Gram negativas del género
Agrobacterium. El objetivo del presente trabajo fue establecer un cultivo de células
transformadas en suspensión de G. glauca con la capacidad de sintetizar triterpenos del
tipo friedelano. El cultivo GgBa se generó a partir de callos de G. glauca que
crecieron en cultivos de raíces infectadas con Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834.
La comprobación de la transformación genética se realizó por análisis de PCR y
Southern blotting, que demostraron la incorporación del gen rol A al genoma vegetal.
La línea GgBa creció en medio MS sin fitorreguladores, presentando una velocidad de
crecimiento de 0.13 días-1 y generando una biomasa máxima de 24.3 g L-1. El cultivo
GgBa sintetizó los triterpenos: glaucacetalina A (GA) y ácido maslínico, reportados en
estudios previos, con una acumulación máxima de 2.89 mg L-1 y 2.4 mg L-1,
respectivamente. En adición, se aisló un nuevo triterpeno que fue denominado
glaucacetalina D (GD). La elucidación estructural de GD se realizó por técnicas de
espectroscópia y espectrométricas de alta resolución; la acumulación de GD fue de 2.9
mg L-1. Los triterpenos GA y GD fueron excretados al medio de cultivo, en tanto que el
ácido maslínico se recuperó de la biomasa celular. Los resultados de este trabajo
muestran el establecimiento de un cultivo de células transformadas de G. glauca que
biosintetiza glaucacetalina A y ácido maslínico; en adición a la glaucacetalina D, un
compuesto novedoso no reportado en cultivos de raíces transformadas, ni en la planta
silvestre.
Abstract
VII
V ABSTRACT
Galphimia glauca (Cav.) Kuntze, Malphigiaceae is a Mexican species with anxyolitic and
sedative properties that synthesizes a family of nor-friedelanes denominated as
galphimines. In order to induce higher production of the bioactive principles, transformed
calluses and cell suspension cultures of this species were established. The cell suspension
cell line GgBa was selected and grown in MS nutrient medium, in the absence of
phytohormones for a period of two years of continuous sub-culturing. PCR and Southern-
blot analyses were employed in order to confirm the integration of the rol A gene into the
plant genome. Batch cultures of the GgBa cell line were grown for 40 days in MS nutrient
medium, in the absence of phytohormones. First order growth kinetics was observed,
reaching a specific growth rate (μ) of 0.13 d-1. The production of glaucacetalin A, a
triterpenoid related to the known galphimines was quantified by HPLC in the nutrient
medium, whilst maslinic acid was identified in biomasses. The transformed cell suspension
culture GgBa also synthesized a novel nor friedelane which was named as glaucacetalin D.
The structural elucidation of glaucacetalin D was performed by the application of high
resolution spectroscopic and spectrometric techniques. This triterpene has never before
been observed in wild plant material or in other in vitro cultures. The triterpene production
of the cell line GgBa was as follows: glaucetaline A, 2.89 mg/L; glaucacetaline D, 2.9
mg/L and maslinic acid, 2.4 mg/g dry weight.
Introducción
1
1. INTRODUCCIÓN
Las plantas superiores representan un recurso natural renovable que ha sido
ampliamente explotado para la producción de principios terapéuticos. Se ha estimado
que cerca del 25 % de los fármacos convencionales expedidos como prescripciones
médicas en países norteamericanos (Estados Unidos y Canadá) contienen productos de
origen vegetal como sus agentes bioactivos (Cox, 1994, Fransworth, 1994, OMS,
2003). En los países en vías de desarrollo, como México, el empleo de las plantas
medicinales es una práctica habitual entre las comunidades indígenas, que se ha
difundido ampliamente entre diferentes sectores de la población de las zonas urbanas
(Lozoya, 1994). Estas prácticas se asocian con la amplia diversidad vegetal de nuestro
territorio y, al extenso conocimiento etnomédico de las culturas Mesoamericanas (Bye
et al., 1995). La riqueza etnobotánica de México se encuentra poco explotada desde el
punto de vista científico y ejemplos selectos de la literatura recientemente demuestran
el potencial terapéutico de la flora medicinal de nuestro país.
Las investigaciones con plantas contemplan un planteamiento experimental que
involucra la selección del material vegetal por criterios etnobotánicos y el empleo de
bioensayos para validar la actividad farmacológica de las fuentes vegetales empleadas
como materias primas (Mata, 1993, Berlin et al., 1996). Por otro lado, la utilización de
cultivos in vitro para la producción de fármacos vegetales constituye una tecnología de
vanguardia que ha ganado prestigio internacional, debido a la posibilidad de ser
aplicada a la mayoría de las especies vegetales y al potencial de algunos sistemas de
cultivos para la producción de principios terapéuticos de utilidad farmacéutica a una
escala industrial (Stafford et al., 1996). Estas tecnologías ofrecen beneficios importantes
ya que permiten la producción controlada y permanente de los principios biodinámicos
deseados y, en algunos casos, un incremento considerable en su productividad que
permite plantear esquemas de escalamiento en biorreactores (Wink, 1999).
La especie Galphimia glauca Cav. de la familia Malpighiaceae, es una planta que ha
despertado interés médico, debido a que es ampliamente utilizada como sedante en la
medicina tradicional mexicana (Tortoriello y Lozoya, 1992). Los estudios fitoquímicos
y farmacológicos realizados con esta especie señalan que los compuestos responsables
de la acción sedante son un grupo de nor-seco-triterpenos, que se han denominado
Introducción
2
galfiminas. De estas destacan la galfimina B (GB), la 6-acetixogalfimina B (GE) (Osuna
et al., 1999), y otras galfiminas activas denominadas GA, GJ y GF (Taketa et al., 2004,
González et al., 2005, Herrera-Ruíz et al., 2006. También se reporta en esta planta, la
presencia de otros triterpenos de origen nor-friedelanos con estructuras triterpénicas
semejantes a las galfiminas que se han llamado glaucacetalinas. Las glaucacetalinas solo
están presentes en cultivos de raíces pilosas y están involucradas en la vía de biosíntesis
de los nor-seco-friedelanos activos. Las galfiminas, pueden obtenerse de las partes
aéreas de la planta y a través de cultivos in vitro: como son cultivos de células en
suspensión y de raíces pilosas (Tortoriello y Lozoya, 1992, Osuna et al., 1999, Nader et
al., 2004).
Debido al potencial de uso terapéutico de G. glauca y a la necesidad de contar con una
producción homogénea de los principios sedantes, en este trabajo se planteó el
establecimiento de cultivos de células en suspensión transformadas (que no requieran la
adición exógena de fitorreguladores) productoras de triterpenos a partir de la planta
medicinal mexicana G. glauca.
Antecedentes
3
2. ANTECEDENTES
2.1 Plantas medicinales con actividad sedante
Tradicionalmente las plantas medicinales han sido agrupadas en función de su esfera de
acción para tratar diferentes padecimientos populares. En la literatura, se han descrito un
número interesante de plantas cuya función principal está enfocada al control de
desbalances en el sistema nervioso, efectos tranquilizantes, sedantes, ansiolíticos, y
tonificantes de los nervios. Ejemplos sobresalientes para tratar estos padecimientos los
constituyen: Panax ginseng, Hyperycum perforatum, Borrago officinalis, Ocimum
basilicum, Valeriana officinalis, Rosa canina, Pasiflora caeurulea, Tila auropeae,
Humulus lupulus, G. glauca (Calapai et al., 2007, Donald et al., 2007). De acuerdo con
los análisis fitoquímicos y de actividad biológica de algunas especies, se ha descrito la
presencia de triterpenos asociada al efecto farmacológico sobre el sistema nervioso
central.
2.2 Terpenos
Los terpenos constituyen la familia más grande de productos naturales; se han descrito
más de 22,000 compuestos de ésta clase (Connolly y Hill, 1991), que incluyen
compuestos con actividades farmacológicas importantes como son los esteroles,
saponinas, glucósidos cardíacos y terpenos modificados. Por su aplicación terapéutica e
industrial, los terpenos representan un grupo de suma importancia económica,
permitiendo realizar una continúa búsqueda e identificación de nuevas estructuras
(Devon y Scott, 1972, Glasby, 1982).
En las plantas, los terpenoides juegan diversos papeles funcionales, como son:
reguladores de crecimiento vegetal (giberelinas y ácido abscísico), pigmentos
fotosintéticos (fitol, carotenoides), portadores de electrones (ubiquinona,
plastoquinona), mediadores de ensamble de polisacáridos (poliprenilfosfatos), y
componentes estructurales de membrana. Además de estas funciones estructurales,
metabólicas y funcionales, muchos terpenoides intervienen en la comunicación y
defensa de las plantas; como atrayentes de polinizadores y dispersores de semillas,
fitoalexinas competitivas, antibióticos y toxinas repelentes (Harbone, 1991).
Antecedentes
4
Los terpenoides de origen vegetal representan un recurso natural renovable y
proporcionan un amplio rango de productos comerciales útiles, incluyendo: solventes,
saborizantes, fragancias, adhesivos e intermediarios sintéticos (Zinkel y Russell, 1989,
Dawson, 1994). También incluyen polímeros industrialmente (chicle), numerosos
fármacos (artemisina y taxol) y agroquímicos (piritrinas y azaridactinas).
En el campo farmacéutico, los terpenos tienen gran interés debido a sus propiedades
anticancerígenas (paclitabel), antimaláricas (artemisina), antiinflamatoria (cicloartenol)
y con actividad sedante (galfimina B, y galfimina E). El mecanismo de acción de estos
metabolitos es muy variado y pueden constituir segundos mensajeros, que al activarse
desencadenan una serie de eventos celulares. Por ejemplo, actúan incrementando la
concentración de AMP cíclico. Otros actúan a nivel de la adenilciclasa, e influyen en el
almacenaje o secreción de calcio, o bien activan a la proteína cinasa C (Toscano et al.,
1993, Tortoriello y Ortega, 1993, Ahumada et al., 1997, Hezari et al., 1997, Ferreira y
Janick, 2002, González et al., 2005).
2.3 Biosíntesis de los terpenos
La clasificación de los terpenos se basa en el número de unidades isoprenoides
presentes en su estructura, así tenemos C5 hemiterpenos, C10 monoterpenos, C15
sesquiterpenos, C20 diterpenos, C25 sesterpenos, C30 triterpenos, C40 tetraterpenos y C>40
politerpenos.
Todos los terpenos se unifican por su biosíntesis en un punto común: la fusión de
unidades de cinco carbonos (C5)n, a través de la condensación de dos estructuras
isoprenoides, el dimetilalildifosfato (DMAPP; unidad iniciadora) y el
isopentenilpirofosfato (IPP; unidad extensora).
La biosíntesis de terpenos puede estar dividida en diferentes procesos principales. El
primero involucra la conversión de acetil coenzima A (CoA) a la unidad activa
isopreno, isopentenil pirofosfato (IPP), a partir del cual y por acción de varias prenil
transferasas se generan precursores de mayor orden como geranil pirofosfato (GPP C10),
farnesil pirofosfato (FPP C15) y geranilgeranil pirofosfato (GGPP C20). Estos
intermediarios pueden autocondensarce para formar los precursores (C30 y C40) de
Antecedentes
5
esteroles y carotenoides respectivamente y también pueden ser utilizados en reacciones
de ciclización para crear los esqueletos parentales básicos de las diferentes familias de
terpenoides (Dewuick, 1997). En plantas, la biosíntesis de isoprenoides procede
mediante dos rutas independientes: a) la citosólica clásica acetato /mevalonato para la
biosíntesis de esteroles y sesquiterpenos; y b) la vía alternativa 1-deoxi-D-xilulosa-5-
fosfato (DOXP) para biosíntesis de isoprenoides plastídicos, tales como carotenoides,
fitol (una cadena lateral de clorofilas), mono y diterpenos (Figura 1). Ambas vías
forman la unidad de isopentenildifosfato (IPP) como el precursor a partir del cual se
forman otros isopreniodes, vía adición cola-cabeza (Lichtenthaler et al., 1997).
El primer compuesto reportado como precursor de los isoprenoides fue el acetato.
Posteriormente se observó que el ácido mevalónico (MVA) también es un precursor
clave de la ruta de biosíntesis de los terpenos. La vía clásica del acetato/MVA incluye la
condensación de tres unidades de acetil coenzima A para formar 3-hidroxi-3-
metilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) la cual, después de reducirse por 2 moléculas de
nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reducida (NADPH), produce ácido
mevalónico, que a su vez es transformado en isopentenildifosfato (IPP) bajo consumo
de tres moléculas de adenosin trifosfato (ATP) y pérdida de bióxido de carbono (CO2)
(Lichtenthaler et al., 1997).
Antecedentes
6
VIA MVA-CITOSOL VIA MEP-PLASTIDOS 2 Acetil CoA Acetil CoA Piruvato + Gliceraldehido 3-fosfato HMGS DXS 3S-Hidroxi-3-metilglutaril-CoA (HMG-CoA) 1-Deoxi-D-xilulosa 5 fosfato (DXP) HMGR DXR 3R-Acido mevalónico (MVA) 2-C-Metil-D-eritritol 4-fosfato (MEP) MK CMS Acido mevalonico-5-fosfato 4-(Citidina 5´- difosfo) 2-C-metil-D-eritrito (CDP-ME) MPK CMK
Mevalonato difosfato 4-(Citidina 5´- difosfo) 2-C-metil-D-eritritol-2-fosfato (CDP-MEP) MCS 2-C-metil-D-eritritol-2-4-ciclodifosfato (cMEPP) MDD HDS 1-Hidroxi-2-metil-2(E)-butenil-4-difosfato (HMBPP)
IDS IDS IPPi Isopentenil difosfato (IPP) Dimetilalil difosfato IPP (DMAPP) GPPS Geranil difosfato (GPP) Monoterpenos C IPP FPPS SES Sesquiterpenos C15 Farnesil difosfato (FPP) Triterpenos SQS IPP Escualeno C30 Esteroles DTS Carotenoides Geranilgeranil difosfato (GGPP) Fitoeno C40 IPP PYS Tetraterpenos GFPPS Geranilfarnesil difosfato (GFPP) IPP PPDPS Poliprenil difosfato
Figura 1. Rutas biosintéticas de isoprenoides. CMK, 4-(citidina 5´- difosfo)-2-C-metil-D-eritritol quinasa;
CMS, 2-C-metil-D-eritritol quinasa; CMS, 2-C-metil-D-eritritol 4-fosfato citidil transferasa; DTS,
diterpeno sintasa; DXR, 1-deoxi-D-xilulosa-5-fosfato reductoisomerasa; DXS, 1-deoxi-D-xilulosa 5-
fosfato sintasa; FPPS, farnesil difosfato sintasa, GGPPS, geranilgeranil difosfato sintasa; GFPPS,
geranilfarnesil difosfato sintasa; GPPS, geranil difosfato sintasa; HDS, 1-hidroxi-2-metil-2-(E)-butenil-4-
difosfato sintasa; HMGR, 3-hidroxi-3-metilglutaril CoA (HMG-CoA) reductasa; HMGS, HMG-CoA
sintasa; IDS, isopentenil difosfato/dimetilalil difosfato sintasa; IPPi; isopentenil difosfato isomerasa;
MCS, 2-C-metil-D-eritrol-2,4-ciclodifosfato sintasa; MDD, mevalonato difosfato descarboxilasa; MK,
mevalonato quinasa; MPK, mevalonato 5-fosfato quinasa; MDS, monoterpeno sintasa; PPDPS, poliprenil
difosfato sintasa; PYS, fitoeno sintasa; SES, sesquiterpeno sintasa; SQS, escualeno sintasa ( tomado y
modificado de Liu et al., 2005).
Antecedentes
7
2.3.1 Biosíntesis de los nor-friedelanos de la familia Malpighiaceae
Los nor-friedelanos representan un grupo de los terpenos que existen en la naturaleza
vegetal. Son un grupo de compuestos con estructuras modificadas de los derivados
pentacíclicos del escualeno, mediante la oxidación de los anillos del esqueleto
triterpénico básico. Así, los nor-friedelanos pierden el grupo metilo C-30 con respecto
al núcleo de ß-amirina original o su precursor más próximo, la friedelina. En los nor-
secofriedelanos, uno de los anillos se abre por oxidaciones posteriores y se puede cerrar
nuevamente, formándose una estructura característica llamada lactona, como ocurre en
las galfiminas (Taketa et al., 2004). La biosíntesis de estos terpenos modificados se
desconoce; sin embargo, se ha postulado que su formación podría implicar la acción de
una ciclasa que convierte al epoxiescualeno en 3ß-friedelanol y que éste a su vez, bajo
la acción de una oxidoreductasa específica, podría originar cada uno de los grupos de
terpenos modificados (Camacho et al., 2002; Corcino et al., 2000).
En la especie Galphimia glauca se han reportado nor-seco-triterpenos que fueron
aislados a partir de las partes aéreas de planta. Inicialmente se identificaron a la
galfimina B y 6-acetoxi-galfimina B, a ésta última se renombró como galfimina E (GE).
Más adelante se aislaron otros compuestos relacionados que se denominaron galfiminas
A, C, D, F, G, H, I. En adición, seis derivados sintéticos de G - E fueron obtenidos
mediante procedimientos de transformación química. En la figura 2 se ilustran estos
compuestos (Toscano et al., 1993, Goetz et al., 1998, Taketa et al., 2004).
Recientemente se identificaron tres nor-friedelanos llamados glaucacetalinas A, B, C,
que se producen a partir de raíces transformadas de G. glauca. Estos compuestos
presentan el mismo núcleo friedelánico identificado en las galfiminas aisladas de la
planta silvestre, que se caracterizan por tener un anillo adicional formado por un puente
acetálico cíclico, como se muestra en la figura 3 (Nader et al., 2004).
Antecedentes
8
Galfiminas
∆20(21) R1 R2
B H H
E OAc H
A OH H
D OH Ac
∆20(29)
F H H
G OAc H
H OH H
I OH Ac
∆19
C H H
Figura 2. Estructura química de nor-secotriterpenos (galfiminas) de Galphimia glauca.
R1 y R2 – radicales del anillo B correspondientes a cada galfimina; ∆x – posición del doble
enlace del anillo E.
Glaucacetalina A R1 = Ac R2 = H
Glaucacetalina B R1 = H R2 = Me
Glaucacetalina C R1 = H R2 = H
Figura 3. Estructura química de las glaucacetalinas (A–C), R1 y R2 diferencias en los
radicales.
M e O 2 C
H
O A c
H OHH O
A c O
O
H R2O
O H
2
4
23 24
10
8
7
25 12
26
15
18
20
29
Me 29
20
OH
22
28
18
16
C
O MeO
30 12
9 14
26 OR2
4
256 O
1 3
24 5
O
R1
H H
23OH
Antecedentes
9
2.4 El uso de la biotecnología para producir metabolitos secundarios vegetales
El conocimiento etnomédico y la popularidad de la herbolaria en el mundo actual,
confieren una dimensión importante a la demanda de las plantas medicinales en los
mercados nacionales e internacionales. Una alternativa para incrementar la producción
de biomoléculas activas reside en utilizar procedimientos biotecnológicos por cultivos
de células, tejidos y órganos que puedan ser altamente productoras. Esta estrategia
biotecnológica presenta ventajas considerables en relación a investigaciones
fitoquímicas convencionales, para el aislamiento de principios activos a partir de
plantas, ya que permite la producción controlada y permanente de los compuestos
deseados para su posterior escalamiento a biorreactores (Doran, 1993).
Desafortunadamente, aún son pocos los procesos comerciales que se han establecido por
cultivo de células para la producción de fármacos, debido principalmente a los bajos
rendimientos de los metabolitos secundarios en los cultivos y a la inestabilidad de
algunos sistemas de cultivo para la producción de estos compuestos; lo que los ha
convertido en procesos poco redituables desde el punto de vista económico (Constabel,
1989). Sin embargo, existen procedimientos que son actualmente utilizados para la
optimización de la productividad de algunos compuestos, entre los que se pueden citar:
la manipulación de nutrientes y fitorreguladores, la selección de líneas hiperproductoras,
el uso de elicitores como agentes estresantes, el empleo de sistemas de inmovilización
celular y de líneas celulares que incorporen genes seleccionados para la obtención de
cultivos de células, raíces y tejidos transformados genéticamente. Esta última
metodología ofrece posibilidades interesantes para incrementar la biosíntesis de
metabolitos secundarios. La transformación se basa en la infección de explantes con la
bacteria del género Agrobacterium, lo que permite obtener líneas que no requieren de la
adición de fitorreguladores y son estables genéticamente, además de mejorar el
crecimiento y la producción de metabolitos secundarios sin la necesidad de adicionar
fitorreguladores.
2.4.1 Cultivos de células, tejidos y órganos vegetales
El cultivo de tejidos vegetales tiene sus bases en el principio de la totipotencialidad, que
caracteriza a los tejidos vegetales. Este concepto se refiere al potencial que tienen las
Antecedentes
10
células y tejidos vegetales para formar todos los tipos celulares, y para expresar el total
de su potencial genético en la regeneración de una planta completa
A partir de los cultivos de callos y células en suspensión, se puede lograr la producción
de nuevos compuestos que en la planta de origen no se detectan, o bien el incremento en
la producción de aquellos que son sintetizados en bajas concentraciones. Aún cuando es
deseable contar con cultivos controlados, estos pueden presentar ciertas desventajas
como son las variaciones somaclonales y mutaciones que se acumulan a través de los
subcultivos y la baja o nula producción de los metabolitos de interés; por lo que en
ocasiones se prefieren los cultivos de tejidos organizados como son las raíces, las cuales
presentan un alto potencial biosíntetico. Sin embargo, los cultivos de raíces presentan
problemas importantes al intentar escalarlos a volúmenes mayores (Shuler y Hallsby,
1985). Por estas razones, los procesos comerciales que actualmente existen, incorporan
cultivos de células en suspensión.
Los cultivos vegetales varían en su capacidad para producir y acumular metabolitos
secundarios, esta capacidad esta determinada por el tipo de compuesto que sintetizan, el
tipo de cultivo, la línea celular y la especie. A lo largo del tiempo, se han implementado
diversas estrategias para incrementar la producción de los compuestos secundarios
como son: a) la estandarización de las condiciones de cultivo y las concentraciones de
los nutrientes, que suelen ser específicas de cada especie vegetal y en conjunto influyen
en la producción de los metabolitos secundarios; b) el establecimiento de sistemas de
inmovilización, que se refiere al confinamiento de células vegetales en geles o resinas.
Estos cultivos son usados en procesos de biotransformación y en estudios fisiológicos,
en muchos casos se favorece la síntesis de metabolitos secundarios y su excreción al
medio de cultivo; c) la aplicación de estrés biótico o abiótico al cultivo que con
frecuencia induce la síntesis de los compuestos de interés; los bióticos comprenden el
uso de estructuras celulares de hongos, bacterias, levaduras, y compuestos como el metil
jasmonato; los abióticos comprenden cambios de pH, temperatura, choques osmóticos,
entre otros (esta forma se ha presentado como una estrategia para aumentar el
rendimiento de compuestos bioactivos) (Eilet, 1987) y d) la sobreexpresión del cADN
en un sistema huésped apropiado que ha sido posible gracias a los avances recientes de
ingeniería genética y biología molecular. Todos estos procedimientos surgieron como
una alternativa viable para aumentar la síntesis de metabolitos secundarios, ya que una
Antecedentes
11
vez establecidos los sistemas de cultivos y regeneración, la transferencia génica
posibilita la obtención de vegetales transgénicos, que exhiban las características
deseadas (Hansen y Wright, 1999).
2.4.2 Cultivos in vitro transformados
Los estudios de transformación genética en plantas medicinales han abierto nuevos
caminos en el conocimiento y producción de estructuras químicas como alcaloides,
polifenoles, terpenoides y algunos compuestos nuevos que no son encontrados en la
planta silvestre, ni en cultivos in vitro no transformados. Para llevar a cabo la
transformación genética en plantas se han aplicado dos métodos diferentes. El primero,
es por vía directa, mediante la introducción de genes utilizando agentes físicos o
químicos; como la creación de poros utilizando rayos láser, la microinyección, la
sonicación y el bombardeo de genes o biobalística. El segundo método, es por
transformación indirecta mediada por agentes biológicos como virus ó bacterias como
son Agrobacterium rhizogenes y Agrobacterum tumefaciens, que de manera natural
insertan sus genes en el genoma de células vegetales, y que a nivel experimental han
proporcionado beneficios en la producción de compuestos secundarios que incluyen
terpenos, alcaloides, antocianinas y polifenoles (Tada et al., 1996, Birch, 1997, Zehra
et al., 1999, Xie et al., 2000, Luczkzkiewcz y Cisowski, 2001). En las plantas
medicinales se han realizado estudios de transformación genética utilizando A.
tumefaciens y A. rhizogenes como vectores. En la tabla 1 se muestran algunos ejemplos.
Antecedentes
12
Tabla 1. Plantas medicinales transformadas genéticamente con Agrobacterium y su
incremento en la producción de metabolitos secundarios.
Especie Metabolito Incremento Autor
Withania somnifera Esteroide 25% Bandyopadhyay et al.,
2007.
Camptotheca acuminata Alcaloide 25 % Lorence y Nessler, 2004
Datura metel Alcaloide 8 % hasta 70 % Bonhomme et al., 2000
Fagopyrum esculentum Flavonoide 10 % Tanaka et al., 1996
Lobelia erinus Poliacetilenos 10 % Tanaka et al., 1996.
Dubiosa leichhardtii Alcaloide 97 % Muranaka et al., 1993
Agrobacterium es una bacteria Gram negativa que habita en la rizósfera; es capaz de
inducir efectos morfogenéticos característicos cuando afecta a las plantas superiores. De
manera natural, la infección de una planta por A. tumefaciens ocurre a través de una
herida, provocando la introducción de una región de su plásmido Ti (inducción de
tumor), produciendo una enfermedad neoplásica conocida como “agalla de corona”
(Tepfer, 1984). La infección con A. rhizogenes induce la formación de “raíces
peludas” o “hairy roots” mediante la introducción de una región del plásmido Ri
(inducción de raíces) (Chilton et al., 1982). En la figura 4, se muestra el mecanismo de
la transformación que implica la transferencia de un fragmento de ADN plasmídico
llamado T-ADN. El T-ADN del plásmido Ti, contiene un número de genes los cuales
son expresados en las células de las plantas transformadas.
Antecedentes
13
Figura 4. Mecanismo de la interacción de Agrobacterium con una célula hospedera
durante la transformación genética.
El proceso de transformación genética se inicia con el reconocimiento y unión de
Agrobacterium hacia la célula hospedera a través de receptores específicos,
posteriormente el sistema de dos componentes de Agrobacterium (Vir A-Vir G), percibe
señales específicas, donde Vir G es activado e induce la transcripción de la región vir
del plásmido, generándose una copia móvil del TDN-A y la formación del complejo
transportado por Vir B-Vir D4 y la transferencia de la cadena T hacia la célula
hospedera, formándose la cadena T madura. Posteriormente, el complejo T es importado
hacia el núcleo, facilitado por proteínas del mismo hospedero, para su posterior
integración en el genoma de la célula hospedera, mediada por Vir D2 y/o Vir E2 y otros
factores de la célula hospedera (Tzfira y Citovsky, 2002). Algunos de estos genes son
conocidos como onc, los cuales codifican para enzimas involucradas en la producción
de reguladores de crecimiento de las plantas (auxinas y citocininas). Otras enzimas
catalizan la producción de opinas. Los cultivos transformados presentan una alta tasa de
crecimiento, estabilidad genética, altos niveles de producción de metabolitos
secundarios o cantidades comparables a cultivos no modificados genéticamente y
síntesis endógena de fitorreguladores de crecimiento. Así mismo, en estos cultivos se
puede incrementar el flujo de las vías biosintéticas de los productos deseados y reducir
su catabolismo.
genes vir
plásmido-Ti
Proteínas de virulencia
T-ADNhebra-T
T-ADN integrado
Mitocondria Cloroplasto Núcleo
Antecedentes
14
2.4.3 Comprobación molecular de la transformación genética
La verificación de la transformación genética en células de plantas se puede lograr por
la expresión de un gen reportero llamado gen ß-gus. El principio de esta herramienta
molecular radica en verificar por reacciones histoquímicas, la presencia de la enzima ß-
glucoronidasa, que al reaccionar con el sustrato específico (no existente en la planta)
(X-GLUC), genera una coloración azul fácil de ser detectada. Otro sistema, es por
medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que consiste en identificar si el
fragmento de ADN deseado ha sido amplificado por medio de “n” ciclos 2n+1 copias del
fragmento a amplificar. Generalmente esta técnica se realiza para amplificar los
fragmentos del gen ntpII y gusInt presentes en A. tumefaciens, mientras para A.
rhizogenes se amplifican los genes rol A y rol C (Bonhomme et al., 2000). Otro método
que se utiliza frecuentemente es el análisis por Southern blotting; para la realización de
esta técnica es necesario la extracción de ADN de las células vegetales y bacterianas.
Los fragmentos de los genes rol, se purifican y se marcan con una sonda radioactiva
para posteriormente ser detectados por reacciones inmunológicas.
2.5 Galphimia glauca
Galphimia glauca Cav. es una especie vegetal que crece en algunos estados de la
República Mexicana (Guerrero, Michoacán, San Luís Potosí, Morelos, Chiapas, Sonora
y Guanajuato). Se distribuye en latitudes que van de 0 a 2350 m.s.n.m., en pastizales,
matorrales y bosques, pero principalmente en áreas con vegetación perturbada. Se
caracteriza por ser un arbusto silvestre que alcanza una altura de 1 a 3 metros, con
abundantes ramas e inflorescencia dispersa, con hojas membranosas y flores en racimos
densos (Estrada, 1985).
Galphimia glauca pertenece a la familia Malpighiaceae y se conoce popularmente como
lluvia de oro, hierba de hormiga, palo de muerto, flor de chinche y palo de San Vicente
(Rzedowwski y Equihua, 1987). Desde la época prehispánica, G. glauca ha sido
utilizada para combatir fiebre y escalofríos. También se ha utilizado para fortalecer
parturientas y contener diarreas (Tortoriello et al., 1998). Martínez (1969), describió
que G. glauca es eficiente como emoliente en la cura de heridas y que abate la
candidiasis vaginal. Esta planta se ha utilizado en la medicina tradicional como sedante
Antecedentes
15
y calmante nervioso, pero existen otras regiones en donde también se utiliza con fines
ornamentales (Estrada, 1985).
En 1985, Wiesenauer y Gaus, reportaron las propiedades farmacológicas de G. glauca,
al comprobar en estudios clínicos en humanos la efectividad terapéutica de esta planta a
través de una preparación homeopática de extractos hidroalcohólicos contra la fiebre del
heno. Dorsch y Wagner (1991), publicaron las propiedades antialergénicas de extractos
etanólicos y metanólicos de Galphimia glauca en cobayos. Posteriormente en 1995,
Wiesenauer y Lüdtke, demostraron la efectividad de diferentes diluciones
hidroalcohólicas de la planta sobre la respuesta alergénica y procesos antiasmáticos en
pacientes. Así mismo, se reporta que los extractos de acetato de etilo de partes aéreas
de la planta silvestre, inhiben la respuesta contráctil a la ovoalbúmina en la tráquea de
cobayo, específicamente la bronco constricción inducida por el leucotrieno D4 al actuar
como antagonista (Campos et al., 2001).
Con arbustos de Galphimia glauca colectados en el Estado de Guanajuato, se
prepararon extractos acuosos de hojas y flores que fueron efectivos para tratar
problemas del sistema nervioso central (Estrada, 1985). Tortoriello y Lozoya (1992)
demostraron para los extractos metanólicos de tallos y flores de Galphimia glauca
colectados en Guanajuato, las propiedades sedante y anticonvulsiva en modelos
murinos.
Estudios fitoquímicos de Galphimia glauca han permitido identificar diversos
metabolitos secundarios con efectos farmacológicos. En la tabla 2 se muestran algunos
compuestos activos de Galphimia glauca y su función farmacológica. Por ejemplo: se
ha observado una actividad antialérgica en derivados del ácido gálico y flavonoides
(Dorsch et al., 1991); a los polifenoles con actividad antiinflamatoria (Müller et al.,
1998) y a las galfiminas como depresores del sistema nervioso central (Camacho et al.,
2002).
Además se han aislado otros metabolitos con actividad biológica a partir de extractos
orgánicos de G. glauca, por ejemplo, el ácido gálico, metil galato y quercetina, capaces
de reducir alergias y reacciones bronquiales (Dorsch y Wagner, 1991). También se
Antecedentes
16
identificaron derivados del ácido gálico y acilflavonoides altamente activos contra
alergias, obstrucción branquial e hiperreactividad bronquial (Müller et al., 1993).
Galphimia glauca tiene otros compuestos como ácido elágico, glucosidos de quercetina,
galoilglucósidos y ácido tetragaloilquínico; este último con actividad antiasmática y
contra otras reacciones alérgicas (Neszmelyi et al., 1993). La planta puede utilizarse así
mismo en pacientes con polinosis (Wiesenauer y Lüdtke, 1995). Más recientemente, se
encontró que la fracción metanólica de partes aéreas de Galphimia glauca, tienen
actividad ansiolítica, siendo los responsables de esta actividad el compuesto GB, así
mismo se realizaron pruebas biodirigidas del extracto de la planta dando actividad los
compuestos denominados GE, GB y GA, siendo los más activos GB y GA (Aguilar et
al., 2006, Tortoriello et al., 2006).
Antecedentes
17
Tabla 2. Compuestos activos producidos por Galphimia glauca.
Compuesto activo Función Autor
Acilflavonoides Hiperactividad bronquial Müller et al., 1993
Polifenoles Antiinflamatorios Müller et al., 1998
Derivados del ácido gálico Alergias, obstrucción
bronquial
Müller et al., 1993
Ácido gálico, Quercetina,
Metil galato
Alergias y reacciones
bronquiales
Müller et al., 1993
Dorsch et al., 1992
Ácido elágico
Ácido quínico
Ácido tetragaloilquínico
Antiasmático y reacciones
alérgicas
Neszmelyi et al., 1993
Dorsch et al., 1992.
Galfimina C, D, E, glaucamina Antimalárica Camacho, 1997
Galfimina B (GB) Depresora de neuronas del
AVT en ratas
Tortoriello et al., 1998,
Tortoriello et al., 1993, 1998,
Toscano et al., 1993.
GB, GA y GE Actividad ansiolítica y
antidepresiva
Tortoriello et al., 2006.
2.5.1 Estudios biotecnológicos de Galphimia glauca
Los avances en el cultivo de Galphimia glauca (G. glauca) de células y tejidos
vegetales “in vitro” han permitido obtener un rendimiento de galfimina B de 0.15 mg/g
peso seco (PS) en de callos. Así mismo, en cultivos de células en suspensión en dos
fases se ha identificado GB, con rendimientos de 0.21 mg/g PS y con un incremento
del 36 % en relación con los callos. También, se reportó la presencia de otro compuesto
denominado 6-acetoxigalfimina-B (GE) con rendimiento de 0.12 mg/g PS. Nader
(2004), realizó un sistema de cultivo de raíces transformadas que permitió la producción
de principios bioactivos de naturaleza triterpénica con estructura química novedosa,
denominados glaucacetalina A, B y C con rendimientos de 2.06, 0.41, 0.16 mg/L,
respectivamente. Otros compuestos reportados en raíces pilosas son el ácido maslínico
Antecedentes
18
y el compuesto GE con rendimientos de 0.43 y 0.10 mg/g PS. Sin embargo, la
acumulación del principio sedante bajo estas condiciones sigue siendo bajo y
complicado para realizar su escalamiento industrial (Osuna et al., 2002, Nader et al.,
2004).
2.5.2 Propuesta biogenética para la producción de nor-friedelanos en G. glauca
Nader et al (2004), propuso una ruta de biosíntesis de los nor-friedelanos
(glaucacetalinas) en G. glauca (Figura 5), generados a partir de raíces transformadas
genéticamente por A. rhizogenes. La propuesta postulada para la producción de nor-
friedelanos inicia con la ciclización del 2,3-epoxidoescualeno (6), en la conformación
silla-sill-silla-bote para generar el intermediario carbocatiónico bacaranilo (7) que sufre
un rearreglo mediante la expansión del anillo de cinco miembros terminal al catión
tetracíclico 3 ß-hidroxibacaranilo (8), un precursor que por ciclización de la cadena
lateral resulta en el esqueleto de oleano que a su vez es el intermediario común de la ß-
amirina (9) y de los friedelanos (10). Una posterior oxidación de los carbonos C-2 y C-
28 termina con la génesis del ácido maslínico (4). Por otro lado, múltiples rearreglos 1,2
de tipo Wagner-Meerwein del catión oleanilo, generan el núcleo del friedelano (10).
Este último compuesto sufre una pérdida de un átomo de carbono (-CO2) mediante un
rearreglo del anillo E del núcleo pentacíclico, cuyo mecanismo no se ha establecido,
formándose la nor-friedelina (11). Este derivado constituye, el precursor con el núcleo
norfriedelánico de las galfiminas y glaucacetalinas. El esqueleto estructural del nor-
friedelano al sufrir oxidaciones subsecuentes del anillo A puede provocar la ruptura del
enlace C3-C4, generando los grupos funcionales para la formación de la lactona de siete
miembros característica de las galfiminas. Por otro lado el establecimiento de la función
catalítica entre C24 y C25 constituye la característica estructural de las glaucacetalinas.
Antecedentes
19
2,3- epoxidoescualeno catión 3β-hidroxibacaranilo ác. Oleanólico ác. maslínico
Friedelina
Planta silvestre Raíces transformadas
Figura 5. Propuesta biogenética para glaucacetalinas y galfiminas de G. glauca (Nader et al., 2004).
6 7 9 4
10
11 12 14
1
16
H O
H
O
13
3
Friedelanos
Glaucacetalinas
15
H O O HH
76
25
2
C H 3O O C
5
Nor-friedelanos
NADPH
C H 3 O O C
H O
C H 3 O O C
2
25
24
H O
H
O H
O H
O H
O
HH O 25
24
2
C H 3O O C
3
2324
6 7
24
C H 3O O C
423
2 1
Nor-friedelanos
O 3 2
H O
C O O H H O
2
12O
O
O O O
H O H O H
O H
O H
O HO H
H O
A c O H
O H
O HO
HHO
H O O A c
C H 3O O C
2
O
C O 2 H 2 O;
H O
+
Galfiminas Nor-secofriedelanos
H O
HO
H O H
HOO C
HO
HO
HHO
O H
O A c
O HO
HHO
H O
H O H
O HO A c
HO
HO H
O
H
O
HO
HO
O H
O HO A c
H
C H 3 O O C
H O O
O H H O H
O A c O H1
2 3
24 5 4 2
H O
H
O H
O HO
HCH 3O
H O
O A c
C H 3 O O C
25
+
8 COOH
Justificación
3. JUSTIFICACION
La demanda mundial de fármacos derivados de plantas superiores, provoca una
disminución importante de los recursos vegetales naturales. Por esta razón es necesaria
la búsqueda de alternativas de producción de medicamentos naturales que puedan
interesar a investigadores y empresarios; que además involucren el diseño y aplicación
de nuevas tecnologías de producción.
G. glauca representa uno de los recursos bióticos, que abundan en nuestro país. Se
tiene documentada una población de G. glauca en Dr. Mora Guanajuato, que se reporta
como productora de compuestos secundarios con actividad sedante (Tortoriello y
Lozoya, 1992, Toscano et al., 1993).
Se han realizado estudios de G. glauca utilizando partes aéreas de la planta y cultivos
in vitro de callos y células en suspensión, logrando obtener diferentes triterpenos
activos. Sin embargo, las concentraciones de los nor-friedelanos y seco-friedelanos
reportadas para la planta y los cultivos in vitro, se encuentran en el mismo orden de
magnitud. Los rendimientos alcanzados de estos cultivos son aún considerados bajos,
por lo que se requiere implementar estrategias biotecnológicas que solas o combinadas,
logren incrementar el rendimiento de los compuestos sedantes y ansiolíticos en dichos
cultivos.
Una de las estrategias de vanguardia para incrementar la acumulación de metabolitos
secundarios es la utilización de la transformación genética, introduciendo el plásmido de
Agrobacterium al genoma vegetal. Este procedimiento ha generado resultados
importantes para la producción de metabolitos secundarios en cultivo in vitro. Se ha
demostrado experimentalmente que la transformación genética de tejidos, órganos y
células en suspensiones pueden mejorar los rendimientos considerablemente (Yang y
Choi, 2000).
Las ventajas de transformación por Agrobacterium en cultivos indiferenciados de callos
o células en suspensión residen en la integración preferencial de elementos genéticos de
regiones transcripcionalmente activas, y en general, a la transferencia de genes para la
producción de auxinas y citocininas, permitiendo a las especies transformadas
20
Justificación
independencia de la aplicación externa de los reguladores de crecimiento; además de
permitir proyectar su escalamiento con mayor control de las variables respecto a otros
sistemas como raíces transformadas genéticamente.
Bajo estas consideraciones es factible aplicar los procedimientos de transformación
genética vía Agrobacterium en búsqueda de cultivos de células en suspensión con la
producción de triterpenos en forma homogénea, controlada y permanente.
21
Hipótesis y Objetivos
4. HIPÓTESIS
El establecimiento de cultivos in vitro de células en suspensión transformados
genéticamente de Galphimia glauca Cav., permitirá el crecimiento celular y la
acumulación estable de triterpenos sin la necesidad de utilizar fitorreguladores, además
la posible modificación y expresión de características en la producción de triterpenos.
5. OBJETIVO GENERAL
Establecer y estudiar un cultivo de células transformadas de G. glauca Cav. en
suspensión para la producción de triterpenos
6. OBJETIVOS PARTICULARES
Seleccionar líneas de células de G. glauca en suspensión transformadas
genéticamente.
Establecer las condiciones de aislamiento, purificación e identificación de los
triterpenos presentes en la biomasa y en el sobrenadante mediante diferentes
técnicas analíticas.
Caracterizar las cinéticas de crecimiento y producción de triterpenos de los
cultivos de G. glauca.
22
Metodología
23
7. METODOLOGIA
7.1 Obtención del material vegetal
El material vegetal con el que se trabajó fue seleccionado y cultivado a partir de
callos celulares que crecían en pequeñas cantidades en el centro de un cultivo de raíces
pilosas (línea VYT) de G. glauca, que fueron previamente infectadas con A. rhizogenes
(ATCC 15834) (Figura 6) (Nader et al., 2004).
Callos
Figura 6. Cultivo de raíces transformadas de G. glauca y la generación de callos.
Los callos fueron desprendidos de las raíces y subcultivados en medio B5 sólido
adicionado con 3 g/L de Polivinil pirrolidona (PVP), sacarosa 30 g/l, pH = 5.7 y
crecidos por 30 días.
7. 2 Establecimiento de la línea celular GgBa sin la adición de fitorreguladores
Los callos inicialmente fueron resembrados en medio B5 y colocados en matraces
Erlenmayer de 250 mL, con un volumen de trabajo de 100 mL de medio y
suplementado con 3 g/L de PVP, posteriormente se colocaron en un agitador orbital
(6090 marca SEV) a una velocidad de agitación de 100 rpm, durante 30 días y se
incubaron a 25°C en fotoperíodo de 16 h luz/ 8 oscuridad, a una intensidad luminosa de
25µMn-2S-1 condiciones en que crecen los cultivos de raíces pilosas.
Metodología
24
Utilización de matraces Erlenmayer bafleados
Los matraces bafleados utilizados presentaban dos diseños, el primero con 3 bafles
laterales (Figura 7, matraz izquierdo), y el segundo tipo de matraces, con 4 bafles
colocados en la parte inferior del matraz, (Figura 7, matraz derecho).
Figura 7. Matraces con bafles, a la izquierda con 3 bafles laterales y a la derecha el con
4 bafles inferiores.
Para iniciar las suspensiones, se utilizaron 40 matraces, 20 con bafles laterales y los
otros 20 con bafles en la parte inferior; cada matraz conteniendo un volumen de 100
mL de medio B5, 10 g de biomasa, 3 g PVP /L, 30 g de sacarosa, a un pH 5.7. Los
matraces se mantuvieron a una velocidad de agitación de 100 rpm, durante 30 días. Se
colocaron diez matraces en condiciones de fotoperíodo (16 h/luz) y diez en luz
constante, a una intensidad luminosa de 25µMn-2S-1.
Empleo de antioxidantes
A continuación, se trabajó con matraces bafleados en la parte inferior del matraz y con
medio MS suplementado con tres antioxidantes diferentes: 1) PVP en diferentes
concentraciones: (0.5, 1.5, 2.5, y 3.0 g/L), 2) Agua de coco filtrada (25 y 50 mL/L) y
3) L-cisteina a dos concentraciones (5 y 10 mg/L). Cada experimento se realizó por
triplicado en condiciones de fotoperíodo.
Metodología
25
7. 3 Viabilidad celular
La viabilidad fue observada utilizando la técnica de fluoresceína, utilizando diacetato de
fluoresceína (daf) (Wildholm, 1972). Para preparar la solución, se pesaron 5 mg de daf
y se disolvieron en 1 mL de acetona, almacenándose a 4°C. Una alícuota de 0.1 mL del
stock se adicionó a 5 mL de agua desionizada. Posteriormente, se tomaron 500 μL de
esta última dilución y se mezcló con 500 μL de la suspensión celular, se dejó reposar
por 1 min, después se tomaron 50 μL de esta suspensión y se colocó en un portaobjetos
para ser observada al microscopio de fluorescencia( Nikon Eclipse E 400, Super high
pressure mercury lamp, Modelo HB-10103AF) y se contaron las células viables y se
expresó en porcentaje.
7. 4 Transformación genética
7.4.1 Cepa bacteriana
La cepa bacteriana de A. rhizogenes (ATCC 15834) utilizada para esta investigación fue
donada por el Virginia Tech Intitute de los EE.UU. La cepa se cultivó en medio YEB,
que contenía bactopeptona 5 g/L, extracto de carne 5 g/L, extracto de levadura 1 g/L,
sacarosa 5 g/L, sulfato de magnesio 2mM a un pH de 7.2. Se subcultivaron sin
antibióticos a 25ºC, en oscuridad y una agitación de 300 rpm durante 24 h.
7.4.2 Comprobación molecular de la transformación genética
7.4.3 Extracción del ADN bacteriano
La extracción del ADN total bacteriano se realizó mediante el Kit PUREGENE® de
Gentra Systems (purificación de ADN de Bacterias Gram negativas de 5 mL de medio
de cultivo).
Metodología
26
7.4.4 Lisis celular
El rompimiento celular se realizó con un cultivo en fase exponencial de crecimiento de
la cepa ATCC 15834, 5 mL fueron centrifugado por 3 min a 1,000 x g. El precipitado
celular se lavó con 3 mL de solución de lisis celular y se incubó a 80 ºC por 5 min.
Después de este tiempo, la suspensión celular se trató con RNAsa (15µl) y fue incubada
a 37ºC por 1h. Posteriormente, se realizó la precipitación de las proteínas con 1 mL de
solución y se centrifugó por 10 min a 2,000 x g. Inmediatamente se procedió a
precipitar el ADN con 3 mL de isopropanol al 100 % y se centrifugó 3 min a 2,000 x g.
Después se realizaron dos lavados con 3 mL de etanol al 70 % cada uno y se
centrifugó a 2,000 x g por 1 min. Finalmente se hidrató el ADN con buffer Tris- EDTA
y se corroboró la extracción del ADN mediante una electroforesis en gel de agarosa al
1% adicionado con un amortiguador de Tris-Boratos y se corrió a 100 volts. El gel fue
teñido con bromuro de etidio y las bandas de ADN se observaron a través de luz
ultravioleta.
7.4.5 Extracción del ADN vegetal
La extracción del ADN total vegetal se realizó mediante el Kit PUREGENE® de
Gentra Systems (200-400 mg peso fresco).
7.4.6 Extracción de ADN total
Lisis celular:
En un mortero se colocó 1.0 g de células de la línea GgBa, se adicionaron 2 mL de
solución de lisis, se maceró. El polvo obtenido se transfirió a un tubo y se le
adicionaron 10 mL de solución de lisis, posteriormente se incubó por 1 h a 65 ºC. Se
adicionaron 30 µl de RNAsa y se incubó 30 min a 37°C. Posteriormente se adicionaron
4 mL de solución de precipitación y se colocó en hielo por 1 min, se centrifugó a 2,000
x g por 10 min. Se removió la fase acuosa y se le adicionaron 12 mL de isopropanol y
se centrifugó a 2,000 x g por 5 min para precipitar el ADN. Después se realizó un
lavado con 6 mL de etanol al 70 % y centrifugó a 2,000 rpm por 5 min. Finalmente se
hidrató el ADN con amortiguador Tris- EDTA (TE). La pureza del ADN se corroboró
Metodología
27
mediante una electroforesis en gel de agarosa al 1% adicionado con un amortiguador de
Tris-boratos y se corrió a 100 volts, inmediatamente fue teñido con bromuro de etidio
para ser observado con luz ultravioleta.
7.4.7 Evaluación de la transferencia del T-ADN a G. glauca
El PCR es una amplificación enzimática de las secuencias específicamente reproducidas
del ADN y permite confirmar la presencia de los genes rol A y rol C en el ADN de las
células bacterianas y de las células de GgBa. Se realizaron los PCR con el par de
oligonucleótidos específicos para los genes descritos por Bonhomme et al (2000). La
técnica de PCR se realizó mediante la utilización del Kit PCR supermix de la marca
Invitrogen (Life Technologies).
Para cada reacción se utilizó PCR Supermix 22.5 µL, agua 0.5 µL, ADN (300 ng). Las
muestras ya preparadas se colocaron en un termociclador Px2 (Termo Electrón
Corporatio), y se inició la amplificación del ADN bajo las siguientes condiciones: Para
el gen rol A, un ciclo de 95 ºC por 5 min, seguido por 35 ciclos de 1 min de
desnaturalización a 95 ºC, 1 min de renaturalización 45 ºC, y por 1 min de extensión a
72 ºC, y para el gen rol C, un ciclo de 95 ºC por 5 min, seguido por 30 ciclos de 1 min
de desnaturalización a 95 ºC, 1 min de renaturalización 49 ºC, y por 1 min de extensión
a 72 ºC
También se realizó un tren de corridas a diferentes temperaturas de renaturalización
como fueron 50, 52, 54, 56 y 58 ºC, siempre colocando un control con un solo oligo.
Los ADN amplificados se analizaron por electroforesis sobre un gel de agarosa-TE 1
%. Los productos esperados son de 248 pb para rol A, 490 pb para rol C.
7.4.8 Southern blotting
La localización de la secuencia en particular del nucleótido rol A y rol C dentro del
ADN genómico de las células GgBa, se realizó mediante el método de Southern blotting
utilizando el Kit de Amersham MegaprimeTMADN Labelling System RPN1607. El
ADN de GgBa se digirió con tres enzimas de restricción diferentes: HindIII, EcoRI y
BamHI. Los fragmentos se separaron por electroforesis sobre gel de agarosa (1%). El
Metodología
28
ADN se desnaturalizó in situ y se transfirió a un soporte de papel de nitrocelulosa. El
ADN fijado al filtro se hibridó con el ADN exógeno del gen rol A marcado con isótopo
radioactivo 32P, posteriormente se realizó una autoradiografía. De esta forma se detectó
la cadena complementaria a la sonda utilizada. Se siguió el mismo protocolo para la
detección del gen rol C.
7.5 Análisis químico
7.5.1 Extracción de compuestos triterpénicos de cultivos en suspensión en
sobrenadante y biomasa
Los cultivos en suspensión de GgBa fueron establecidos y subcultivados en medio MS.
A partir de estos cultivos se procesó la biomasa y el sobrenadante por separado, para
estudiar los compuestos triterpénicos de interés.
El primer paso de la extracción consistió en separar el sobrenadante de la biomasa por
filtración al vacío. La biomasa se congeló a -20 oC, después se liofilizó y se registró el
peso seco. Posteriormente se adicionó 30 mL de acetato de etilo (AcOEt) y se dejó en
agitación a 100 rpm por 12 h, se filtró (este procedimiento se realizó tres veces), se
evaporó el solvente y concentró la muestra hasta sequedad. Los extractos se
resuspendieron en 500 µL de metanol (MeOH) y analizaron por cromatografía en capa
fina (CCF) y Cromatografía Líquida de Alta Presión (CLAP).
Al sobrenadante se le adicionaron 30 mL de AcOEt, se dejó en agitación a 100 rpm, 12
h y después se colocó en embudo de separación, para separar la emulsión. Se evaporó el
solvente y se concentró la muestra para analizarse por CCF y CLAP.
7.5.2 Métodos cromatográficos
7.5.2.1 Análisis de triterpenos por Cromatografía en Capa Fina (CCF)
El primer análisis al que se sometieron los extractos de sobrenadante y biomasa de la
línea GgBa fue el que se describe para triterpenos (Taketa et al., 2004). Se utilizó una
cromatoplaca con una cubierta de sílice 60 F254, se empleó el eluente
Metodología
29
cloroformo:metanol (9:1). La visualización de los compuestos se hizo a través de la
reacción con el agente cromógeno vanillina/H2SO4 (0.1 g en 10 mL) y finalmente se
realizó un calentamiento a 100 oC para observar la presencia de los triterpenos con un
color violeta característico.
7.5.3 Purificación de triterpenos por cromatografía en columna abierta
A partir del medio líquido se aislaron dos compuestos, ambos compuestos con
características de triterpenos. En biomasa se identificaron otros dos compuestos
intracelulares interesantes.
Para la purificación de los compuestos se realizaron inicialmente una serie de
cromatografías en columna abierta, empleando una columna de vidrio de 60 cm de
largo por 1.5 cm de ancho, empacada con sílice 60 (Merck) con un tamaño de partícula
de 40-60 µm y un sistema de elusión de cloroformo:metanol (9:1).
7.5.4 Análisis de triterpenos por Cromatografía Líquida de Alta Presión.
Para identificar y cuantificar los triterpenos se utilizó un equipo de cromatografía
Líquida de Alta Presión, marca Waters, (Millipore Corp, Waters Chromagraphy
División, Milford, MA, USA). Este equipo cuenta con un sistema de distribución de
disolventes (bomba 600), un detector de UV con arreglo de diodos (410), un inyector
automático (717) y un procesador de datos (Millenium 2000). Se utilizó un sistema de
fase reversa en una columna C18 analítica (Waters: 3.9 x 150 mm, 5 µm), con una fase
móvil de acetonitrilo:agua (1:1) detección en UV a 232 nm y un flujo de 1 mL/min
(Osuna et al., 2002). La purificación se realizó con una columna preparativa (Waters: 19
x 300 mm, 7 µm) con un flujo de elución de 9.0 mL/min, con un reciclado de muestra
en línea al equipo. Para la purificación del ácido maslínico se utilizó bajo las siguientes
condiciones: columna de gel de sílice μporasilTM (3.9 x 300 mm, 10 μm); fase móvil
hexano:etanol 6:4; flujo: 1 mL/min; volumen de inyección: 50 μl; detector: UV 212 nm.
Para glaucacetalina D, la fase móvil utilizada para este compuesto fue metanol (100 %),
una columna de fase reversa C18, un flujo de 0.4 mL/min, y un detector de UV (216 nm)
Metodología
30
7.5.5 Purificación de los triterpenos
Para extracción de triterpenos se utilizaron un total de 8 litros de medio de cultivo MS
donde creció de la línea celular GgBa, empleando AcOEt (200 mL x 3). Los extractos
se reunieron y se secaron a presión reducida a una temperatura de 40°C, hasta la
obtención de un residuo seco de apariencia verde aceitosa o en ocasiones café (410 mg).
Se realizó un fraccionamiento primario del extracto en columna abierta con sílice gel y
un gradiente de polaridad creciente de matanol:cloroformo (1:9 a 3:7). Se colectaron 60
fracciones de 15 mL cada una, las cuales fueron analizadas por CCF, de acuerdo con la
similitud cromatográfica se reunieron las fracciones 21-25 (33 mg).
El crudo contenía una mezcla de triterpenos del tipo de las glaucacetalinas (nor-
friedelanos) que se sometió al primer proceso de repurificación por CLAP en un sistema
preparativo. Los eluatos presentaron varios tiempos de retención. Fueron colectados y
se les realizó un corte de núcleo. Se aplicó un reciclado de la muestra de 5 a 7 ciclos
para optimizar la separación y garantizar la pureza de dos compuestos.
7.5.6 Análisis de triterpenos por Resonancia Magnética Nuclear (RMN)
Los estudios de RMN se realizaron en la Universidad Nacional Autónoma de México
(Facultad de Química) y en la Universidad Autónoma Metropolitana.
Los análisis de RMN permitieron realizar un estudio comparativo de características
estructurales comunes entre los triterpenos galfiminas o glaucacetalinas y con un nuevo
compuesto en el que se reconoce la presencia de grupos metilo, carboximetoxilo,
presencia de grupo alcohol y una porción vinílica que permitirá tener evidencias de su
naturaleza nor-friedelánica.
El primer análisis fue RMN de hidrógeno (1H), seguido de un análisis de carbono-13
(13C), utilizando cloroformo deuterado (CDCL3) como disolvente. Los desplazamientos
químicos (δ) se expresaron en ppm usando como referencia el tetrametilsilano (TMS).
Metodología
31
7.6 Establecimiento de parámetros cinéticos de crecimiento celular y producción
de triterpenos
7.6.1 Cinética de crecimiento de GgBa
La línea GgBa, establecida con un buen crecimiento celular y con presencia de
triterpenos interesantes, se programó para realizar una cinética de crecimiento y
producción de triterpenos. La cinética fue de tipo lote, en matraces de 250 mL, y con un
volumen de trabajo de 100 mL de medio MS, PVP 1.5 g/L y un inóculo de 3 g peso
fresco, pH de 5.7, fotoperíodo (16 h luz/8 oscuridad), una agitación tipo orbital de 100
rpm y temperatura de 25 oC, a una intensidad luminosa de 25µMn-2S-1. Se programaron
cosechas para cada tercer día sacrificando tres matraces por punto. A lo largo de la
cinética se registró pH, viabilidad, biomasa (peso fresco y seco) y presencia de
triterpenos.
7.6.2 Cultivo de células transformadas de Galphimia glauca en biorreactor airlift
de 2 L
Con el propósito de obtener biomasa abundante de la línea GgBa y recuperar los
triterpenos, se procedió a crecer la línea celular en un biorreactor airlift de 2 L de
volumen de operación (Figura 8). El cultivo se desarrolló bajo las siguientes
condiciones: aireación 0.05 VVM, luz constante, a una intensidad luminosa de 25µMn-
2S-1, pH= 5.7, biomasa 10 g PF L-1. Durante el proceso, se realizó un cambio de medio a
la mitad del volumen total, esta operación se realizó 3 veces cada 15 días, y llegando al
día 60 se cosechó el total del cultivo. Al final del cultivo se determinó el pH,
viabilidad, crecimiento celular y la presencia de las glaucacetalinas en sobrenadante y
biomasa; el tiempo total de la fermentación fue de 60 días.
Metodología
32
Figura 8. Biorreactor tipo airlift de 2 L, con draft interno dD/dC = 1.94, altura hD/hC
=1.74, para el cultivo de células en suspensión de GgBa.
1.-Head-space
2.-Downcomer
3.-Columna
4.-Riser
5.-Aspersor
6.-Draft
7.-Líneas de flujo
8.-Toma de muestra
inferior
9.-Electrodos
10.-Venteo
1
2
3 4
5
6
7
8
9 10
Resultados
33
8. RESULTADOS
8.1 Establecimiento de un cultivo de células en suspensión transformado de G.
glauca
Pequeños explantes de callos fueron separados de un cultivo de raíces transformados de
G. glauca (línea VYT) y se colocaron en medio sólido (B5) sin fitorreguladores para
incrementar la biomasa celular (Figura 9). Una vez obtenidos 100 g de biomasa celular
de los callos, las células se colocaron en medio liquido (B5) sin fitorreguladores.
Figura 9. Callos de G. glauca sin la adición de fitorreguladores.
El establecimiento de los cultivos en suspensión en matraces Erlenmeyer presentó una
serie de problemas, ya que las células se aglomeraron en racimos grandes lo que
impidió su crecimiento. Además, se presentaron problemas de fenolización. Estos
resultados no permitieron establecer un cultivo estable, por lo que se decidió trabajar
con medio de cultivo MS. El medio MS es el más recomendado para crecer células no
transformadas de G. glauca en suspensión (Osuna et al., 2002). Se consideró la
posibilidad de utilizar matraces Erlenmeyer bafleados, con la finalidad de disgregar los
agregados celulares e incrementar la transferencia de oxígeno. Los cultivos mejoraron
notablemente su disgregación al utilizar los matraces con bafles inferiores, pero
persistió el problema de fenolización, por lo que fue necesario adicionar antioxidantes:
Los efectos obtenidos por la adición de los antioxidantes se muestran en la tabla 3.
Resultados
34
Tabla 3. Diferentes antioxidantes sobre el crecimiento celular de la línea GgBa.
Antioxidante Viabilidad Fenolización Tiempo
PVP
(g/L)
0.5
1.5
2-5
3.0
+
+++
+
++
+++
+
+++
+++
+
+++
+
+
Agua de coco
(mL/L)
25
50
+
+
+++
+++
+
+
L-cisteína (mg/L)
5
10
+
+
+++
+++
+
+
Viabilidad y fenolización: (+) bajo, (++) mediano, (+++) alto,
Tiempo (días) + = 5 a 7, ++ = 12 a 16, +++ = 45 a 65
Los mejores resultados obtenidos para disminuir la fenolización e incrementar la
viabilidad celular, se observaron al utilizar MS más PVP a una concentración de 1.5 g/L
y un fotoperíodo 16 h/luz-8 oscuridad, logrando disminuir la fenolización e
incrementando el tiempo de vida de las células hasta 63 días. Bajo esta condición se
obtuvieron cultivos de GgBa con alta densidad celular (figura 10). Se realizaron más de
12 resiembras para corroborar el establecimiento de un nuevo cultivo celular de G.
glauca creciendo en ausencia de fitorreguladores. La línea celular establecida se ha
denominado GgBa y ha crecido por más de 36 meses sin la adición de fitorreguladores.
Resultados
35
a) b)
c)
Figura 10. Cultivos en suspensión de GgBa sin fitorreguladores. a) células en
suspensión después de 40 días, b) células observadas a microscopio de fluorescencia, c)
biomasa recuperada después de 40 días de cultivo.
8.2 Comprobación de la transformación genética de la línea GgBa
Para corroborar la transformación genética de la línea GgBa se procedió a su
comprobación molecular por análisis de PCR y Southern Blotting. Se extrajo ADN de
las células GgBa y de la cepa bacteriana de A. rhizogenes (utilizada como control
positivo). En la figura 11 se observa el gel con las muestras de ADN de alta pureza
extraídos de A. rhizogenes y de los cultivos de G. glauca.
Resultados
36
1 2 3 4 5 6
1000 pb
250 pb
Figura 11. Perfil electroforético en agarosa mostrando el ADN purificado de A.
rhizogenes y G. glauca. Carril 1, Marcador de peso molecular 1KB, Carril 2 y 3, ADN
de A. rhizogenes. Carril 4 y 5, ADN de G. glauca transformada (GgBa). Carril 6, ADN
de G glauca silvestre.
Los análisis de PCR se realizaron para identificar los genes portadores de la
información genética rol A y rol C, los cuales contienen la información que demuestra
si el T-ADN fue integrado al genoma de las células vegetales. Los resultados obtenidos
se muestran en la figura 12, donde se observan los fragmentos de gen rol A con un
tamaño de 248 pb y el gen rol C con el fragmento de 490 pb de la cepa de A.
rhizogenes (ATCC 15834) con los pesos moleculares esperados en el control.
Resultados
37
1 2 3
1000 pb
250 pb
rol A rol C
Figura 12. Perfil electroforético de las amplificaciones de PCR de los ADN de A.
rhizogenes (ATCC 15834), y sus amplificaciones de los fragmentos de nucleótidos
específicos. Carril 1, marcador de peso molecular de 1kb (Gibco). Carril 2, ADN
producto del gen rol A. Carril 3, ADN de gen rol C.
Las amplificaciones del PCR de la línea GgBa transformada, mostraron la presencia de
un solo producto de PCR que corresponde al gen rol A, con un peso molecular de 248
pb, mientras que para el gen rol C no se amplificó ningún producto, como se observa
en la figura 13, lo que podría indicar que la transferencia del T-ADN a la planta no se
concluyó. Sin embargo; el fragmento de T-ADN que se insertó, fue el portador de
sensibilizar la modulación de los fitorreguladores en las células de GgBa, lo que ha
permitido crecer la línea celular por casi dos años en ausencia de fitorreguladores.
Resultados
38
1 2 3 4 5
1000 pb
250 pb
rol C rol A rol C rol A
Figura 13. Amplificaciones por PCR de las muestras de ADN de G. glauca (silvestre)
y GgBa. Carril 1, marcador de peso molecular 1 kb. Carril 2, ADN de G. glauca, con
oligonuleotidos para gen rol C. Carril 3, ADN de G. glauca con oligonucleotidos para el
gen rol A. Carril 4, ADN de GgBa con los oligonucleotidos para amplificar el gen rol C
y Carril 5, ADN de GgBa con el fragmento de ADN amplificado correspondiente al gen
rol A.
Para demostrar la integración del gen rol A al genoma vegetal, se procedió a realizar la
prueba molecular de Southern blotting. En esta prueba se utilizó una sonda de gen rol A
marcada con el isótopo radioactivo 32P. En la Figura 14 se observan los productos de
PCR del gen rol A, los cuales fueron purificados para realizar el marcado radioactivo.
Resultados
39
1 2 3 4 5 6 7 8 9
1000 pb
250 pb
Figura 14. Amplificaciones por PCR de las muestras de ADN de A. rhizogenes (para
sonda marcada 32P). Carril 1, marcador de peso molecular 1 Kb. Carril 2 al 7, productos
del gen rol A de A. rhizogenes. Carril 8, producto del gen rol A de células en suspensión
transformadas GgBa. Carril 9, ADN de células en suspensión sin transformar.
Los resultados muestran la amplificación del producto del gen rol A presente en A.
rhizogenes y en las células en suspensión de GgBa, mientras que en las células sin
transformar no se amplificó ningún producto. Posteriormente, se recuperaron los
productos de rol A de A. rhizogenes y se eliminó la agarosa por el método de
GENECLEAN GLASSMILK, una vez limpio el producto se realizó el marcado con 32P.
Por otro lado, el ADN de las células transformadas y no transformadas se digirió con
tres enzimas de restricción diferentes: HindIII, EcoRI y BamHI; así mismo se
analizaron ADNs sin degradar de A. rhizogenes, GgBa y G. glauca como se muestra en
la figura 15 a). Una vez obtenidas las digestiones enzimáticas, se procedió a realizar la
transferencia del ADN al papel de nitrocelulosa y así llevar acabo el proceso de
hibridación. Los resultados obtenidos de la hibridación se muestran en la placa de
radiografía (figura 15 b), donde se observa el reconocimiento del gen rol A en el ADN
de A. rhizogenes, así mismo, la presencia clara de la localización de la secuencia en
particular del nucleótido rol A dentro del ADN genómico de las células GgBa.
Resultados
40
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
1000 pb
250 pb
a) b)
Figura 15. Panel a) Gel electroforético de agarosa con productos de ADN digerido con
tres enzimas. Panel b) Autorradiografía de la hibridación tipo Southern blotting del
ADN genómico de GgBa. Carril 1, Marcador de peso molecular 1 kb. Carril 2, ADN
total de GgBa, Carril 3, ADN de GgBa digerido con la enzima Hind III. Carril 4, ADN
de GgBa, digerido con la enzima Bam H1. Carril 5, ADN de GgBa digerido con la
Enzima Eco R1. Carril 6, ADN total de A rhizogenes. Carril 7, ADN de A rhizogenes,
digerido con la enzima Hind III. Carril 8, ADN de A rhizogenes con la enzima Bam H1.
Carril 9, ADN de A rhizogenes digerido con la enzima Eco RI. Carril 10, ADN total de
G. glauca (silvestre). Carril 11, ADN de G. glauca, digerido con la enzima Hind III.
Carril 12, ADN de G glauca con la enzima Bam H1. Carril 13, ADN de G. glauca
digerido con la enzima Eco RI.
La localización de la secuencia rol A dentro del ADN geonómico de las células GgBa se
detectó con la cadena complementaria a la sonda empleada, en particular con el corte
de la enzima Eco RI como se muestra en el carril 5 de la Figura 15. Los resultados del
Southern blotting son una prueba fidedigna de la transformación genética de G. glauca.
Es importante destacar la importancia que adquiere el gen rol A, al integrarse al
cromosoma vegetal y transferir la información necesaria para el crecimiento autónomo
de las células vegetales, sin depender de fitorreguladores exógenos.
Resultados
41
8.3 Análisis químico de triterpenos presentes en el cultivo transformado de GgBa
8.3.1 Triterpenos presentes en biomasa de la línea celular GgBa
La figura 16 muestra que los extractos de biomasas celulares de GgBa presentaron un
perfil cromatográfico en el que se observó la presencia del ácido maslínico, compuesto
previamente reportado en raíces pilosas de G. glauca. Además de la banda
correspondiente al ácido maslínico, se aprecian otras de menor polaridad y de identidad
desconocida. En el panel a) de la figura 16, se muestra los perfiles cromatográficos en
capa fina de los extractos crudos obtenidos a partir de la maceración de la biomasa en
acetato de etilo. Dichos extractos se reunieron y se sometieron a procesos de separación
cromatográfica de los compuestos en columna abierta, dando como resultado la
separación del ácido maslínico, como se muestra en el panel b de la Figura 16. El ácido
maslínico obtenido de GgBa presentó un Rf de 0.45, igual al control que fue
previamente obtenido a partir de raíces transformadas de G. glauca.
a) b)
1 2 3 4 5 6 1 2
Figura 16. Cromatografía en capa fina de los extractos de biomasa de GgBa y
fracciones de columnas. Panel a) extractos de biomasa de GgBa durante el proceso de
purificación. Carriles 1, 2 y 3, extractos crudos. Carriles 4 y 5, primeras fracciones de
cromatografía en columna abierta. Carril 6, control de ácido maslínico. Panel b)
Cromatograma en capa fina del ácido maslínico y del compuesto purificado. Carril 1,
Control de ácido maslínico. Carril 2, compuesto purificado del extracto de de biomasa
que tiene el mismo Rf de 0.45 del ácido maslínico. Condiciones cromatográficas: fase
estacionaria: gel de sílice 60 F254; fase móvil: AcOEt:CHCl3 (2:1); agente cromógeno:
vanillina-H2SO4 y calentamiento a 100 ºC.
Resultados
42
En la figura 17, se muestra la cromatografía por CLAP del compuesto purificado que
corresponde al ác. maslínico, con un tiempo de retención (Tr) de 8.7 min. La co-elución
con el control ác. maslínico indicó el mismo Tr para ambos compuestos, lo que
corrobora su identidad.
Figura 17. Cromatografía de la muestra purificada del extracto AcOEt de biomasas (Tr
8.7 min) obtenido por CLAP: Condiciones cromatográficas: columna de gel de sílice
μporasilTM (3.9 x 300 mm, 10 μm); fase móvil hexano:etanol 6:4; flujo: 1 mL/min;
volumen de inyección: 50 μl; detector: UV 212 nm.
Los análisis de RMN-1H muestran los desplazamientos químicos que comparados con
la literatura corroboran la identidad química del ácido maslínico (Figura 18), y que
corresponde con el análisis de RMN 13C que reporta Nader et al. (2004). Este
compuesto se acumuló intracelularmente en la biomasa de la línea GgBa.
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
Minutos
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
8.7
Resultados
43
Figura 18. Espectro RMN-1H del ácido maslínico (CDCL3 500 MHz)
8.3.2 Triterpenos presentes en sobrenadante de la línea celular GgBa
Algunas especies vegetales que han sido infectadas con Agrobacterium incluyendo los
cultivos de raíces transformadas de G. glauca, presentan la particularidad de excretar
diversos metabolitos secundarios al medio de cultivo. Considerando que la planta
silvestre produce una serie de compuestos de origen friedelánico, se esperaba que la
línea celular GgBa acumulara y excretara metabolitos secundarios de origen triterpénico
al medio de cultivo, por lo que se analizaron los sobrenadantes de los cultivos de la
línea GgBa.
A partir de un volumen de 8 L del final del cultivo, en el que se crecieron las células
transformadas de GgBa, se extrajeron los compuestos químicos de origen triterpénica.
Los resultados del análisis cromatográfico del extracto crudo del sobrenadante indicaron
Resultados
44
una mezcla de triterpenos del tipo de las glaucacetalinas (nor-friedelanos), que se
observó mediante CCF como primer proceso de detección (Figura 19).
a) b)
1 2 1 2 3
Figura 19. Cromatografía en capa fina de los compuestos presentes en sobrenadante de
la línea GgBa. Panel a) Carril 1, Controles de glaucacetalinas A, B y C. Carril 2,
extracto crudo. Panel b) Carril 1, Controles de glaucacetalinas A, B y C. Carril 2,
fracción de cromatografía en columna abierta. Carril 3, extracto purificado por columna
abierta, que corresponde al mismo Rf de 0.40 de glaucacetalina A. Condiciones
cromatogroficas: fase estacionaria: gel de sílice 60 F254; fase móvil: AcOEt:CHCl3
(2:1); agente cromógeno: vanillina-H2SO4 y calentamiento a 100 ºC.
Cuando se procesó la mezcla, se logró purificar un compuesto que corresponde a la
glaucacetalina A, presentando un Rf de 0.40 y el color violeta característico de estos
compuestos. Sin embargo, fue necesario corroborar la identidad del compuesto por
CLAP. La separación analítica fue adecuada hasta observar y garantizar un alto nivel
de purificación del compuesto. En la Figura 20, se ilustra el cromatograma generado
para la resolución de la mezcla de estudio a nivel analítico utilizando la columna de fase
reversa.
A
B
C
Glaucacetalinas
Resultados
45
Figura 20. Cromatograma por CLAP del medio de cultivo de GgBa, con un tiempo de
retención de 9.3 minutos, que corresponde al mismo tiempo de retención de la
glacacetalina A. Condiciones cromatograficas: columna de fase reversa C18 (3.9 x 300
mm, 5 μm); fase móvil: acetonitrilo:agua (1:1); flujo: 0.35 mL/min; volumen de
inyección: 50 μl; detector: UV 216 nm.
El análisis por CLAP mostró la presencia de la glaucacetalina A en los extractos del
medio de cultivo de GgBa. Este compuesto se reportó por primera vez en cultivos de
raíces pilosas de G. glauca.
Para la identificación inequívoca del triterpeno purificado, se realizó un espectro
comparativo de RMN-1H, que indicó la presencia de los grupos singuletes en δ 2.07 y
2.08 (2 x COCH3) y δ 3.47 (OCH3) (Figura 21).
GA
AU
0.000
0.004
0.008
0.012
0.016
0.020
0.024
Minutes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
9.34
Resultados
46
Figura 21. Espectro RMN-1H de glaucacetalina A (CDCl3, 500 MHz)
El análisis de RMN-13C, indicó seis características estructurales comunes: un grupo
metil secundario en C-4 (CH3-23, δ 13); la presencia de dos grupos metilo terciarios
correspondientes a CH3-26 (δ 21) y CH3 -28 (δ 25); un grupo carboximetoxilo en C-27
(δ 176); un alcohol terciario en C-18 (δ 78); una porción vinílica formada por un grupo
metilénico exocíclico C-20/C-29 (δc 109 y 145) similar al reportado en las galfiminas,
principalmente por el acetal cíclico localizado entre las posiciones oxidados en C-24
(alcohol primario) y C-25 (aldehído). La naturaleza nor-triterpénica está dada por la
presencia de una aglicona de 29 átomos de carbono, la presencia de 3 metilos, 10
metilenos, 8 metinos y 8 carbonos cuaternarios por la aglicona (Nader et al., 2004).
Estas evidencias demostraron claramente que el compuesto purificado corresponde a la
glaucacetalina A.
H
O
HO
AcO
OH
OAc
HHHOOH
2
3
2324
25
67
20
4
810
12
14
1718 22
26
28
29
27CH3O2C
Resultados
47
En adición, los perfiles cromatográficos en CCF mostraron la presencia de un nuevo
compuesto en la línea celular GgBa, el cual presentó un Rf de 0.60 y el color violeta
característico de las glaucacetalinas y las galfiminas. Este nuevo compuesto presentó
menor polaridad al compararse con las glaucacetalinas y las galfiminas, como se
muestra en la figura 22.
1 2 3 4
Figura 22. Cromatografía en capa fina de los compuestos generados en sobrenadante
del la línea GgBa. Carril 1, Controles de glaucacetalinas A, B y C. Carril 2, fracción
del extracto por cromatografía en columna abierta. Carril 3, fracción purificada por
columna abierta que corresponde al mismo Rf de la glaucacetalina A. Carril 4, nuevo
compuesto con un Rf de 0.60.
La purificación y la determinación cualitativa del nuevo compuesto se inició utilizando
la metodología de CLAP. En esta fracción se tuvieron problemas para su purificación
debido a la presencia minoritaria de otro compuesto con Rf similar. La fase móvil
utilizada para este compuesto fue metanol (100 %), una columna de fase reversa C18, un
flujo de 0.4 mL/min, y un detector de UV (216 nm). La separación analítica fue
adecuada hasta observar y garantizar un alto nivel de purificación del compuesto, como
se observa en la figura 23, donde se ilustra el cromatograma generado del triterpeno con
un tiempo de retención de 35.2 minutos. Se aplicó un reciclado de la muestra de 5 a 7
ciclos para optimizar la separación y garantizar la pureza del compuesto.
Glaucacetalinas
A
B
C
Resultados
48
Figura 23. Perfil cromatográfico del nuevo triterpeno en CLAP, con un tiempo de
retención de 35.2 minutos. La fase móvil utilizada para este compuesto fue metanol
(100 %), una columna de fase reversa C18, un flujo de 0.4 mL/min, y un detector de UV
(216 nm).
Para corroborar la naturaleza del compuesto, se realizó el análisis por RMN. El análisis
de RMN-13C, indicó seis características estructurales comunes de las glaucacetalinas: un
grupo metil secundario en C-4 (CH3-23, δ 13); la presencia de dos grupos metilo
terciarios correspondientes a CH3-26 (δ 21) y CH3 -28 (δ 25); un grupo carboximetoxilo
en C-27 (δ 176); un alcohol terciario en C-18 (δ 78); una porción vinílica formada por
un grupo metilénico exocíclico C-20/C-29 (δc 109 y 145), similar al reportado en las
glaucacetalinas, siendo la principal característica el acetal cíclico localizado entre las
posiciones oxidados en C-24 (alcohol primario) y C-25 (aldehído).
El análisis realizado por RMN-1H indicó la presencia de los grupos singuletes en δ 2.07
y 2.08 (2 x COCH3), correspondiente a los dos acetatos en las posiciones C-3 y C-7,
respectivamente; y dos señales también intensas en δ 3.28 y 3.47 (2 x OCH3) que
evidenció la ocurrencia de dos grupo metoxilos sustituidos en las posiciones C-25 y C-
27, respectivamente (Figura 24). El desplazamiento químico en δ 3.28 indicó el mismo
patrón de metoxilación en C-25 observado para la estructura de la glaucacetalina B (δ
3.23). La presencia de dos grupos acetatos y de dos grupos metoxilos explica la
naturaleza menos polar, comparada con las otras estructuras de la serie, haciendo de
este compuesto una estructura novedosa, que fué denominada como glaucacetalina D.
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Minutos
AU
Resultados
49
Figura 24. Espectro RMN-1H de Glaucacetalina D (CDCL3 500 MHz)
Los estudios de RMN, corroboran una nueva glaucacetalina (D), clasificada dentro del
grupo de los nor-friedelano en el cultivo de GgBa. Glaucacetalina A y D son dos
compuestos mayoritarios que se excretan en el medio de cultivo de la línea GgBa, como
se muestra en los resultados cinéticos de producción de estas glaucacetalinas.
8.4 Parámetros cinéticos de crecimiento de GgBa
La ausencia de fitorreguladores exógenos en el medio de cultivo no impidió el
establecimiento del cultivo en suspensión de GgBa y el crecimiento de la línea celular,
así como la producción de tres triterpenos mayoritarios. En la figura 25, se observa un
crecimiento típico de la biomasa del cultivo GgBa, presentando una fase de crecimiento
exponencial que inició al día 6 y terminó el día 16 del cultivo, para después dar inicio a
una fase estacionaria. El valor máximo de biomasa fue de 24.3 g/L de peso seco y se
obtuvo al día 16 del cultivo, lo que representó un incremento de 13 veces el tamaño del
inóculo. Este cultivo presentó un tiempo de duplicación de 5.3 días (μ = 0.13 d-1).
Durante el tiempo del cultivo se registró un pH de 5, observándose ligeros descensos
en el día 8 (pH = 4.7). Con respecto a la viabilidad celular, fue de 100 % al inicio y
descendió a valores de 80 % al día 32, que representa el tiempo final del cultivo.
AcO
OH
OHO
HO
OAc
HH
HH3COCH3O2C
25
Resultados
50
Figura 25. Cinética de crecimiento en un cultivo de células en suspensión de GgBa en
un régimen de lote, y en ausencia de fitorreguladores.
8.4.1 Cinéticas de producción de triterpenos presentes en la línea celular GgBa
Se determinaron los rendimientos del ácido maslínico presente en biomasa así como de
las dos glaucacetalinas (GA y GD) presentes en el medio de cultivo. Respecto al ácido
maslínico (Figura 26 a), este compuesto se detectó desde los primeros días del cultivo
en bajas concentraciones. Sin embargo; al día 6 su concentración aumentó, alcanzando
su producción máxima de 2.4 mg/g PS al día 24, para finalizar produciendo 1.8 mg/g PS
al día 32.
El segundo compuesto presente en el sobrenadante del cultivo de GgBa corresponde a
glaucacetalina A. Este triterpeno se detectó desde los primeros días del cultivo. Al día
10, su concentración fue de 0.6 mg/L y alcanzó su producción máxima al día 26 con un
valor de 2.7 mg/L y para finalizar con 2.1 mg/L al día 32, (figura 26 b).
El tercer triterpeno interesante que se cuantificó durante la cinética de crecimiento fue la
glaucacetalina D. Este compuesto se aisló a partir de sobrenadante, y su
comportamiento cinético se puede observar en la figura 26 b), donde su producción se
inició al día 10 del cultivo, alcanzando valores de 1.37 mg/L. La máxima concentración
0
5
10
15
20
25
30
0 5 10 15 20 25 30 35
Tiempo (días)
Bio
mas
a (g
/l)
0
20
40
60
80
100
120
Via
bilid
ad (%
)
Biomasa Viabilidad
Resultados
51
de este metabolito se observó al día 26, durante la fase estacionaria alcanzando una
producción máxima de 2.9 mg/L, para después descender hasta 1.5 mg/L en el día 32
del cultivo.
Estos resultados indican que la síntesis de los tres triterpenos generados por la línea
celular GgBa están asociado al crecimiento celular a lo largo del cultivo.
Figura 26. Cinética de producción del triterpenos generados por la línea celular GgBa.
Panel A) crecimiento celular de GgBa y su producción de ácido maslínico en biomasa.
Panel. b) Producción de glaucacetalina A y glaucacetalina D en sobrenadante.
Biomasa GgBa Acido maslínico
Aci
do m
aslín
ico
(mg/
g PS
)
Bio
mas
a (m
g/g
PS)
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
0 5 10 15 20 25 30 35Tiempo (días)
Glaucacetalina A Glaucacetalina D
Gla
ucac
etal
inas
(mg/
L)
0
5
10
15
20
25
30
0 5 10 15 20 25 30 35
Tiempo (días)
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5a)
b)
Resultados
52
En la tabla 4 se resume la producción de los triterpenos presentes en las células en
suspensión de GgBa, donde se presentan los valores máximos de concentración de los
triterpenos analizados en biomasa y sobrenadante.
Tabla 4. Concentración de triterpenos presentes en el cultivo de GgBa
Ác. maslínico
Glaucacetalina A
Glaucacetalina D
máxima
concentración
mg/g PS
Día de
cultivo
máxima
concentración
mg/L
Día de
cultivo
Máxima
concentración
mg/L
Día de
cultivo
Sobrenadante
---------
------
2.7
26
2.9
22
Biomasa
2.4
24
---------
------
-------
-----
8.5 Cultivo de células transformadas de Galphimia glauca en biorreactor airlift de
2 l
El crecimiento celular de la línea GgBa en el biorreactor fue muy abundante, como se
observa en le figura 27. El valor máximo de biomasa fue de 59.4 g/L en peso seco y se
obtuvo al día 60 del cultivo. Durante el tiempo del cultivo se registró un pH de 4.7,
observándose ligeros descensos en el día 5 (pH = 4.5). Con respecto a la viabilidad
celular, se inició con un 100 % y descendió a valores de 75 % al final del cultivo.
Resultados
53
a) b) c)
Figura 27. Células en suspensión de GgBa en biorreactor airlift de 2 l; con un inóculo
de 10 g PF L-1 y 0.05 VVM. Panel a) Distribución de las células en el biorreactor; Panel
b) Concentrado de biomasa al finalizar los 60 días del cultivo; Panel c) Células
observadas al microscopio de fluorescencia al finalizar el cultivo.
Con respecto a la producción de triterpenos, fue posible identificar las glaucacetalinas A
y D, con rendimientos de 8.7 mg/L y 10.8 mg/L respectivamente, obtenidos a los 60
días del cultivo. En adición, por CCF se observó la presencia de otro triterpeno
interesante (Figura 28), que es actualmente motivo de investigación, ya que su presencia
no había sido reportada ni en planta silvestre ni en los diversos cultivos in vitro que han
sido establecidos para esta especie.
Resultados
54
1 2 3
Figura 28. Cromatograma en capa fina de los compuestos generados en biorreactor
airlift de 2 l, presentes en sobrenadante del la línea GgBa. Carril 1, Muestra tomada a
los 5 días. Carril 2, Muestra tomada a los 10 días, que corresponde al mismo Rf de 0.40
de la glaucacetalina A. Carril 3, Muestra tomada a los 15 días, con un Rf de 0.60 de la
que corresponde a glaucacetalina D.
Es importante resaltar que el crecimiento de la línea GgBa en un volumen de 2 L,
permitió obtener una biomasa abundante, así como recuperar cantidades suficientes de
los triterpenos para realizar los análisis espectroscópicos correspondientes.
GA
GD
?
Discusión
55
9. DISCUSIÓN
En este estudio se logró el establecimiento de un cultivo de células en suspensión de G.
glauca transformado genéticamente (línea GgBa), que creció sin la adición de
fitorreguladores exógenos. Fue necesario utilizar el medio de cultivo MS reportado
previamente por Osuna et al. (1999), adicionado con PVP (1.5 g/L), en lugar del medio
B5 en el cual se generaron los callos sobre las raíces pilosas obtenidas por Nader et al
(2004). Estas condiciones permitieron reducir hasta un 90 % la fenolización del cultivo
y lograr la disgregación celular eficiente de callos transformados de G. glauca. En
contraste con los cultivos de órganos y embriones somáticos un cultivo de células en
suspensión ofrece ventajas importantes para lograr un proceso de escalamiento y de
producción de metabolitos secundarios, que presentan problemas de crecimiento en
reactores. En este sentido los resultados de este trabajo revisten una importancia
particular porque por primera vez se reporta un cultivo de células en suspensión
transformado de G. glauca (GgBa).
Desde hace de más tres décadas, se ha descrito a la cepa bacteriana de A. rhizogenes
ATCC 15834, como buena inductora de transformación genética para la producción de
compuestos con actividad farmacéutica, mismos que han sido obtenidos a partir de
diversas plantas medicinales como Panax ginseng ó Catharantus roseus ( Yoshikawa y
Furuya, 1987, Parr et al., 1988). Recientemente Nader et al. (2004), reportó el
establecimiento de un cultivo de raíces pilosas de G. glauca por infección con esta cepa
bacteriana que ha crecido durante 6 años en ausencia de fitorreguladores. De este
cultivo se generaron pequeños callos celulares que fueron desprendidos de las raíces
para establecer así un cultivo de células en suspensión denominado GgBa.
Para evaluar la transferencia de T-ADN en la línea celular de GgBa, se realizaron dos
pruebas moleculares, la primera fue con el método de PCR, utilizando los juegos de
primers específicos de los genes rol A y rol C, descritos por Bonhomme et al. (2000).
Los resultados obtenidos demostraron la integración de un solo gen (rol A) al genoma
de G. glauca, el fragmento amplificado corresponde a los primers reportados por
Bonhomme et al. (2000), confirmando de esta forma, la acción de la polimerasa para
este gen que interviene en el proceso de replicación de una de las hebras del T.ADN
(De La Riva et al., 1998). El hecho de que se haya transferido el gen rol A al genoma
Discusión
56
vegetal, explica la eficiencia del cultivo celular para crecer en forma autónoma.
También cabe destacar la posibilidad de que se haya integrado al genoma vegetal solo
una pequeña región de los otros dos genes cuyas secuencias de oligonucleotidos no
presentan un 100 % de identidad con los primers utilizados. Sin embargo, la
transferencia del gen rol A permitió establecer con éxito un cultivo de células de G.
glauca.
La segunda prueba molecular, se realizó con la técnica de Southern blotting, que se
aplicó con la finalidad de corroborar los resultados obtenidos por PCR. El ensayo se
realizó utilizando como sonda de hibridación el gen rol A obtenido por PCR, cuando el
ADN fue digerido con la enzima Eco R1, se logró detectar un fragmento. Estos
resultados positivos residen en que el marcaje para la detección permitió reconocer el
segmento homólogo en el ADN genómico de G. glauca transformado y cuyas
secuencias de oligonucleótidos correspondieron a un 100 % de identidad con la de los
primers utilizados.
Los resultados positivos con los ensayos de PCR y Southern blotting, aunados a la
independencia del cultivo para crecer en ausencia de reguladores de crecimiento por
más de tres años, constituyen evidencias experimentales que permiten confirmar la
transformación genética de la línea GgBa.
El cultivo celular de GgBa, tiene la capacidad de producir tres triterpenos diferentes;
dos de ellos han sido reportados con anterioridad en raíces pilosas (ácido maslínico y
glaucacetalina A), el tercer triterpeno constituye un nuevo nor-friedelano característico
de la línea celular GgBa, que se ha denominado glaucacetalina D, y que fue elucidado
mediante análisis de RMN.
A partir de la biomasa del cultivo GgBa, se logró el aislamiento del ácido maslínico.
Este compuesto se ha identificado en varias especies; como son Riobotrya japonica
(Yoshida et al., 2002), Paeonia suffruticos (Ikuta et al., 1995) y en raíces pilosas de G.
glauca (Nader et al., 2004). La producción de ácido maslínico en la línea GgBa (2.4
mg/g PS) fue 6 veces superior a la reportada para raíces pilosas por Nader et al. (2004)
(0.43 mg/g PS). El ácido maslínico es un triterpeno que sólo se reporta para cultivos
Discusión
57
transformados de G. glauca, mientras que en la planta silvestre y cultivos in vitro no
transformados, no se ha detectado su presencia. El ácido maslínico es un antiproteásico
contra HIV-1 (Hu et al., 1996, con actividad citotóxica en diferentes líneas celulares
tumorales humanas in vitro (Kim et al., 2000). Estas actividades son de interés
terapéutico, lo que constituye un factor adicional para ponderar la transformación de G.
glauca como un sistema interesante para la producción de metabolitos secundarios.
Glaucacetalina D representa otro de los compuestos mayoritarios, seguido por
glaucacetalina A. Ambos compuestos son excretados en el medio de cultivo donde crece
la línea GgBa. Las dos glaucacetalinas fueron aisladas del medio de cultivo, lo que
representa una ventaja tecnológica debido a que se pueden recuperar sin necesidad de
sacrificar la biomasa.
La glaucacetalina A fue identificada por primera vez en raíces pilosas de G. glauca
(Nader et al., 2004). El análisis de RMN demostró la naturaleza nor-triterpénica de este
compuesto, por la presencia de una glicona con 29 átomos de carbono. Además de
presentar características estructurales distintivas como es la presencia de un anillo
adicional formado por un puente acetálico cíclico, que no esta presente en los derivados
friedelanos de la planta silvestre (Nader et al., 2004). A pesar de que glaucacetalina A
posee similitudes estructurales con las galfiminas, la presencia de un puente acetálico y
la ausencia de una lactona α-β-insaturada evidencían la necesidad de realizar
bioensayos con este compuesto y sus derivados, para determinar sus actividades
farmacológicas y su potencial de aplicación terapeútica.
El análisis de RMN de glaucacetalina D, indica seis características estructurales
comunes con las otras glaucacetalinas: un grupo metil secundario, la presencia de dos
grupos metilo terciarios, un grupo carboximetoxilo, un alcohol terciario, una porción
vinílica formada por un grupo metilénico exocíclico, siendo la principal característica el
acetal cíclico localizado entre las posiciones oxidados en C-24 y C-25 (aldehído).
La glaucacetalina D se caracteriza por ser menos polar, por la presencia de dos grupos
acetatos y de dos grupos metoxilos, que comparada con las otras estructuras de la serie y
con las galfiminas, hacen de la glaucacetalina D una estructura novedosa. Resulta
importante mencionar que la glaucacetalina D es identificada por primera vez en la línea
Discusión
58
GgBa y es excretada al sobrenadante del cultivo. Este hallazgo permite tener mayor
información de compuestos relacionados, lo que contribuye a conocer mejor la vía
biosintética para los nor-friedelanos, de G. glauca
El hecho de que las glaucacetalina A y D, sean los compuestos mayoritarios del cultivo
GgBa y que sean excretados al medio nutritivo de GgBa, permite no sacrificar la
biomasa logrando que la recuperación de los compuestos sea más eficientemente. No se
requiere de fitorreguladores externos para su biosíntesis; sin embargo, cabe la
posibilidad de establecer un protocolo de elicitación ó adición de fitorreguladores en
estos cultivos que permitan incrementar la producción de los triterpenos de interés (Jun
et al., 2004, Osuna et al., 2008).
El ácido maslínico, se purificó a partir de la biomasa con una producción de 2.4 mg/g
PS, valor superior al obtenido en los cultivos de raíces pilosas (Nader et al., 2004). La
cinética de producción se caracterizó por su acumulación a lo largo de todo el período
del cultivo. Este compuesto no se produce en cultivos in vitro con fitorreguladores, ni
en la planta silvestre, mientras que en los cultivos de la línea GgBa se reporta su
producción con valores de 6 veces superiores a lo reportado para cultivos de raíces
pilosas de G. glauca.
El cultivo GgBa permitió la purificación de la molécula de glaucacetalina D, compuesto
triterpénico que no se había identificado en raíces transformadas ni en otros cultivos in
vitro con fitorreguladores de G glauca. La glaucacetalina D se acumulo en
concentraciones superiores en relación a la glaucacetalina A. Otra característica
interesante fue que el cultivo de GgBa se pudo crecer en un fermentador air- lift, donde
se mantuvo la producción de los compuestos de interes.
Como ya se mencionó, la síntesis de compuestos de origen triterpénico ocurre a partir
de la condensación de seis unidades isoprénicas, que en un proceso asombroso se
ciclizan para generar una gran variedad de compuestos triterpénicos. Los nor-
friedelanos, experimentan una serie de reacciones de oxidación en el anillo A,
provocando entonces la ruptura del enlace entre los carbonos 3 y 4, que al cerrarse
nuevamente dan lugar al anillo lactónico, característico de las galfiminas. En el caso de
las glaucacetalinas el anillo A permanecía preservado, pero una característica estructural
sobresaliente es la oxidación de C-25 a aldehido y del C-24 a alcohol. La reacción entre
Discusión
59
las funciones aldehido y alcohol resulta en el anillo adicional de estructuras acetálicas,
que caracteriza las glaucacetalinas.
En la figura 29, se muestra la secuencia biogenética que fue postulada para la
producción de nor-friedelanos en los cultivos de raíces pilosas de G. glauca (Nader et
al., 2004). Esta vía es esquematizada con el esqueleto estructural de nor-friedelano que
sufre una serie de oxidaciones en el anillo A necesarias para la formación de la lactona
de siete miembros característico de las galfiminas. Por otro lado, la vía de oxidación
exhaustiva del núcleo nor-friedelano en las células transformadas de raíces y de la línea
GgBa, origina una estructura acetálica entre C24-C25 que es el constituyente principal de
las estructuras de las glaucacetalinas A, B, C. Dentro del esquema se hace la integración
de la glaucacetalina D, obtenida en este trabajo.
El hallazgo de la glaucacetalina D, es sin duda un compuesto que contribuye en
completar la ruta de los nor-friedelanos producidos por Galphimia glauca.
Discusión
60
NADPH
CO2 H2O;
HO
H
OFriedelanos
O
H O
+
oleano
FridelinaNor-friedenos
O
H OH
HOOC
HO
HO
OHH
HO
HHO
OH
OAc
OHO
HHO
B
HO
H
OH
OHO
HCH3O
HO
OA c
CH3 OOC
25
C
Glaucacetalinas
76
25
2
CH3OOC CH3OOC
HO
CH3OOC
2
25
24
HO
H
OH
OH
OH
O
HHO 25
24
O
HO
H OH
OH
OH
OH
HO
A
OH
AcO
H
OH
OHO
HHO
HO
OAc
CH3OOC
2
H
O
Ac O
OH
OAc
HHHOOH
2
3
2324
25
6 7
20
4
810
12
14
1718
26
28
29
27C
C 3OH
C OH3 2D
O
HO
2
CH3OOC
3
2324
6 7
24
CH3OOC
423
2 1
O
Galfiminas HO
H OH
OHOAc
HO
HO H
O
H
O
HO
HO
OH
OH
OAcH
CH3OOC
HO
O
O
H H OH
OAcOH
12
3
24
5
4
O
C OOH
H O
HO
2
12
Acido Acido maslmaslííniconico
Planta silvestre Cultivos in vitro transformados (raíces, células en suspensión)
Figura 29. Integración del nor-friedelano (glaucacetalina D) a la propuesta biogenética de cultivos transformados de G. glauca.
Conclusiones
61
10. CONCLUSIONES
• Se selecciono y estableció un cultivo en suspensión de células transformadas
genéticamente de Galphimia glauca (GgBa) a partir de un cultivo de raíces
(línea VYT) que fue infectado con Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834, y
que crece en ausencia de fitorreguladores.
• Se confirmó la transformación genética de la línea celular GgBa por PCR y por
Southern blotting, corroborando la presencia del gen rol A en el genoma vegetal
de GgBa.
• El análisis químico de los cultivos de la línea GgBa permitió aislar e identificar
un nuevo nor-friedelano que fue denominado glaucacetalina D. La elucidación
estructural de glaucacetalina D permitió presentar elementos novedosos en la
ruta biosintética de las glaucacetalinas, permitiendo postular la participación de
glaucacetalina D, en la vía de síntesis de los nor-secofriedelanos.
• Los estudios químicos comprobaron la biosíntesis de triterpenos en los cultivos
de la línea GgBa, pudiendo identificar a las glaucacetalinas A y D en el medio
de cultivo y al ácido maslínico en la biomasa.
• Se estableció un cultivo tipo lote de GgBa por 32 días, lo que permitió conocer
el comportamiento cinético y el tiempo de duplicación del cultivo, logrando
identificar y cuantificar al ácido maslínico, a la glaucacetalina A y a la
glaucacetalina D, siendo esta última el compuesto mayoritario.
Perspectivas
62
11. PERSPECTIVAS
De acuerdo a los resultados obtenidos en este proyecto de investigación se enmarcan las
siguientes perspectivas.
1. Estudiar el efecto de fitorreguladores adicionados al medio de cultivo de GgBa, en
cultivos en dos fases para incrementar la producción de triterpenos.
2. Estimular la producción de los compuestos de interés con la adición de elicitores
bióticos y abióticos a los cultivos.
3. Establecer el potencial terapéutico de las glaucacetalinas, a través de investigaciones
farmacológicas utilizando modelos in vitro e in vivo.
4. Elucidar el compuesto triterpénico que se generó en el reactor air-lift de 2 L.
5. Realizar estudios a nivel reactor con volúmenes más altos, y cuantificar la presencia
de los nor-friedelanos así como la posible presencia de otros triterpenos interesantes.
Bibliografía
63
12. BIBLIOGRAFÍA
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67
ANEXO. Manuscrito enviado a la revista Planta Medica
Original Paper
Transformed Cell Suspension Culture of Galphimia glauca Producing
Nor-friedelanes
Anabel Ortíz1, Alexandre Cardoso-Taketa1, Mario Rodríguez Monroy2, Jesús Arellano3,
Gergina Hernández3, Ma. Luisa Villarreal1*
Affiliation 1 Centro de Investigación en Biotecnología, Universidad Autónoma del Estado de Morelos,
Cuernavaca, Morelos, Mexico
2 Centro de Investigación en Productos Bióticos, Instituto Politécnico Nacional, Yautepec,
Morelos, Mexico 3 Centro de Ciencias Genómicas, Universidad Nacional Autónoma de Mexico, Cuernavaca,
Morelos, Mexico
Correspondence
Dr. Ma. Luisa Villarreal, Centro de Investigación en Biotecnología, Universidad Autónoma
del Estado de Morelos. Av. Universidad 1001, Col. Chamilpa, Cuernavaca 62209 Morelos,
Mexico. E-mail: [email protected]. Phone: +52 777 3 297057 Fax: +52 777 3 297030
68
Abstract.
Galphimia glauca (Cav.) Kuntze, Malphigiaceae is a Mexican species with
anxyolitic and sedative properties that synthesizes a family of nor friedelanes denominated
as galphimines. In order to induce higher production of the bioactive principles,
transformed calluses and cell suspension cultures of this species were established. The cell
suspension cell line GgBa was selected and grown in MS nutrient medium, in the absence
of phytohormones for a period of two years of continuous sub-culturing. PCR and
Southern-blot analyses were employed in order to confirm the integration of the rol A gene
into the plant genome. Batch cultures of the GgBa cell line were grown for 32 days in MS
nutrient medium, in the absence of phytohormones. First order growth kinetics was
observed, reaching a specific growth rate (μ) of 0.13 d-1. The production of glaucacetalin A
(10), a triterpenoid related to the known galphimines was quantified by HPLC in the
nutrient medium. The transformed cell suspension culture GgBa also synthesized a novel
nor friedelane and which was named as glaucacetalin D (13). The structural elucidation of
glaucacetalin D was performed by the application of high resolution spectroscopic and
spectrometric techniques. This triterpene has never before been observed in wild plant
material or in other in vitro cultures. In cell biomasses, maslinic acid (14) was identified.
The triterpene production of the cell line GgBa was as follows: glaucetalin A, 2.89 mg/L;
glaucacetalin D, 2.9 mg/L and maslinic acid, 2.4 mg/g dry weight.
Key words
Galphimia glauca , Malpighiaceae, transformed suspension cultures, triterpenes,nor-
friedelanes
69
Introduction
A family of nine nor-secofriedelanes designated as galphimines A–I (1-9) were isolated
and elucidated from extracts with sedative activity obtained from the aerial parts of
Galphimia glauca (Cav.) Kuntze, a member of the malphigiaceaes which is traditionally
employed for the treatment of central nervous system disorders [1],[2]. From these
compounds, galphimines B proved to have sedative action using in vitro models [1] while
galphimines A and B displayed anxiolytic activity in mice [3]. The yield of galphimines
harvested from wild specimens is low, and their accumulation in the leaves fluctuates
depending on stationary as well as ontogenic variables. Moreover, these sedative principles
accumulate only in populations of G glauca growing in restricted locations of Mexico, as
we were able to demonstrate in a recent investigation [4]. These situations make difficult
the obtaintion of an adequate supply of raw plant material from this species, that is required
to conduct pharmacological and clinical assays, and for the further commercialization of
this plant species.
There is an actual need to characterize the biosynthetic pathways involved in the
production of the active norfriedelanes and to establish biotechnological investigations in
order to induce higher production of these sedative principles. To obtain plant genotypes
with the capacity for expressing higher and controlled levels of the sedative compounds, we
established in vitro cell and organ culture systems of G. glauca. Initially, we developed
callus and cell suspension cultures in which nutritional and hormonal factors as well as
different process formats were evaluated and optimized to induce cell growth and synthesis
70
of galphimines B and E [5],[6]. More recently, we established transformed hairy root lines
by infecting cotyledons of G glauca with Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 [7].
These transformed cultures synthesized galphimine E, three major new norfriedelanes
structucturally related to galphimines that were designated as glaucacetalins A–C (10-12),
and maslinic acid. Even though these results show that hairy root cultures can be used to
produce norfriedelanes of G.glauca, their scale-up in higher volume bioreactors may be
difficult, as has been proven with other plant species, preventing the use of this technology
on a commercial scale [9]. Cell transformed cultures represent a potentially valuable
system, capable of synthesizing an important number of secondary metabolites [10]. In
comparison with non-transformed systems, the transformed cultures exhibit stable and
homogeneous fast growing biomasses, which are more easily scaled-up into high capacity
bioreactors, than is the case for roots [11].
This paper is concerned with the establishment of transformed callus ans cell suspension
cultures of G. glauca by regeneration of hairy roots from this species. The polymerase
chain reaction (PCR) and Southern blot analysis were used to verify the transformed state
of the cultures. By means of chemical analyses of the culture medium, accumulation of
glaucacetalin A (10) was evaluated, and a new norfriedelane (13) was isolated and
elucidated by high resolution spectroscopic and spectrometric techniques.
71
Material and methods
Plant material
Undifferentiated calluses were obtained from tissue growing in small aggregates in the
center of hairy roots (line VYT), which were previouslly established by infection of G.
glauca explants with Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 [7].
Culture of transformed calluses
Small callus tissue was separated from hairy roots and transferred to solid B5 medium
without phytohormones, supplemented with 3% sucrose and 1.5 g/L polyvinilpirrolidone
(PVP). This plant material was incubated at 25oC in white light (illumination of 25uMn-2
s-1) and subcultured every 15 days.
Cell suspension cultures
Cell suspension cultures were established from friable calluses using an inoculum of 1.1 g
L-1 dry weight. The suspensions were initiated in 250-ml Erlenmeyer flasks each
containing 100 ml B5 media with 3% sucrose, without hormones and supplemented with
3g/L of polyvinilpirrolidone. The cultures were agitated in a rotary shaker (110 rpm) in
light conditions as described above, and subcultured every 15 days.
For kinetic studies, the cultures were established in a batch mode during 32 days, and the
following parameters on growth and metabolite production were measured every three days
(three replicates): dry weight, fresh weight, pH, cell viability, and triterpene production.
Fresh weight was determined as filtered biomass, dry weight after lyophilization and cell
72
viability using the fluorescein diacetate method. Identification and quantification of
trierpenes were carried out by HPLC analysis as described in the corresponding section.
DNA analysis
DNA from infected calluses and cell suspensions as well as from untransformed controls
was obtained using the ADN PureGene method (Gentra Systems, Minnesota USA). The
DNA of A. rhizogenes ATCC 15834 was isolated according to standarized protocols
(Puregene)
The polymerase chain reaction (PCR) was used to confirm the presence of rol A and rol C
genes in calluses and cell cultures. PCR experiments were performed using the following
specific primers [12]: for rol A gene the nucleotide sequences for positions 21-42 (5´-
CGTTGTCGGAATGGCCCAGACC-3´) and 268-246 (5´CGTAGGTCTGAATATTCC
GGTCC-3´) were designated by generating a DNA fragment of 248 bp; rol C primers for
positions 51-70 (5´-TGTGACAAGCAGCGATGAGC -3’) and 550-531 (5´ GATTGCAA
AC TTGCACTCGC -3´) were used to amplify a fragment of 490 bp. Every PCR reaction
was performed through the use of PCR SuperMix (Invitrogen) in a 22.5 µl containing 200
nM of each oligonucleotide and 300 ng of genomic DNA. The mixture was amplified in a
thermocycler according to the following conditions: one cycle of 95 oC each 5 minutes,
followed by 35 cycles of one minute denaturation at 95 oC, one minute of annealing at 45
oC followed by one minute of extension at 72 oC. The annealing temperature was of 50 for
rol A and rol C .The amplified DNAs were analyzed by electrophoresis on 1.0 % (w/v)
agarose-TBE gel, run at 80 volts, and visualized by staining with ethidium bromide.
73
For southern blot analysis, DNA (15 ug per reaction) was digested with Hind III, EcoR1
and BamHI, electrophresed on a 1% agarose gel and blotted onto a nylon membrane
(Hybond Plus Amersham).The blot was pre-hybridized for 2 h at 65 oC and hybridized
overnight to a 32P-labeled probe for rol A gene.. The probes were obtained by PCR using A.
tumefaciens ATCC 15834 as templates and gene-specific primers for rol A gene as
previously described. Labeling was performed using the Amersham Megaprime TM ADN
Labelling System RPN 1607. After hybridization, the membrane was washed 30 min in 2x
SSC, 0.1% SDS at 65 oC; 30 min in 0.5x SSC, 0.1% SDS at 65 oC and 45 min in 0.1x SSC ,
0.1% SDS at 65 oC. The filter was then exposed to X-ray film between intensifying screens
for 4 h at -70oC.
Isolation and purification of norfriedelanes
The nutrient medium collected after several subcultures was subjected to three extractions
each using 30 ml of AcOEt. The extracts were combined and evaporated to dryness. After
fractionation of the residue over a silica gel column using a gradient of CHCl3 and MeOH
(0-10% v/v) as eluent. Fractions were collectd , examined by TLC and combined to yield a
crude mixture of norfriedelanes (10 and 13). The final purification was achieved using
silica gel 60 (15-40µm) and an isocratic elution of CHCl3 and MeOH (5% v/v), where an
enriched fraction with compound 13 (12 mg) was chromatographed and 10 fractions (each
of 0.8 mL) were collected. Fraction number 8 yielded 3.1 mg of the pure compound 13.
Identification of glaucacetalin D
White amorphous powder, C35H54O11, m.p. 187-189 °C; [α]25D: +35.1 (c 0.6, CHCl3); HR-
FAB-MS: m/z = 649.3436 [M+H]+ (calcd. for C35H54O11). 1H- and 13C-NMR: see Table 1.
74
Identification and quantification of triterpenes
Cell suspension samples were harvested every three days affording biomasses and nutrient
media. The media (100 mL) was filtered from the biomasss and extracted (3x) using 10 mL
of AcOEt. The organic layers were dried, filtered and reduced to 500 uL to be nalyzed by
HPLC after filtration through a millipore filter (0.5 ug). The biomassses were lyophilized,
grounded, and extracted (3X) with AcOEt (10 mL) for 10 min by sonication at room
temperature. Each extract was reduced to 500 uL after filtration through a millipore filter
(0.5 ug).
Preparation of standards. For preparation of standards, purification of glaucacetalin A,
glaucacetalin D and maslinic acid were carried out as described earlier [2], [7].
The identitity of maslinic acid was confirmed through 1H and 13C NMR spectroscopic
analysis and by comparison with reported data [13].
HPLC analysis. The instrumentation for HPLC analysis consisted of a Waters (Millipore
Corp., Waters Chromatography Division, Milford MA) 600E multisolvent delivery system
equipped with a Waters W996 diode array detector (212, 216, and 232 nm) and an
automatic sample delivery system. Control of equipment, data acquisition, processing, and
managment of chromatographic information was performed by the Millenium 32 software
program (Waters).
Identification of compounds. The identification of glaucacetalins A and D was achieved
using an HPLC procedure previouslly described (Taketa el al, 2004) and by comparison
with retention times of authentic samples through HPLC co-elution experiments.
75
Quantitative determinations. Suitable calibration curves for glaucacetalin A (10),
glaucacetalin D (13) and maslinic acid (14) were constructed by a series of injections of
standard solutions over a range of 0.02 – 2 mg/L. Determinations were carried out in
duplicates and the peak area was measured to obtain average results for each calibation
curve. Correlation coefficients of the calibration curves (> 0.9907) demostrated that the
relationship between peak areas and concentrations of each standard was liner under these
cromatograhic conditions. Sample solutions (500uL) were injected and the peak areas were
compared with calibration curves.
Results and Discussion
Establishment of cell suspension culture
G.glauca undiferrentiated tissue emerging from the hairy root cell line VYT (Fig 1), were
susceptible for cultivaltion, and abundant independent growing in B5 solid nutrient media
without phytohormones was observed. Various problemes were afforded in order to initiate
cell suspension cultures, and after 12 sequential subcultures the cell suspension line GgBa
was succesfully grown in MS liquid medium without phytohormones. The use of flasks
with bafles, proved to be effective for tissue disgregation. This cell line was selected for the
analysis of genetic transformation, as well as kinetic growth and production of nor-
friedelanes, because of its degree of homogeneous growth, its viability and level of
triterpene production (as observed by TLC).
Confirmation of cell suspension transformation
Specific sets of primers for the rol A and rol C genes were used for PCR analysis (Fig 2).
This experiment showed that the transformed cell suspension line GgBa (lane 3), as well as
76
the positive control (DNA extracted from A rhizogenes 15834, lane 2) contained the rol A
gene of 248 bp. Untransformed G. glauca cell suspensions were used as negative controls
(lane 4). The transformed status of the culture was confirmed by means of Southern blot
analysis (Fig 3). The 248 bp fragment of rol A generated by PCR was used as a probe.
DNA from the GbBa transformed cell line and from positive and negative controls were
digested, using the restriction enzymes Hind III, Bam H1 and Eco RI. When GgBa DNA
was digested with EcoRI and probed with the rol A fragment, one hybridizing band of high
molecular weight (2.4 Kb) was identified (lane 5). These data indicated that the signal was
due to the integration of T-DNA into the plant genome. Rol C gene was not detected in
GgBa using the above mentioned procedures. It is possible that the transfer of this gene into
the plant genome was somehow incomplete, and identity of this genetic material with the
primers employed for identification, did not reach a hundred percent identity.
Isolation and structural elucidation
The major compound (13) was isolated to total purity from the culture medium by
application of open column chromatographic procedures. The elucidation of its structure
proved to be a new nor-friedelane related to the known galphimines (1-9) which are the
sedative principles isolated from aerial parts of wild specimens, and to the recently
described glaucacetalins A-C (10-12) .
The analysis of the NMR data (1H, 13C, DEPTs 90 and 135, HH COSY, HSQC and
HMBC) of compound 13 indicated the basic skeleton for all previously reported
glaucacetalins [7]. The following structural features common for the glaucacetalins were
observed: one secondary methly group at C-4 (Me-23, δ 13.5/1.08); two tertiary methyl
77
groups for Me-26 (δ 21.7/1.38) and Me-28 (δ 25.4/1.05); one methoxycarbonyl group at C-
27 (δ 3.45/51.4); one cyclic acetal at C-25 (δ 5.33/101.3) and an attached methoxyl group
(δ 3.33/55.3); one tertiary alchohol at C-18 (δ 78.1); one exomethylene vinylic moiety (H2-
29: δ 108.9/4.46 and 4.68); and two acetate groups linked at C-3 (δ 2.07/21.1/170.4) and at
C-7 (δ 2.08/22.1/174.0). The acetal nature of glaucacetalin D (13) was confirmed through
HMBC connectivity experiements for which the acetal carbon C-25 (δ 101.3) showed long-
range correlations (3JCH) with the methoxy group centered at δ 3.33.
Glaucacetalin D (13) is the less polar compound from the glaucacetalin series in the TLC
analysis, due to the acetylated positions at C-7 and C-3, and the presence of the methoxyl
groups at C-27 and, specially, at C-25. A comparative analysis of the chemical shifts
displayed for glaucacetalin D (13) and the analogues glaucacetalins A-C (10-12)
corroborates its structural elucitadion. The principal features assigned for 13 were in
accordance for the presence of an additional acetate group linked at C-3, as in 10 (proton
deshielding effect around 1.3 ppm), and an additional methoxy group building the cyclic
acetal ring, as in 11 (proton shielding effec around 0.6 ppm).
Kinetic growth and production of triterpenoids
The results of a 32 day batch culture of the cell line GgBa, growing in MS medium in the
absence of hormones are shown in Fig.4. The maximum biomass concentration obtained
on day 16 was 23.3 g dry weight L-1 (DW L-1), which corresponded to 13 times the initial
dry weight. Cell viability was between 85 and 100% during the incubation time. Root
78
growth followed first order kinetic with a mean specific growth rate (μ) of 0.13 d-1.
During the time in culture, pH was of 5, with a small decrease at day 8.
Triterpenes were identified at different growth phases in both the cell suspension biomass
as well as in the culture media in order to establish the kinetics of their production.
Maslinic acid (14) obtained from cell biomass at day 24 exhibited maximum production of
2.4 mg/g DW and showed a discontinuos pattern of accumulation during the time in
culture (Fig. 5). Kinetic production of glaucacetalins A and D recovered from the media,
showed significant variantons in production during the culture period. Maximum yield of
glaucacetalin A (2. 7 mg/L) was reached at day 26, and maximum productivity ( 0.10
mg/L/d). Glaucacetalin D was recovered with a maximum accumulation of 2.9 mg/L at
day 26, and a maximum productivity of 0.11 mg/L/d. As it has been shown previosly [8]
the production of glaucacetalins has been observed in hairy root cultures of G. glauca , and
have never been identified either in vitro or in the wild material, showing that the metabolic
pathway for this type of compounds is actively expressed in the transformed material of this
species, when compared to that in the original plant state. Transformed cell suspension of
G. glauca derived from hairy roots, maintained the ability to synthesize glaucacetalin A and
maslinic acid, and were able to produce glaucacetalin D. The information gathered with
this investigation and the identification of the novel glaucatetalin D, will contribute to
elucidate the metabolic pathway for the production of bioactive nor-friedalenes from this
species.
79
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81
Table. 1H- and 13C-NMR data (δ values, CDCl3, J in Hz) for compounds 10 and 13.
Position 10 13
δH δC δH δC 1a 1.71 25.5 1.53 25.1 1b 2.43 2.34 2 3.85 66.5 3.83 66.4 3 4.61 t (2.9) 76.9 4.60 t (3.2) 74.2 4 1.98 37.5 37.3 5 42.7 42.6 6 3.49 85.4 3.49 85.5 7 5.54 dd (10.9, 7.0) 78.7 5.54 dd (11.1, 7.1) 78.8 8 2.34 d (10.9) 51.6 2.33 d (10.9) 51.8 9 40.6 40.7 10 1.42 40.9 1.30 41.1 11a 0.85 31.1 0.82 30.8 11b 2.20 2.20 12a 1.95 23.3 1.95 23.4 12b 2.10 2.10 13 57.4 57.3 14 43.4 43.3 15a 1.25 29.9 1.12 29.7 15b 2.95 2.90 16a 0.90 34.7 0.94 34.7 16b 1.98 1.98 17 37.5 37.5 18 78.1 78.1 19a 2.10 42.5 2.10 42.4 19b 2.98 d (15.2) 2.98 d (15.3) 20 144.7 144.7 21a 1.98 28.6 1.94 28.6 21b 2.30 2.25 22a 1.04 35.7 0.93 35.7 22b 2.04 1.95 23 1.09 d (7.3) 13.5 1.08 d (7.1) 13.5 24a 3.78 d (11.5) 54.8 3.76 d (11.2) 54.7 24b 4.23 d (11.5) 3.93 d (11.2) 25 5.93 d (3.1) 94.2 5.33 101.3 26 1.35 s 21.7 1.38 s 21.7 27 175.6 175.6 28 1.05 s 25.5 1.05 s 25.4 29a 4.47 q (2.4) 108.9 4.46 q (2.4) 108.9 29b 4.68 q (2.4) 4.68 q (2.4) 25-OCH3 3.33 s 55.3 27-OCH3 3.47 s 51.4 3.45 s 51.4 3-Ac 2.07 s 21.1/170.5 2.07 s 21.1/170.47-Ac 2.08 s 22.1/173.9 2.08 s 22.1/174.0
82
14 Maslinic acid
Galphimines R1 R2
1 H H 2 OAc H 3 OH H 4 OH Ac 5 H H 6 OAc H 7 OH H 8 OH Ac 9 H H
Glaucacetalins R2 R3
10 AC H 11 H Me 12 H H 13 Ac Me
O
O
H
R
OH
H OH
HOH
MeO2C
1
MeO2C
H
OAc
H OHHO
O
H
OH
R O3
R O2
HO
COOHHO
83
Fig. 1 Calluses of G. glauca emerging from the hairy root cell line VYT
84
1 2 3 4 12 Kb 0.5 Kb Fig. 2 PCR analysis of G. glauca transformed cell suspension culture VYT. Lane 1 = DNA marker; lane 2 positive control from A. rhizogenes showing rol A gene; lane 3 DNA from GgBa cell suspension line in which rol A of 248pb integration was positive; lane 4 untransformed G glauca cell line
85
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
12 Kb
2.4 Kb
0.5 Kb
Fig. 3 Southern blot analysis of the transformed cell suspension line GgBa carried out
using as a probe the PCR product of rol A gene. Lane 1 = DNA marker 1KB; 2 = Total
DNA from GgBa; lane 3 = DNA from GgBa digested with Hind III; lane 4 = DNA from
GgBa digested with Bam H1; lane 5 = DNA from GgBa digested with EcoR1; lane 6 =
Total DNA from A. rhizogenes; lane 7 = DNA from A. rhizogenes digested Hind III; lane
8 = DNA from A. rhizogenes digested Bam H1; lane 9 = DNA from A. rhizogenes
digested with Eco R1; lane 10 = Total DNA from untransformed G. glauca cell line; lane
11 = Untransformed G glauca DNA digested with Hind III; lane 12 = Untransformed G.
glauca DNA digested with Bam H1; lane 13 = Untransformed G. glauca DNA digested
with Eco R1; lane 14 = DNA marker 1KB.
0
5
10
15
20
25
30
0 5 10 15 20 25 30 35
Time (d)
0
20
40
60
80
100
120
Bio
mas
s(m
g/g
DW
)
pH
Via
bilit
y(%
)
Fig. 4 Typical growth, pH and cell viability of the transformed cell suspension line GgBa of
G. glauca grown in MS medium (n = 3 + SD).
86
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
0 5 10 15 20 25 30 35
Time (d)
(mg/
L)
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
Gla
ucac
etal
inD
Gla
ucac
etal
inA
Mas
linic
acid
(mg/
g D
W)
Fig. 5 Production of triterpenoids in cell suspensión cultures of Galphimia glauca.
Glaucacetalins A (10) and D (13 ) recovered from the culture media and maslinic acid (14)
recovered from biomass (n = 3 + SD).
87