ana portela arteaga - e-prints complutense

Ana Portela Arteaga

“CONTRIBUCIONAL ESTUDIODE LA CRONOFJSIOLOGIzI:

ASPECTOS EXPERIMENTALES”

DepartamentodeFacultadde

FisiologíaAnimalVeterinaria

UniversidadComplutensede Madrid1993

“CONTRIBUCIONAL ESTUDIO

DE LA CRONOFISIOLOGJA:

ASPECTOSEXPERIMENTALES”

MEMORIA que para la obtención

del grado de Doctor, presenta la

LicenciadaenVeterinariaDña. Ana

PortelaArteaga.

ESTA TESISHA SIDO REALIZADA BAJO LA DIRECCION DE:p

(

tU -

Prof. DÍfD JuanCarloslitera del Portal.

Licenciada Dña. Ana

Arteaga, aspirante al

Doctor en Veterinaria.

Portela

grado de

Madrid, Febrerode 1993.

ESTE TRABAJO HA SIDO REALIZADO EN:

* CHRONOBIOLOGYLABORATORIESUNIVERSITY OF MINNESOTABajo la dirección de:

PROF. FRANZ HALBERG

* DEPARTAMENTODE FISIOLOGíAFACULTAD DE VETERINARIA. UCM.Bajo la dirección de:

PROF. JUAN CARLOSILLERA

A mi familia y amigos

AGRADECIMIENTOS

Si citase a todaslas personasque, de algunaforma, me han ayudado en la

realizaciónde este trabajo,creo quepodríaescribir otra Tesis.Pero desdeestaspáginas

quiero agradecera todos los que meprestaron suapoyo, tanto de forma moral como

material El orden que ocupanen estaspáginas, no es un orden de importancia,pues

todos merecerían sercitadosenprimer lugar

Quiero agradecerenparticular a mi director de Tesis,el Prof Dr Juan Carlos

filera del Portal, Profesor Titular del Departamentode Fisiología; apanedel esfuerzoy

tiempoque meha dedicado~por su estímulo, suempujey su ubicuidad.Gracias.

Quiero manifestarmi agradecimientoal Prof Dr Franz Halberg considerado

comoel padrede la cronobiologíay Director del Laboratorio de Cronobiología de la

Universidad de Minnesota,porque él fue quien me introdujo en estemundo de la

cronobiologíaymeha enseñadotodo lo que acerca deella sé, teniendosupuertasiempre

abiertaparacualquierconsulta,transmitiendomesuentusiasmoy haciéndomeaprovechar

de un día, sus ‘25’ horas.

Asimismo,quiero manifestarmi agradecimiento alProf Dr D. Mariano fIlera

Martín, Catedrático-Directordel Departamentode Fisiología Anima4 por haberme

facilitado los mediospara comenzarmi andadurapor estecampotan apasionante.

Deseodar las graciasa todas las personasque meayudaronen la realización de

esteestudio,en cuantoal “material” empleadoen él, porquesin ellas no hubiesepodido

ser llevado acabo.Aunquelos estudios longitudinalesenpersonassanasfueronllevados

a cabo en mimisma,deboagradecera otras muchaspersonasque tambiénllevaron a

cabo estudios semejantes,las cualesmepermitieron hacer uso de susdatos. Le estoy

sinceramenteagradecidaa la Dra. EmaHalbergporpermitirme analizar suslargas series

de datos demarcadoresde crecimiento.Ema esperoque algún día y gracias a la

cronobiología, podamos ponersolución a tu enfermedadgracias tambiénpor tu gran

hospitalidad.

Quiero darle las gracias a Germaine, Dra. Cornélissen, Directora dc

Cronobiometríade la Universidad de Minnesota,por guiarme en cada pasode los

análisis, asícomoporcedermegráficose inestimablesdatos, tanto de ella misma,como

los del equz~ointernacionalquecon ella trabajan.

Gracias a Ma¡ySampson,que durantemi estanciaenMinnesotameproporcionó

una inestimableayuda escribiendoa máquinay corrigiendo mi inglés.

Gracias a todosmis “compis” del Departamentode Fisiología Anima4por sus

consejos,su ayuday sus largas cartasescritas’~ gracias a Gema,Pedro, May, MU José,

Anay Ramón.Gracias a las ‘Ma Josés”por su ayuda:a M~José(secre,quienmecedió

‘isin rechistar’ su PC), a MU José (Centro de Cálculo) y a MU José(Illera).

Lesdoy las graciasa mispadres,porquegraciasa ellos hellegado dondeestoy;a

mi madrepor ‘soportanne” con tanta pacienciadurantetanto tiempoy a ini padrepor

inculcarmesus ideas de trabajo ytesón.

A lkabely a Queta, graciaspor todos esoslargosfinesdesemana(y madrugadas)

dedicadosa las tablas y a la bibliografía, y a Peluy JoséManuelpor la ayuda queme

han prestado.

A Alberto, graciaspor ser tan positivo en todoslos momentosy por darmetodo

su apoyo, moraly materiaL

Enfin, graciasa todoslos que cuandoestuve lejos hicieronquemesintiesecerca.

CONTENIDO

CONTENIDO

OBJETIVO 2 - 3

INTRODUCCION 4-59

VARIACIONES CIRCADIANAS DEL CORTISOL

MARCADORES DE CRECIMIENTO, CA125 y CA13O

PRESION SANGUíNEAY FRECUENCIACARDIACA

DISEÑO EXPERIMENTAL

ANALISIS DE DATOS EN CRONOBIOLOGIA.

MATERIAL Y METODOS 60 - 75

OBTENCION Y ANAUSIS DE LAS MUESTRAS .... 61 -70

Experimento1: Variación circadianadel cortisol

Experimento2: Marcadoresde crecimiento,CA125

y CAI3O

Experimento3: Alofasecircatrigintanaentrepresión

sanguíneay frecuenciacardiaca

METODOLOGíA ANALíTICA CRONOBIOLOGICA 70-75


Experimento2: Marcadoresde crecimiento,CA125 y

CAI3O

Experimento3: Alofasecircatrigintanaentre presión


RESULTADOS 76 -126


Experimento2: Marcadoresde crecimiento,CA125 y

CA13O



DISCUSION 127 -145


Experimento2: Marcadoresde crecimiento,CA12Sy

CA13O



CONCLUSLON 146 -147

GLOSARIO 148 -161

BIBLIOGRÁFIA 162 -189

ABREVIATURAS

a Nivel de Probabilidad

r Periodo

4, Acrofase

Equiva]e

a Años

A Amplitud

a.m. Ante meridiano

ACTH Hormona adrenocorticotropa

ADH Hormona antidiurética

ANOVA Analisis de Varianza

AP Ana Portela

GradosCentígrados

CA125 CancerAntigen 125

CAI3O CancerAntigen 130

cm Centímetros

CRH Factorliberador de corticotropina

CV Coeficientede Variación

d Días

DL Dosis Letal

EH EmaHalberg

ELISA Enzimo inmunoanálisis

ES Error Standard

f Frecuencia

F F de Snédécor

FC Frecuencia Cardiaca

g Gramos

G Gauge

GC GermaineComnélissen

h Horas

Hipótesisnula

RíA Radioinmunoanálisis

RSS Sumaresidualde los cuadrados

SD SerialmenteDependiente

SI SerialmenteIndependiente

t t de student

U Unidades

UCM UniversidadComplutensede Madrid

VR Proporciónde Variabilidad

W Formade la curva

OBJETIVO

Como es muycomún hoy en día y desdehacemuchosaños,los animalesse

utilizan enexperimentación,casisiempreconla ideadepoderaplicar,posteriormente,

a los seres humanoslas “ventajas” y solucionesqueen ellosencontramos.Pero antes

depoderemplearestosresultados obtenidosde la experienciaanimal en las personas

deberíamostenerun conocimientomásexactode la fisiología de los mismos,por esto

creímosconvenienteahondarenel campode la cronofisiologíay teneren cuenta la

influencia del tiempo en todaslas variablesbiológicasque hoy en díase investigan.

Tambiénnos pareció oportunoprofundizarmás enel campode los diseñosde los

estudiosexperimentalesquellevamosacaboenlos animales,parapoderevitarla gran

variabilidad que existe en los parámetrosy a la que hacereferenciala bibliografía

actual, dandounos márgenesfisiológicos muy ámplios; por ejemplo, los niveles de

referencia de cualquierhormona, no sólo una variabilidad interespecíficasino

intraespecífica.

Estudiamos la existencia de lo(s) ritmo(s) del cortisol plasmático y

comprobamosla variaciónde susconcentracionesen el tiempo, dandounosperfiles

másprecisosque los encontrados hastaahora.

Asimismo, quisimoscomprobarlasdiferenciaso similitudesexistentesentrelos

ritmos del cortisol de distintosconejos(NZW) alojadosen diferentesciclos de luz-

oscuridady si existía algunadiferenciaen las concentracionesde cortisol al obtener

las muestrasde forma serialmentedependienteo independiente.

Por otro lado, comouno de los objetivosprimordiales,en biomedicina,es la

lucha contralas enfermedadesactualescomoson el cáncer,el SIDA, enfermedades

cardiovasculares(infartos de miocardioo hipertensión) frente alas cualeshoy endía

no existenverdaderassoluciones,debemosponertodos los mediosa nuestroalcance

paraencontrarlasy, sobretodo, prevenirlas.Estees unode los objetivos principales

de la cronohiología:la prevenciónde muchasde lasenfermedadesdenominadasen

la actualidadcomo“incurables”y si estono esposible,al menos lograrunatemprana

detección delas mismasmedianteun control rutinario, comoesel seguimientode los

parámetrosde los ritmos (MESOR, amplitudy acrofase)

2

Por las razonesanteriormenteexpuestas,hemos estudiadolos ritmos delos

incorrectamentellamados“marcadorestumorales”(marcadoresdecrecimiento)CA125

y CA13O, empleadosenel seguimientode la evoluciónde tumoresginecológicos,para

prevenir la aparición deestos tumores,o una vez detectadosllevar a cabo una

correctacronoterapia.

Asimismo seestudiaronla frecuencia cardiacay la presiónarterialintentando

conocer sus ritmos como el circadiano, circacentuminutano, circasemidiano,

circatrigintano,etc,y de estaforma, al detectarcualquieralteración enlos parámetros

de los mismos,poderprevenirenfermedadescardiovasculares.

3

INTRODUCCION

La cronobiologiaes la ciencia que se ocupa de cuantificar e investigar,

objetivamente,los mecanismosde la estructuratemporalbiológica,el cronoma,que

incluye las manifestacionesrítmicas de la vida. Fue diseñadapara describir las

característicasde los ritmos, comoson el MESOR (M), la amplitud (A), la acrofase

(~), el periodo(r), la frecuencia(O o la forma de la curva(W).

El término cronobiología,introducidopor Halberg(1957),es un neologismo

que procede delos vocabloschronos(= tiempo),bio (= vida) y logie (= ciencia).En

términos fisiológicos, proporcionaconceptosde aplicacióngeneraly técnicaspara

resolver (observar y cuantificar) problemasreferentesal estudio de los ciclos

predeciblesen el organismo,así como para aislar los efectosambientales,de los

mecanismosendógenospropios que estánenmascarados.La cronobiologíaincluye,

entre otras, las siguientes disciplinas: cronofisiologia, cronopatología y

cronofarmacología,la cual a suvez, comprendecronotoxicologíay cronoterapia(por

citar algunas).

La cronofisiología, disciplinaen la cual estamosmásinteresados,seencarga

del estudiode las manifestaciones temporalesde los procesosfisiológicos,evaluando

asimismo,las interaccionescíclicasbiológicas(endocrinas,nerviosas,metabólicas,etc.)

con el organismo,el cual sirve debasea las característicasbiológicastemporalesy a

susinteraccionesconel medioambiente.Tantola cronofisiología, comocualquierade

las disciplinascitadasanteriormente,necesitande una serie demétodosparapoder

serresueltas;la metodologíaempleadao ritmometría va a permitirdescribirun ritmo,

mediante laestimaciónde sus característicasanteriormentemencionadas:MESOR,

amplitud, acrofasey/o periodo,las cualesse calculanmediantehipótesisdeducidas

estadísticamente.

Lavida, ya seadeterminadapor bioquímicos,fisiólogoso morfólogos,envuelve

cambios en el tiempo; cualquier determinaciónde una variable fisiológica en

particular, deberíaser especificadade acuerdocon el momentoen quees estudiada.

En biología,engeneral,las diferenciasqueencontramos,por ejemplo,en funcióndel

momentodel díao del año, puedenser enormes.Normalmente podemos encontrar

5

valoresmáximosy mínimosque se repiten periódicamente;tambiénnosencontramos

con manifestacionesconsecutivasde acontecimientos similaresque ocurren en

intervalos regulares, formandociclos manifiestoso bioperiodicidades.

El tiempo biológico no essólo un componenteimportante dela vida animal

y vegetal,sino que tambiénse puededeterminarcuandolos ciclos estánocultos. Tan

prontocomose hanpodido medirlasdiferentesvariables enfunción del tiempo,y de

forma repetida,nos encontramoscon lasvariacionesperiódicas,las cualesmediante

métodos especialesde cronobiometríapuedenserresueltasy cuantificadasenlos seres

humanos,en células individualizadas procedentesde mamíferos, en organismos

unicelulares eincluso en procariotas.

Los cambiosrelacionadoscon el tiempo determinanla vida comoun espectro

de bioperiodicidades.Cambios similaresde aproximadamente(circa), pero no

exactamenteel mismo tipo y extensión, recurren en aproximadamente(no

exactamente)los mismosintervalos,enaproximadamentelas mismassecuencias,y a

todoslos nivelesdeorganizaciónde la vida animalo vegetal,desde procariotas a seres

humanos(Halberg,1969).

Las periodicidades,no siempreson ciclos precisos,son másgeneralesquela

vida, y se encuentran enmuchos de los fenómenosinvestigadospor diferentes

disciplinas, desdela astronomía hastala física cuántica.Las partículas elementales

puedenser vistascomo ondas(Hawking, 1988), las reaccionesquímicaspuedenser

periódicas,como lo son la fisiología y el comportamientode los microorganismos,

incluyendotanto alas bacteriascomo a los organismosunice]ulai-es(Giese, 1979;

Halbergy Connen, 1961); se puede decirlo mismo de las células ex vivo: p.e., las

células adrenales delratón sintetizan corticosteronain vitro no de una forma

arbitraria,sinoque cadacélulalo haceconuna periodicidadsimilar (Halberg, 1963).

Las células pinealesperfundidas también muestranbioperiodicidades(Ungar y

Halberg, 1963; Leung et aL, 1990), de igual forma que hacenlos organismos

multicelularesy tal comolos animalesexhiben comportamientos bioperiódicosensus

actividadesmotorasy de alimentación,duranteel crecimientoo el desarrolloy la

6

pubertad.

Los individuosexhibenritmos espontáneos oritmos “a”. Los ritmos reactivos

o “b” caracterizan la respuesta ante unestímulo,ya seafísico comomido o radiación,

químicocomo etanolo bacteriológicocomoendotoxinas(Halberget al., 1955; Haus

y Halberg, 1959; Halberg et aL, 1960). La respuesta a diferentesfármacos es

bioperiódica,al igual que ladosisde un fármacoo las radiacionesque matanel 50%

de los animales en30 días, la DL3% (todos estos hallazgosconducen haciauna

cronotoxicologíay cronofarmacología).Unamodulaciónpinealdel efectohipofisario

sobrela producciónde adrenocorticosteronaesun casopuntual(Sánchezde la Peña

et aL, 1983). Los ritmos “d” son intermodulacionesentre3 ó másentidades,en más

de unafrecuencia.Cuandoestosritmos sedemuestranin vivo sedesignanpor letras

griegas:los espontáneosson a, los reactivos son 13, las intermodulacionesen una

frecuenciasonl y a dos o másfrecuenciasson 6.

El margen defrecuenciasencontradoen la naturalezaes enorme,va desde

fenómenos electromagnéticosa biológicos;en estosúltimos estemargense extiende

desdemilésimasdesegundo, comolasondascerebraleso los 1000 Hz de descargade

los peceseléctricos,hastamásde cientosde años,comoel ciclo de floraciónde 120

años del bambúchino (como caso excepcional).En el espectrogeneralde las

frecuencias,las biológicas ocupan, relativamente,una banda estrecha. Algunas

frecuenciasestán normalmenteexpresadas comosusreciprocas(i/f = r ), es decir

comoperiodos,aúnasí el nombrede los dominiosdel espectrode bioperiodicidades

derivande la frecuencia.Estaelecciónde la frecuencia,envez del periodo, está hecha

parasituarlos cambiosbiológicosen relacióncon el espectrode las frecuenciasde las

radiaciones electromagnéticas.

Las bioperiodicidadescon unciclo aproximadode 24 horas,con unoslímites

aproximadosentre20 y 28 horassedescribencomocircadianasy frecuenciasmayores

o menoresque las circadianasson denominadascomo ultradianase infradianas,

respectivamente.A continuaciónvamosacitar algunosdeestosritmosbiológicos,con

susejemplos ilustrativosrespectivos:

7

REGION DEL DOMINIO MARGEN EJEMPLO

Ultradiano r c 20 h

circaoctohorano r = 8 ± 1 h Presiónsanguíneay FCcircasemidiano r = 12 ± 2 h Frecuencia cardiacay FC

Circadiano r = 24 ± 4 h PS,FC, Temperatura

diano r = 24 + 02 h FC sincronizada

Infradiano t > 28 h

circasemiseptano r = 3 5 + 1 d Muerterepentinaen humanacircaseptano r = 7 ± 1 d Rechazo trasplantescorazóncircadiseptano r = 14 ± 3 d Excrec. urin. 17-oxoester.circavigintano ‘r = 21 ± 3 d Ciclo sexualvacacircatrigintano r = 30 ± 5 d Presiónsanguínea

circanual r = 1 ± 2 m PRLycortisol

circasepteniano r= 7 ± 1 a Indice gonadalinvert. mar.circaduodeceniano r = 12 ± 2 a Presiónsanguínea

Las bioperiodicidadesde los potencialesde acción del cerebroy del corazón

registradasen un electroencefalogramao electrocardiograma, respectivamente,son

ultradianas(Franket al, 1961; Crowley et al, 1972). Las circadianasson las más

estudiadas;por ejemplo, se demostróun cambio circadiano en el recuentode los

eosinófilossanguíneosen diferentesespecies:peces,ratones, ratas,hamster,perros,

monosy humanos(Halberg,1950; Halberget aL, 1951;Flink y Halberg,1952; Halberg

y Nabias,1954; Chaudryy Halberg, 1960).Entrelos infradianosse puede observaruna

bioperiodicidadde aproximadamenteuna semanao circaseptana,en los rechazosde

trasplantesde órganos.

Bioperiodicidadesde aproximadamenteun mes, nosólo se encuentran enlas

8

mujeres,sino tambiénen los hombresy en las mujeresantes dela pubertad,cuando

existeausenciade menstruación,duranteel embarazoy en la menopausia,así como

en presenciadel ciclo menstrual.Aproximadamenteanuales ovariacionescircanuales

son comunesen condicionesfisiológicas,por ejemplo, en el peso delovario del pez

gatoJamunariver de laIndia, el cualvaría desdeaproximadamente16 g cuandosopla

el monzón,hastaaproximadamente1 g, 6 mesesmás tarde.Cuandoestos pecesse

encuentranalojadosen continuaoscuridadduranteaños,el peso delovario continúa

siendocíclico con unciclo de curso libre,de aproximadamente1 año (Sundararajet

aL, 1973, 1982). Un circaseptenianoo ritmos de 7 años, aproximadamente,se

encuentranen el índice gonadal de algunos invertebradosmarinos (bimba et al.,

1981).

Cuandolos ritmos, en el estricto sentido de la palabra,son definidos como

fenómenosconfirmadosmediantededuccióny formulables algorítmicamente,cada

organismopresentasupropiocronoma,incluyendolos ritmosde multifrecuenciaque

siguenlas tendencias delcrecimiento,desarrolloy envejecimiento.Los ritmos son

endógenos,en parte, estánprogramadosen el código genético del organismo,la

información pertinenteestá localizadaen el genper, llamado de estaforma por

periodo. Este gencodificapara sintetizar proteínasen la célula que coordinarálos

ritmos. Estoshallazgoshansido realizadosen las moscas dela fruta (Hamblen-Coyle

el aL, 1986, 1992;Hardinet al., 1990; Young, 1992)y en las levaduras,documentados

desde hacetiempo en las mismas especiesy en muchasotras,medianteel fenómeno

de curso libre (Halberg, 1970).

La endogenicidadha sido demostradaen bastantes experimenwsdiferentesy

enbastantesvariables,p.e., estudiandola temperaturaen ratonesciegos (Hauset al.,

1967). En estosratoneslas variacionesde los eosinófilossanguíneoscirculantesno

muestranun ritmo sincronizadode 24 horas(con valoresaltosduranteel periodode

luz, cuandoestánalojadosenun régimende luz quealterna12 horas de luz con 12

de oscuridad).En lugar de este ritmo de 24 horas, en las células eosinófilas

sanguíneasapareceun ritmo de 23,5 horasen un ciclo ambientalde 24 horas de luz

y oscuridad.Esteestudiosellevó a caboen paralelocon otro grupo de ratones con

9

visiónnormal enlos cualesseencontróun ritmo de 24 horas.Los análisisrealizados

a mediodíay a medianoche enlos grupos de ratonesciegos al principio eranmuy

confusos;paraempezar,los ratonescon visiónnormal teníanun pico en mitad del

intervalo de luz y unadepresiónen mitad dei intervalo de oscuridad,y la diferencia

eraestadísticamentesignificativa.Los ratonesciegos,a suvez, teníandiferenciasque

cambiabansistemáticamentedesdeun pico en mitaddel intervalo de luz aun pico en

mitad del intervalo de oscuridad.Se decidió entoncesestudiaruna variable que

pudieseser medidavariasvecesal día,en los mismosanimalessin unacargaexcesiva

paraellos (Brusset aL, 1958; Halberg,1954).

En vez de emplearel muestreosanguíneo,el cual no podíaser llevado a cabo

fácilmentepuesconsistíaen tomarmuestras cada4 horasdurantevariosmeses,se

decidió estudiarel ritmo de la temperaturacorporal. Esteritmo, en animalescon

visión normalmantenidoscon luz desdelas 06:00 hastalas 18:00horas,muestraunos

picos constantesdurantelas horasde oscuridady depresionesdurantelashorasdeluz.

Lospicos ocurren, cadadía, aproximadamentehacia lasmismashoras,sobrelas 20:30

horas.En contraste,los animalesciegos muestranpicos que ocurren mástemprano,

cadadía, hasta queal final, trasvariassemanas,el pico se produce alas 08:30envez

de a las 20:30 horas. Entoncesun fenómeno no deseado,llamado “resultados

controversos”,fue resuelto rápidamente mediante laexpresiónde unapresumible

estructura temporalendógena.

Volviendo a los seres humanos, todolo aprendidode las otras formasdevida

sepuede extrapolar aestos.Personasvoluntarias,las cualesvivieron ensimas,aisladas

de los efectosambientalescíclicos de24 horas,lejos de la influenciade los ciclos de

la nochey el día, y de otras influenciaspsico-químicasy sociales,desarrollaronuna

rutina diaria cercana a24 horas,pero ligeramentemás larga; acostándosecada día

un poco más tarde, mostrandoen su temperaturacorporal y en otrasvariables,

periodosligeramentemás largos de 24 horas (Siffre et aL, 1966; Apfelbaumet al.,

1969).

En los seres humanos,unaevidenciacrítica encuantoa la elaboración interna

•l0

de los ritmos (endogenicidadde los ritmos) está ligadaa la, mal entendida, relación

entrela presiónsanguíneay los efectosde la actividadmotora,asícomolas respuestas

psicofisiológicas,no sólo para presión sanguíneasino tambiénpara la frecuencia

cardiaca.Estudios deestasdosvariables realizadosenpersonasgemelas,demuestran

rigurosamentela heredabilidadde la componente genéticade la amplitud circadiana

para la presión sanguíneay la frecuenciacardiaca al obtenerun coeficiente de

correlación,entre clases,altamentesignificativo (estadísticamente)(Halberg, 1983;

Hansonet al., 1984; Kumagaiet aL, 1992).

Un ciclo externo,como es el ciclo luz-oscuridad,alternandocada 12 horas,

únicamente puedesincronizarun ritmo circadiano,cuandoel periododel ciclo externo

es cercano al periodo endógenonatural. Los ratones puedentener un ritmo

sincronizadode 22 horassi estánsincronizadospor un régimende 11:11 horas (luz-

oscuridad,LO). La luz en este caso actúa comosincronizador,tambiénllamado

zeitbeger.El término alemánzeitbeger,significa “dador de tiempo”, no obstantesólo

puedeser interpretadocomoun donantedel tiempo de reloj o de calendario,no del

tiempo interno(Halberget aL, 1954; Nelsonet aL, 1975; Aschoff y Pohí, 1978).

Peroel tiempofisiológicocontinúasiendocíclico, enausencia deestosdadores

de tiempo,conunafrecuencialigeramente diferentea lade los ciclos ambientalesque

la puedensincronizar,como queda documentadoen el curso libre de los ratones.No

sólo los ritmos circadianos,de la temperatura corporal, los eosinófilos, la

corticosteronasérica, sino otros ritmos en la sangrey los órganos,y dentro de la

célula, estántodos sincronizadospor el ciclo de 24 horas de alternancia deluz y

oscuridad,como sincronizador.Pero si el régimen de luz utilizado consiste, por

ejemplo,en 6 horasde luz alternandocon 6 horasde oscuridad,esdecir, un ciclo de

12 horas luz-oscuridad, bastante diferente del ciclo interno fisiológico, de

aproximadamente23,5 horas en los ratonesinvestigados,el régimencíclico de luz-

oscuridadno sincronizaráestosritmos y los ratones estaránen curso libre, comolos

ratonesciegoscitadosanteriormente(Halberget aL, 1954; Halberg,1959). Estasson

otraslineasindirectasde evidenciaqueapoyanla endogenicidadde los ciclos.Incluso

bajo drásticascondicionesexiste un programainterno quepreparaa los mamíferos

11

.

para las actividades diarias(Halberg, 1953). Los ritmos hormonalesendógenos

muestranun aumento ensus concentraciones,antes incluso de despertase,y la

eosinopeniaendógenaocurreen preparación alas actividades diarias,por la mañana

antes de levantarseparalaspersonasy los perros (Halbergy Nabias, 1955; Kaine et

aL, 1955),y por latardeparalos deactividadnocturnacomoratones, ratasy hamsters

(Halberg, 1951; Halbergy Nabias, 1954; Halbergy Chaundry,1960>.Este aumento,

comoun aspecto deltiempo interno,persisteen ausenciade cualquierciclo ambiental

conocido.En otraspalabras,los ritmos circadianosestánsincronizadospor factores

externos (tiempo externo) como es la luz o la alarmade un reloj, pero no están

determinadoso producidos por los ciclos ambientales

Los experimentosen los ratonesciegos, citados con anterioridad, fueron

reproducidosvariasvecesobteniendoresultados similares(Halbergy Visscher,1972).

linade lasclavesfundamentalesdeunaexperimentaciónfiable,esla reproducibilidad

de los resultadosexperimentalesobtenidosbajo condicionesestándar. Estameta, de

cualquierforma, no se puede alcanzaraunquese asumaque todaslas variables,

exceptolas investigadas,sonlas mismasen cadamomentoconvenido,puesto queen

el caso de los ritmos con multifrecuencias(“arios componentes)cada variable

contribuirá en unamedicióndada,siendomuy improbablequeestosestados,de todos

los ritmos de multifrecuencia,se reproduzcancadavez quese repitaun estudiodado.

Por este motivo es por el que se determina mejor el cronoma (que no la

determinaciónde un sólo valor), o en caso de que no seaposible determinarlo,al

menosdeterminarel componentemásprominentedel cronoma,comoes el circadiano

quesemide comopartedeunacurvamuchomáscompleja.El principal puntoesque

unareplicación,de unestudiocircadiano,esmuchomásprobable queocurra,que una

replicaciónde un simple cronomaen un momentodado, sin especificarel tiempo,

inclusoaunquese especifiquenel momentodel día y la estación.

Algunos componentesdel cronomapuet~enser determinadosen su totalidad

mediantela ayudademonitoresautomáticos,disponiblesactualmentey cadavez más

usadosen fisiología y biología; por tanto, el tiempo biológico se convierteen una

dimensiónque puedey debeser medida.A diferenciadel sexo, laespecieo la edad,

12

aisladamente,variablesimportantespara determinadospropósitos,pero para otros

puedenser ignoradas; la informacióndel cronomaes indispensableen fisiología para

cualquier determinacióncompleta.En vez de fijar el tiempo del díapara eliminar

ritmos lo que es una tarea sisypheana (absurda), es mejor determinar

bioperiodicidades.No sólo debemosteneren mente queun ritmo es un fenómeno

formidable algorítmicamentey validable estadísticamente,que caracterizauna

variable,sinoqueesun fenómeno que puedeser determinado deforma efectivay sin

demasiadocoste(Cornélissenet aL, 1992).

La cronobiologia proveeconceptos aplicablesy técnicaspara resolverestos

cambiospredeciblesen los organismos,así comoparaaislar los efectosambientales

de losmecanismos endógenos.Las propiedadesbásicasde J05 ritmos son importantes

parala ecología,biologíay en particular parala medicinahumanay veterinaria.

Las manifestacionesrítmicas de la vida estánen desacuerdocon la práctica

actualde la medicina,y con el puntode vista, no común,de la homeostasis.Parano

desmerecer,la mayoríade lo quese conocey sepuedeevaluaren la actualidad,no

se debe alos métodoscronobiológicos,y además,las determinaciones experimentales,

no relacionadascon el tiempo tienen el principal crédito de que proporcionan

beneficiosobjetivos.La insulina para los diabéticos,así como la penicilina paralas

infeccionesfuerondescubiertassin la ayudade la cronobiología(en estoscasos,p.e.,

el tiempo de la insulina seríaunicamenteun refinamiento).Igual que la prácticade

la alquimiay la astrologíason menos complicadasque la químicao la astronomía,

respectivamente,la homeostasis también parece menos “complicada’t que la

cronobiología.Sin embargo,si la fisiología se debeestudiaren su propio margende

variaciones,la cronobiologíaes la única alternativa ala homeostasis;al principio la

cronobiologíanecesitadeterminacionesfrecuentesy densasdurantelargosperiodos

detiempo,parair conociendolas diferentesetapasde cada componentedel cronoma

y creandounosmapasguía; unavez que disponemosde estosmapas,unaspocaso

bien muestrasaisladas,puedenserlocalizadasen el tiempo einterpretadasa la luz de

los cronodesinoso intervalosde referenciaespecíficosenel tiempo (figura1).

13

.

Figura 1 CRONODESMO

LímiteSuperior

¡.~-anJ Datos

Déficit—

4 —w

rr

Tiempo

Figura 1

4.’

LímiteVNinterior

14

La terminologíacronobioló2icapuedeinclusoparecerextrañay complicadaal

principio, pero cadanueva cienciadebe desarrollarsuspropiosconceptosy métodos.

Con el tiempo, el contactocon los métodosanalíticos cronobiológicosy su uso, estos

términossevuelvenfamiliares.Originalmente,los métodosde determinación parael

estudiode unperiodocircadianose realizabana manoy setardabameseso años.En

la actualidadlos mismos análisisse realizanen segundoso comomucho enminutos,

graciasal uso de los ordenadores.

Los métodoscronobiológicosnos permitenevitar o reducirel riesgode error,

o de falsa información,que los métodosempleadoshastaahora no puedenevitar,

incluso fuera del margenfisiológico. Estosmétodosactuales,nos limitan a mediase

índices de dispersiónque no estánligados al tiempo, algunas veces hay errores

estándarmuy grandes y aún así se acepta un amplio margen normal. La

cronofisiologíaprimeramentereducela extensióndel intervaloquesecorrespondecon

el “margen normal”aceptable,y posteriormenteresuelve unos nuevosparámetros

dinámicosde las variacionesfisiológicas en el tiempo, es decir los ritmos (Halberg,

1979). De estemodo, no sólo predice cuándovan a ocurrir aproximadamentelos

valoresmásaltoso los másbajos, en un determinadodía, sino también,cuándovan

a ocurrir en una semanao año.

El riesgode elevaciónde unparámetropuedeser detectadopreviamentea la

apariciónde la enfermedad, controlandola alteraciónqueseproduceendeterminados

ritmos marcadores(Halberg, 1974). La cronofisiologíaofrece la oportunidad deun

tratamientopreventivoa tiempo (Halberg,1975>,a la edadadecuada,que puedeser

optimizadomediantemediciones adicionalescon nuevosdiseñosfarmacológicos,p.e.,

a lo largo de escalas circadianaso circaseptanas.La prevenciónde enfermedades

cardiológicas,endocrinasy oncológicas,hasta ahoraimposiblesde alcanzar,continúa

siendoun retoparala investigación,aunquealgunasde lasventajasde la cronoterapia

de cáncer hansido ya descritaspor Halbergy Cornélissen(1992).

15

VARIACIONES CIRCADIANASDEL CORTISOL

Pincuset aL(1948) describieroncambios de granmagnitud en la excreción

urinariadel 17-oxoesteroidey enel recuentode los linfocitos sanguíneos,como una

característicaexógena,esdecir, comorespuesta alos cambiosde la vida diaria. En

contraste, Halberg,basándose enestudios previos de muestreo serialmente

dependiente(Halberg y Visscher, 1950), así como en muestreo serialmente

independiente(Halbergy Visscher,1952; Halberget aL, 1951),presentóy documentó

el ciclo circadianoadrenocorticalcomo una entidad endógena,que presentacurso

libre, al producirunaenucleaciónbilateraldel nervio óptico en los ratones(Halberg,

1959, 1969;Halberget aL, 1954, 1959),pero sincronizadopor un cicloquealternala

luz con la oscuridad.

La ACTH es sintetizada deforma circadianaen la adenohipófisisa partir de

la proopiomelacortína,la síntesis de esta en las células cromafines de la

adenohipófisisestá bajoel control de el CRH hipotalámico,que essecretadotambién

con un ritmo circadiano.Esta secreción circadianano es debida al descensodel

cortisol plasmático,sino quees intrínsecaa] hipotálamo eindependientedel control

por funcionalidad negativa de los glucocorticoides (López-Calderón,1992). En

humanos se havistoqueel ritmo circadianodela ACTH persisteen situacionescomo

una estancia prolongada enla cama, ayunoy en la privación del sueñodurante2-3

días(Delgado,1992).

En los roedores la producción y/o liberación de los corticoides está

sincronizada porel ciclo de luz (L) y oscuridad(O), que alternan,por ejemplo, a

intervalos de 12 horas (LO 12:12), pero en las personasla rutina social es el

sincronizador,en el que estáincluido el encendidoy apagadode la luz, en funciónde

un despertador. Perola corteza suprarrenalsecretaglucocorticoidesen respuesta a

unagran variedad deestímulosestresantes; larespuestaal estrésse produce porla

activación de la secreciónhipotalámica de CRH, ADH y otras hormonas que

estimularánla secreciónhipofisariade ACTH.

16

¿Se puededemostrarel ritmo circadianodelcortisol plasmáticode los conejos,

en diferentes ciclos de 24 horas de luz y oscuridad?.Si la contestaciónfuese

afirmativa, mediante la estimaciónde sus característicasrítmicas, ¿seríaposible

explorar la influencia de la duraciónde la fotofracción(periodo de luz) diaria del

ciclo de24 horasde luz-oscuridad,enla variacióncircadianadelcortisol plasmático?.

Parapoderresolverestasdos preguntasseplanteóinvestigardosgruposdeconejos,

algunosde los cualessólo fueronmanejadosunavez parala extracciónde sangre,

mientras quelos otrosestabansujetosa cinco recogidasde sangre dela oreja,durante

24 horas. En relación al diseño experimentalde este estudio, fue interesante

determinar en qué medidael manejode los animales,durantela recogidade sangre

(sólo un pinchazo en la venade la oreja frente avarios pinchazos),influyó en las

característicascircadianasdelcortisol,y en relación a estacualificaciónmetodológica,

examinar el papel que juegala duración de la fotofracción respectoal ciclo

adrenocorticalbásico.

Selye, en 1936, observó que cualquier efecto estresante, (al referirnos a

estresanteno sólo nos referimos aefectos negativos,pues incluso una emoción,

aunque seapositiva puedetenerel mismo efecto) estimulael eje hipófisis-glándula

adrenal, produciéndose ACTHy el consecuenteaumentode cortisol; al conjunto de

cambios orgánicosque entran en juegocomo respuestadel organismoante estos

estímulos,Selyelo denominócomosíndromegeneralde adaptación.El cortisol actúa

a distintos nivelespuesto quecasitodaslas célulasorgánicasposeen receptorespara

glucocorticoides,por lo que éstos tienen acción en la mayoría de los tejidos del

organismo.Los glucocorticoidespresentanaccionesmetabólicas,actúan también a

nivel del sistemainmunitario,frenándolo:inhibe la liberaciónde histaminaspor las

células cebadasy los basófilos, impide la liberación de enzimas proteoliticasy

disminuye la formaciónde fibrina alrededor deláreainflamada.Se viO también que

existe sincronizaciónentre la eosinopeniacíclica, que ocurre en preparación ala

actividaddiaria, conel incrementodiario de los nivelesde hormonassuprarrenales.

(Halbergy Chaudhry,1960).

‘.7

MARCADORESDE CRECIMIENTO,CAJ3Oy C4125

Una forma de identificar el crecimiento de un tumor esmediante la

monitorización de un ritmo marcador como puedenser la a-fetoproteínao la

temperaturadel tumor. Los valoresmásaltosse corresponderán conel momentode

crecimientodel tumor y, por tanto,conel momentoen queel tumor es mássensible

a la radioterapia.Mediante la utilizaciónde estatécnicase ha conseguidodoblar el

porcentajede supervivenciaenpersonascon tumores periorales (Halberget al, 1974,

1975). Les ritmos marcadores terapéuticos puedenindicarnos,no sólo el momento

correcto dela terapia,sino tambiénnos puedendar la respuestaal tratamiento.

Sepuedenemplear,comoritmos marcadores delcrecimientode untumor, los

marcadorestumorales,queson sustanciasproducidaspor el propio tumory quenos

dan una ideasobre la actividad de ese tumor. Uno de estos incorrectamente

llamados”marcadorestumorales,el CA125, fue descritopor Basteta!, en 1981. Estos

autoresproducíanun anticuerpomonoclonal,llamado0C125,el cual reconocíaal

determinanteantigénicoCA125 de algunostumoresováricos,no mucosos.El análisis

del CA125 circulante se usa enel diagnósticoy monitorización,así como en el

pronóstico,de pacientesconenfermedadesginecológicas.

Como hemosdicho anteriormente: aesos factores se les ha llamado

“incorrectamente”marcadorestumorales,porque ensu comienzose determinaron

únicamenteen pacientes contumores, pensandoque eraexclusivode ellos. Estos

factores,CAI2S y CAI3O,no soninherentesaenfermos,sino quesepuedenencontrar

enpersonassanasasícomoen distintosanimales(vacas,conejos,ratas).Y no sóloes

propio del género femeninosino que se han localizado también en hombres.Por

tanto,estos“marcadorestumorales”deberíanserllamadosmarcadoresdecrecimiento

o de proliferación.

El CA125 presentaunos niveles elevadostambiénen condicionesbenignas

comoson en endometriosisy en inflamacionespélvicas(Eisermanny Collins, 1989;

18

Inabaet aL, 1989). En condicionesde saludtambiénsehandetectadocambiosen el

CA125 sanguíneo,como es en lagestación,durantela cual la concentración del

CA125 circulanteestá elevada (Hagaet a!, 1986; Itahashiet aL, 1988; Jacobset aL,

1988; Quirk et aL, 1988;Kobayashiet al., 1989;Jágereta!, 1990a),sobre tododurante

el parto(Touitou et aL, 1989) y tambiénen función de la menstruación(Jágeret aL,

1988). Un descensoen las concentracionesséricas del CA125 se asoció con una

amenorreainducida mediantefármacos,presumiblementeasociadacon la pérdidade

actividadhormonal porpartedel ovario (Nonogakieta!, 1991).Estosautores relatan

el hechode queexistencambios,de aproximadamente30 días(circatrigintanos),en

lasseriesdetiempodelCA 125 circulantedeunamujer, conunacurvade temperatura

quesugiereun ciclo ovulatorio.Tambiénseha detectadoCA12Sen pleura, pericardio,

peritoneoy epitelio derivadodel conducto mdlleriano(endocervical,endometrialy

tubal).

Se encontrarongrandesvariacionesdelCA12S séricoa lo largo deldía,sinque

éstosse pudiesen relacionar conun cambioen el estadodel paciente, perodebidoa

la inconsistenciay/o a los grandesniveles de error de la variación espontáneade

CA12S sérico,en pacientes con cáncer deovario, la búsquedade otro marcadorcon

un ritmo másprominenteparecióinteresante,un marcadorposiblemente relacionado

con el mecanismode coordinaciónde la producciónde CA 125 por el cuerpo, al

menosensitios diferentesdel tumor, sobre todoen organismossanos.La salivay la

orina eran unos candidatosobvios; se examinó la saliva puesto que se había

encontradoun ritmo circadianode gran amplituden el CAI2S salivarde unamujer

conun cáncerde ovario (Halberget aL, 1992; Cornélissenet al., 1992). Si el CA125

salivardeunapersonasanaexhibiesetambiénun ritmo circadiano,las características

de esteritmo en ausenciade un cáncermanifiestopodrían servir paracontrolarsu

alteración,en casode un posible riesgo, por ejemplo una elevacióndel CA125 ó

CAI3O circulante, previa al desarrollo de un cáncer. Einhorm et a! (1990),

describieronun casoen el queel CA125 séricosufrió un aumentovarios mesesantes

de la apariciónde la enfermedad.

La posibilidad de determinarel CA125 en saliva, tanto comoen suero,fue

19

demostradapor Chenet a! (1990), los cuales,además,trataronde separarpacientes

con cáncer deovario de los controles,en basea un nivel máximo de 3000U/ml en

la saliva recogidapor la mañanadespuésdel enjuaguede la boca.

Si comparamosla saliva conla sangre(plasmao suero),la primera representa

un líquido corporal accesible,que además puedeconservarsecon facilidad, que

podemos recogernosotros mismossin necesidadde ir al médicoy sin necesidadde

aparatosespeciales. Además,la saliva esun fluido a teneren cuenta,sobre todo,en

aquellospacientescon tumores que presentandisminuidassusdefensastras varias

sesionesde quimioterapia,de forma que, si se deben realizarvarias extracciones

sanguíneaspara controlarla evolución del tumor, se verían privados de las pocas

defensasque tienen. Si lo comparamoscon la orina, la saliva se almacena más

facilmente enel congeladordoméstico,por ejemplo. Por tanto, se deberíateneren

cuenta la utilización de la saliva como posibJe fluido para la determinaciónde

distintasvariables(Dawes,1974, 1974b).Katzy Shannon,(1964;1969ay b), sugirieron

el uso de la saliva en el estudiode Jashormonas,encontraronque la cantidadde

cortisol más corticosterona encontradaen la saliva era igual a la de cortisol más

corticosterona en plasma humanoy McVie et aL (1979), comprobaronque la

aldosteronaplasmática y salivar estabantotalmente correlacionados. Podemos

disponerde la metodología necesariaparaestepropósito(Walkeret aL, 1990; Wilson

et aL, 1990), y paradeterminarcronobiológicamentelos estrógenosy progesteronade

la saliva,asícomo otrosconstituyentessalivaresen el cursode los ciclos circaseptanos

y/o circatrigintanos.

El CA13Ocomoel ~Al25, normalmentedeterminadosensuero,presentanuna

mayor concentraciónen la saliva,caracterizándosepor un ritmo circadianode gran

amplitud, pero el CA13O tiene la ventaja de estar, en unos pocos casos,más

correlacionadocon el cursoclínico del cáncer.

20

PRESIONSANGUINEA YFRECUENCIA CARDIACA

William Harveydemostróla circulaciónde la sangre en1628,perono describió

la fuerza que lanzabala sangrealrededor delcuerpo. Stephen Hales(1677-1761)

midió la diferenciaentrela presión cuandoel corazónseexpande(diástole)y cuando

se contrae(sístole),él mismo relató las medicionesdirectasde la presiónsanguínea

que realizó endistintos animales, incluidos los caballos (Hales, 1733) cuando

exploraba,no la presiónsanguíneay la frecuenciacardiaca,sino susvariacionesa lo

largode la escalademinutosy segundos.Halesmidió claramentela presión sanguínea

mediay describiópequeñasoscilacionessincronizadasconlos latidosdelcorazón,las

cuales estabansuperpuestasa unas oscilacionesmenores, relacionadas con la

respiración.

La variabilidad de la presiónsanguínea humana,a lo largo de una escalade

24 horas,fue descrita porZadeken 1881, y posteriormente,distintos autorescitaron

estavariabilidad (Howell, 1897; Hill, 1898; Colombo, 1899; Brush y Fayerweather,

1901 y Janeway,1904, por citar algunospioneros). Janeway considerólos efectosde

algunos factorescomolasemociones,el ejercicio,la dieta, las horasdesueñoe incluso

los efectosde la presiónatmosférica.De acuerdocon éstosescribió: “En los casos

diariosy haciendo referenciaespecialmentea los efectosdel tratamientoen la presión

sanguínea,las determinacionesse debenhacer todasa las mismashoras’. En 1904

escribió:“Todo el mundo admitela importanciadeesto(variabilidada lo largo de las

24 horas)al estudiarel cursode la temperaturadurantelasenfermedades”.La presión

arterialno esmenosimportante. Corroboradoposteriormente,medianteel empleodel

método cosenor porHalberg, en 1970, y más tarde estudiado en profundidad por

Halberg(1991)y por Cornélissen(1992).

Tambiénexistedocumentaciónacercade las variaciones,deaproximadamente

un añoo circanuales,de la presiónsanguíneahumana(Schneidery Costiloe,1972) y

suvariaciónconla edad(Halberg,1970; Halberget aL, 1972; Levine y Halberg.,1972;

Bartter et aL, 1976; Sotherny Halberg, 1986), documentadasen partemedianteun

21

muestreolongitudinal en la mismapersona.

Con la disponibilidad actualde nuevos instrumentospararegistrarla presión

sanguíneay la frecuenciacardiaca,tanto en medicinahumanacomoveterinaria,así

como por los análisis cronobiológicos,se deben aplicarlos conceptosde la

cronobiología;enfocadosno sólamente aíndicesestadísticos, sinoa los dinámicosde

la presiónsanguíneaen la prácticadiaria.Por ejemplo,podemoscitar que en unperfil

cardiovascularde 24 horas,bajo unascondicionesdecontrolclínico totales,la presión

diastólicamayor, normalmenteexcedea la presiónsistólicamenor, incluso después

de eliminar algunosvaloresque podíanparecererrores instrumentales.

Actualmente,disponemosdel materialnecesarioparadeterminar lavariación

circadianaasí como otroscomponentes,por tanto mediante lacombinaciónde un

moderno“software” y “hardware”,los parámetrosde las variaciones circadianaspueden

ser determinadosy aprovechados.

22

DISEÑO EXPERIMENTAL

La mayoría de los clínicos y de los investigadores involucradosen

investigacionesbiológicas estándándosecuenta, ahora,quelos sistemasbiológicos

tienen una estructuratemporal,en la cualbastantes,si no todas,lasvariablesexhiben

fenómenososcilatorios;estos cambios son los ritmos biológicos. Dentro deestos

ritmos, el quemayor atenciónha suscitadoes el ritmo circadiano(Halberg,1959>, y

para determinarestasbioperiodicidadescircadianasy otras, comolas circaseptanas,

circatrigintanaso circanualesdebemostenerun diseñoexperimentalespecífico.

El diseño experimentalde la investigación va a determinarque los datos

recogidostengano no utilidad, únicamentela tendránsi se recogen enfunción del

tiempo. Debe estarbasadoen algún conocimientode la estructuratemporaldel

animal en general,y en la bioperiodicidadqueva a ser estudiadaenparticular. Un

diseñoexperimental,queenvuelvefuncionesquecambiancon el tiempo,debe estar

basadoen unos sólidos conocimientoscronobiológicos.La información estadística

obtenidade los diseñosexperimentales,puedeser evaluaday cuantificadamediante

ritmometriaestadística;ésta debecompensaral menos paraalgún tipo de valores

inusuales,separandola informacióndel ruido. Perola ritmometriano esun sustituto,

comotal, de datos recogidosde forma inadecuada.

En los estudioscon un sólo animal o bien en el de poblaciones,el muestreo

cronobiológicose debellevar a cabobajo condicionesestandarizadas,como son los

ciclos de luz-oscuridad,la horade las comidas,la temperaturay la humedad relativa

del aire, de la habitacióny el manejodel animal,el cual es una variable importante

a teneren cuentacuandoseestudianalgunasvariablesrelacionadascon el estrés(p.e.,

cortisol).

Cuandose trabajaen investigacionesexperimentales,los animalesdeben estar

estandarizadosal menosdurantelasdos semanaspreviasal estudio,en unciclo deluz

artificial, en el que sealternenlas horasde luz y las de oscuridad,con un horario

23

“aceptable” para el organismoen estudio y que se encuentre reconocidocomo

sincronizadorparadeterminadasespeciesy condiciones.El ciclo puedeconsistiren 12

horas de luz alternandocon 12 horas de oscuridad(LO 12:12), o un ciclo de luz

diferente de acuerdo conel propósito deseado;por ejemplo, en experimentaciones

sobrereproducción emplearíamosel ciclo 14:10,Silvánet aL (1990),puesesconel que

se obtienen mejores resultados.Se sabe que, bajo determinadosciclos de luz-

oscuridad,el ciclo circadianode algunashormonas cambia.

El ciclo de luzelegidodebe estarclaramente indicadoencualquier estudio,así

comoel momentoen que se enciendey seapagala luz, y tambiénel momentoexacto

en quese recogenlas muestraso se administranlos fármacos.

Unaexperimentaciónllevadaa caboa una determinadahora,puededefinirse

por su relación con el ciclo de luz-oscuridad(LO). Las cuatro referenciasde luz-

oscuridadson: HALO que significa horasdespuésde encenderla luz (Hours After

Light Onset),HAML: horas despuésde la mitad del intervalo de luz (Hours ASter

Mid Light), HADO: horasdespuésdel comienzode la oscuridad(Hours ASterDark

Onset)y HAMD: horasdespuésde la mitad del intervalo de oscuridad (Hours After

Mid Dark). Porejemplo:bajo un régimende LO 14:10 con luz desdelas 08:00hasta

las 20:00horas,se recogieron muestrasa las 2, 6, 10, 14, 18 y 22 HAMD.

Si realizamosla experimentación tomandoel ciclo luz-oscuridadcomotiempo

dereferencia,en lugar de tomarla medianoche,podremosahorrartiempo y espacio;

por ejemplo,tenemos6 lotesde animalesen los cualesqueremos determinar,cuál es

el momentoóptimo de utilización de un fármaco. Medianteel empleode un diseño

experimentalcronobiológico(Halbergy Halberg, 1980), en el cual hemos tomado

como tiempo de referencia HALO (horas después de encender la luz),

administraremosel fármaco alo largo de las 24 horas del díay a intervalosiguales

(p.e.,cada4 horas),el primerlote lo recibiría, 2 horasdespuésde encenderla luz, es

decir 2 HALO, el lote 2: 6 HALO, el lote 3: 10 HALO, el lote 4:14 HALO, el lote

5:18 HALO y el último lote (6): 22 HALO, esdecir 22 horasdespuésde encender

la luz.

24

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25

En lugarde tenerque establecerturnos parala administracióndel fármaco

a lo largo de todo el día, los lotes deanimalessepodríandistribuir en 2 habitaciones,

1 y II, conel mismo ciclo de luz-oscuridadpor ejemploLO 08:16; la diferencia estaría

en que enla habitación1, la luz se encendería alas 07:00y seapagaríaa las 15:00y

en la habitaciónII, la luz seencendería alas 20:00y se apagaría alas 4:00. Los lotes

1, 2 y 3 sealojarían en lahabitación1 y los lotes4, 5 y 6 en la habitación II.Mediante

estediseñoel trabajo (recogidade muestraso administraciónde fármacos)quedará

reducido (condensado)a 3 momentosescasosdel día. El lote 1 y el lote 4 se

sangrarán a las09:00y a las 10:00 horas,los lotes2 y 5 a las 13:00y 14:00horas,y los

lotes3 y 6 a las 17:00y 19:00 horas (figura 2).

Los resultados anteriores podríanreferirse también,a HAML, HADO 6

HAMD.

El modelose podríacomplicarcon máshabitaciones einclusocon diferentes

ciclos de luz-oscuridad, emplearíamos mayor número de animales pero

minimizaríamosel trabajo.

El mesy el año delestudiodeben estarindicados,puesto quelasvariaciones

circatrigintanasy circanualespueden caracterizarel MESORy la acrofasede una

función circadiana (Haus y Halberg, 1970), también sedeberíanespecificar la

localizacióndonde se ha realizadoel estudio.Se deben evitarlas interrupcionese

interferencias conlosanimalesantesy duranteel estudioexperimentalcronobiológico,

comopuedenser lastemperaturasextremas;asícomocualquier variacióno disturbio

en la habitaciónde experimentación.

El horariode alimentaciónde los animalesdebede detallarseen cadaestudio

(art libitum, sin comida, sin aguao con restricciónde comida); sobre todocuandose

estánllevandoa caboestudiossobrelos efectosde algún fármacopuestoque, como

essabido, algunosfenómenosbioperiódicos, comolosciclos desensibilidad-resistencia,

puedenpresentarunaacrofaseen movimiento debidoal momentode la ingestiónde

la comida.

26

Estas referenciasbiológicas indican algunos aspectosde la sincronización

animal y puedenser críticas,sobre todosi se limita el muestreo a una sólatoma o a

únicamente unascuantas.Otras funcionesde referenciaposibles,que debenser

consideradascomoritmos marcadores en eldominio circadiano,son: la temperatura

corporal, los electrolitossalivares(sobretodo sodioy potasio),el volumenurinarioy

los corticosteroides,aunquecualquierotra variable puedeservir como una posible

funciónde referencia.Preferentemente, se debe medir longitudinalmente aintervalos

frecuentesy ser determinadamediantemétodosno invasivos,si bien las variables que

se puedan determinarautomáticamentey detectar de forma fácil son las más

atractivas, comola telemetríade la temperaturacorporal,de la frecuencia cardiaca

o de la presiónsanguínea.

Cada díase está mejorandola tecnologíapara la recogida automática de

muestras y su transferencia directa al ordenador para analizarías mediante

ritmometría. El uso de este muestreo automático se hacenecesariopara evitar

interferenciascon los animalesque esténenvueltosen Ja experimentación(Halberg

et aL, 1971; Rungeet a!, 1974; Smith et a!, 1978). Cuandono se disponede esta

instrumentaciónpara realizar unarecogidade datosautomática,se puede utilizar

como ritmos marcadoreslas medicionesmanualesde algunas de las funciones

corporales de los animales en estudio y posteriormenteaplicar los métodos

cronobiológicos.

Las necesidadesde un muestreocorrectoson considerablemente importantes

parademostrarun ritmo de periododesconocido,especialmentesi no se cuentacon

él. La búsquedade bioperiodicidadesdesconocidaspuede estarapoyadapor el

conocimientode ritmosambientales(comoel ciclo de luz-oscuridad)que rodeanesas

bioperiodicidadesy quesirve desincronizadorde los ritmosbiológicos;perotambién

debemosteneren cuenta en quémedidala interferencia queejerceel investigador,

o el diseño delestudio,o sunaturaleza,nos conducena unabioperiodicidadde curso

libre, de esesupuestosincronizador.

La longituddel periodode observaciónquese necesita,dependede la región

27

espectral (circadiano,circaseptano,etc.) y de las característicasdel ritmo queseva a

estudiar.Unade laseleccionespuedeserel seguimientode un sóloanimal alo largo

deun espaciode tiempo (a lo largo de variosperiodosdel ritmo, p. e., el efectode

los fármacosen el tiempo) o también llamadosestudios longitudinales. Varios

animalesque exhibenel mismo ritmo puedenser estudiadosa través de un sólo

periodo ode variosperiodos en undiseñotransverso,o bienun númerodefinido de

animalespuedenser seguidos a travesde varios periodos enun diseñohíbrido o

mixto (Halberg, 1964).

El intervaloentreobservacionesconsecutivasdebeser lo suficientementecorto

para obtenerun resultadosegurodel ritmo queva a ser estudiado,y paraevitar el

bioaliasing(Engeli y Halberg, 1964; Bunning, 1973; I-lalberget aL, 1977) por alguna

componente de altafrecuencia,figura 3. Para evitarestebioaliasingel muestreo debe

de hacerse aintervalos lo suficientementecortospara resolver algunosritmos con

relativasaltasfrecuencias,y duranteun periodode tiempo lo suficientementelargo,

paraobteneralgunosde los componentesdealtafrecuencia.La obtencióndemuestras

durante largos periodos detiempo son de crucial importancia, con el uso del

registrador automáticoseevitan las limitacionesqueexistíanen la recogidade datos

y posteriormentese reduciráel costede los estudioscronobiológicos.En algunos

análisis (p.e., químicos) las muestrashan de elegirseoportunamente, más que por

conveniencia.

En Españasabemosque unainvestigacióncronobiológicaa nivel de campo,

hoyen día esmuy complicada,puesto quenó le podemos deciral ganadero que recoja

sangrede susanimalescada4 horaso quese levantea las 3 de la mañanaa recoger

una muestrao bien quele administrela comidaadeterminadahora,aunque conesto,

el animal aumenteel índice de transformación(Sundarajy Halberg, 1982). Los

diseños cronobiológicospueden mejorarla interpretación delos resultados,por

ejemplocuandomedimosuna variablefisiológica, como la presiónsanguíneao el

cortisol, amboscaracterizadospor unagran amplitud circadiana,si ignoramosesta

estructuratemporal, tomandolas muestrassin especificacióndel tiempo,p. e., desde

las 09:00hastalas 17:00 horas (suelenser lashorasde consulta,sin detallarla hora

28

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exacta),ésto nos conduciráa unos valores mediosque estánasociadosa un gran

indice de dispersión,ya que la mayor parte del margende variación predecible

asumido por la variable fisiológica está cubierto por elintervalo de observación

(figura 4). Si se tomanmuestrasaisladasde la mismavariable eignoramoslos tiempos

del muestreo,nuncanos daremoscuentade que, respectode la referenciaestándar

de un individuo, el mismo valor será unasvecesmuy alto, en unmomentodado,y

muy bajo, en otro, pero perfectamente aceptableen algunos momentos.

Es cierto que laelecciónde dos tiemposde recogidade muestras,justo antes

de que se produzcael máximo y el mínimo (figura 5, superior),asumidospor las

variables rítmicas, es óptimo únicamente enel caso de que conozcamos

aproximadamentecuandose van aproduciréstos.Perosi lasdosmuestras serecogen,

sin darnoscuenta,en los puntosde inflexión de lascurvas, noseencontraráninguna

diferenciay seobtendría unaconclusiónerrónea(figura 5, inferior). Perosi después

de un diseño inicialde 6 puntos,se eligendos momentosde obtenciónde muestras,

se obtendránresultadoscoincidentescon el empleo de seis puntos (Halbergy

Visscher, 1950; Cavallini et aL, 1987; Blank et aL, 1992), aunqueel uso de estosdos

momentosde muestreo a priori sedesaconsejantotalmente.

La consideración,en el diseño,de un tercermomentode recogidademuestras

nosdael puntode estimaciónde las característicasde los ritmos (figura6, superior).

Consólotresmomentosde recogidade muestras,podemosestimarlascaracterísticas

de un ritmo, pero no son suficientespara realizarpruebasde hipótesiso estimar

límitesdeconfianza.De cinco a ochomomentosderecogidademuestrasdistribuidos

de forma equidistante alo largode unciclo, constituyendetalladosy potentesdiseños

(Hilíman et aL, 1990; Binghamet aL, 1992) que permitenla realización,tanto de la

detecciónde un ritmo, comola estimaciónde parámetroscon una ciertamedidade

incertidumbre(figura 6, inferior).

Lo mencionadoanteriormente,en cuanto a la toma de muestraspara la

detección debioperiodicidades,puedeaplicarsetambién a la valoracióndel efectode

un fármaco,desdeel momentoen quepodemoshacercorresponderlos máximosy

30

ooo

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4-

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o02:00 10:00 18:00 02:00 10:00 18:00 02:00

06:00 14:00 22:00 06:00 14:00 22:00

Tiempo (horas de reloj)

Elgura 5

32

1~~ — 1 1 •~••~I ~ ••~1 1

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Tiempo (horas de reloj)

Figura 6

¡ 1

6J

5-

Variable

Q,nidades a%bitrariasl

4

3-

o

33

mínimoscon un efecto deseadoy un efectono deseadoen la acciónde esefármaco

y, asignandolos anteriores puntos derecogidademuestras,al control delmismo en

distintosmomentosdel díay a diferentesanimales,puesto que adosis igualesde un

fármaco, éste producirá efectos diferentes dependiendo del momento de

administración.Por ejemplo, en caso de querer conocercuál es la mejor hora de

administraciónde un fármacoquedisminuyela frecuencia cardiaca,inocularíamosa

cada animalla mismadosispero adistintashoras,obteniendo avecesunarespuesta

circadiana,correspondiéndoseel efectopositivo del fármacocon el mínimo de la

curva y el efecto negativocon el máximo de la misma, al no disminuir la presión

sanguíneasino aumentarla.

En cronobiologia,la elecciónde los procedimientosde recogida demuestras

constituye una importante consideraciónen el diseño experimental.Cualquier

interferencia conel animal, debido a las técnicasempleadaspara realizar las

medicionesde undeterminado parámetro,puedenconducirnosacambiospuramente

artificialesde la funciónestudiada,Un aspectomuy importantede las reaccionesque

se producen, debido alos transtornosdel sangrado,es la observaciónde los ciclos

circadianosde susceptibilidady resistencia,no sólo antenumerososagentesfísicosy

químicos, nocivos y tóxicos, sino a simples procedimientoscomo el manejo, las

medicionesde temperaturarectalo inoculacionesde sueros salinos(Smolenskyeta!,

1978). Este problemase vuelve incluso máscomplejo, si se deben hacer varias

determinaciones enel mismo animal (muestreo serialmentedependiente).Parece

deseable utilizar cadaanimal,sólo unavez en cadatomade muestra,si el procesode

obtenciónde muestrasproduceinterferenciascon el sujeto estudiado, (muestreo

serialmenteindependiente).Esto requierela disponibilidadde un adecuadonúmero

de animales comparablesensexo,edad, antecedentesgenéticosy pasadohistórico,lo

que es másfácil cada día endeterminadasespeciesanimales,debido ala mayor

disposicióndeestirpesconsanguíneas; pero,endeterminadosestudios,se puede evitar

al sustituirel estrésve produce larecogidade muestrassanguíneas,por el uso de

otros fluidos biológicos como son la saliva o la orina. Por todo lo citado

anteriormente,en la experienciaanimal el estudio del diseñocronobiológicoes

esencialparauna buena prácticade laboratorio.

34

Todaestainformacióncronobiológica,disponibleen la actualidad,indica que

los diseñoscronobiológicosse hanvuelto requisitospreviosesencialesen el estudio

de tejidoscelularesde sujetos,asícomoen los estudiosdepoblaciones.A la estructura

del organismo,en el espacio,hay que añadirleLa estructuraen el tiempo,a la cual

llevamoshaciendoreferenciadesdeel principiode estetrabajo; aunque tan importante

escuándoocurre unfenómenobiológico, comodónde,~rnq y por qué,puntos que

tendremos queteneren cuenta ala hora del diseñoe interpretaciónde los resultados

obtenidos.

Los cronodesmoso valoresde referenciaen el tiempo son muy útiles cuando

definimos la normalidady la salud, si medimosla presiónsanguíneaen unapersona

a las 08:00de la mañana, será másbaja que si la medimospor la tarde, estos dos

valores están dentro del margende la normalidad y están dentro delos límites

referidosen los cronodesmos,pero paraun investigadorqueno seacronobiólogo,el

valordeterminadoa las 20:00horasestarádentrodel margende la hipertensión.Las

alteracionesde la estructuratemporal de un organismopodrían ser una señal

tempranadealguna posibledisfunción,anterioral desarrollode unaenfermedad;p.e.

si registramos,mediante telemetría, la temperaturacorporal en una vaca, una

elevaciónde lamismapodríaserun signo tempranode infección-mastitis-,(Lefcourt,

1983, 1990).

De igual importanciapara laobtenciónde unosresultadoscon sentido,es el

poderfamiliarizarsecon la metodologíade las investigaciones cronobiológicasy con

las necesidadesde unmuestreo para cadamargende frecuenciasestudiadas (Halberg

y Panofsky, 1961; Panofskyy Halberg, 1961; Halberget aL, 1964).Finalmente,los

datos obtenidos debenser analizadospor métodos de deducción estadísticade

ritmometriacuantitativa;estonospermitiráresolverla complejay dinámicaestructura

temporal de los animalesy nos conduciráhacia unos resultadosfinales (puntose

intervalos)para quelos parámetrosde los ritmos puedanser estudiados.

Al hablar delcostede los diseñosexperimentalescronobiológicos,la mayoría

de las personas tiene unconceptoerróneode ellos. Actualmente,el coste de un

35

estudiocronobiológicoes decididamentemenorque el delos diseñostradicionales.

Son más baratos porqueson muchomásefectivos,proveenmuchamásinformación

y en el caso de control de fármacos,por ejemplo, nos permiten conocerel efecto

opuesto endiferentes tiemposo bien nos permitenconocerla forma de mejorarun

efectodeseado.Tambiénnospuedellevara reducir latoxicidad: los tratamientoscon

quimioterápicosno se emplearíanen determinadosmomentosparaevitar el efecto

tóxico. La quimioterapiaadministrada en pacientes con cáncer se realiza, enla

actualidad,continuamentedurante24 horas,duranteesteperiodola quimioterapia

actúa‘matando”célulastumorales,pero tambiéncélulas sanas,comosonlos linfocitos

o las células de la médula ósea, dejando al paciente,muchasveces, en peores

condiciones.Medianteel control de los momentosde crecimientodel tumor,y con e]

uso de ritmos marcadores(como la temperaturaen tumoresaccesibleso los

marcadores tumoralesen los no accesibles),se trataríacon quimioterapia únicamente

en los momentosde crecimiento del tumor. Por tanto, el elevado coste de los

experimentoscronobiológicosesunconceptoerróneo, puesto quetodo lo que se haga

sin especificaciónde tiempo,se deberepetira diferentes tiempos.

El poderdelos cálculosanalíticosusadosen el métodocosenorrevela quecon

tan sólo 8 sujetosestudiados,en 6 momentosequidistantes delritmo, son suficientes

paradeterminarlas característicasde eseritmo cuandoJa relación señal-midoes 2

ó mayor, con un80% de poder, aproximadamente(Cornélissenet a!, 1992). Para

traducirestosresultadosacoste,el métodocronobiológicopropone tomarel número

inicial del tamañode la muestra,perodistribuyendocadasujetoen diferentestiempos.

La experiencia de varios autores y la simulación de análisis, sugieren que

aproximadamente6 momentosde recogida de muestras,distribuidos de forma

equidistante alo largo de un ciclo del ritmo investigado, nos conducirán ala

obtenciónde buenosresultados.Por tanto,comohemosvisto, el métodocosenorde

losdiseñoscronobiológicospresentadiferentes ventajas,comoson la necesidadde un

menor número deanimales, y un mayor poder que los métodos estadísticos

convencionales(Binghamet a!, 1992), y a la largaun menorcoste,puesto queno se

necesitaran posteriores repeticiones adiferenteshorascuandose realicenpruebasde

control.

36

ANALISIS DE DATOS EN CRONORIOLOGLA

La aplicación de la cronobiología, dependeráfundamentalmentede la

evaluación cuantitativade los datosrecolectadosenfunción del tiempo,mediantelos

métodosritmométricosy el empleode unabuenabasede datos.

Pasamosadescribiracontinuaciónlos diferentes métodos analíticos empleados

en cronobiología,parapoderllevar a caboestudioscronobiológicoscorrectos.

La dificultadde interpretarlos datos,deunaformapuramenteglobal,sedebe

al hecho de que el clásico pensamiento dela homeostasiaestá enfocado

exclusivamente,en índicesmediosde localizacióno dispersiónde datos,sin ninguna

consideraciónexplícita,dealgunade lasdiferenciasque puedenexistiren ladinámica

de dos grupos,quepresentenmediasy desviacionesestándarsimilares, cuandono

idénticas(Halberget aL, 1990).

La cronobiologíano sólo añadeun enfoque a ladimensiónde la variabilidad,

sino que,en vez de dejar éstasin resolver, los investigadoresque se ocupan del

estudio de la cronobiometríadividen el margen normal, obteniendoasí nuevos

parámetrosque proporcionanun métodode reducciónde datos,obteniendo mucha

másinformación de la que seobtienecon el margennormal,al igual quelos físicos

dividieronel átomo,que unavez secreyóindivisible (comoestáimplícito enel origen

de su nombre).El análisis de los ritmos, podría ser equiparadoa la fisión por la

obtencióndegrandesbeneficios:uno porla producciónde estosnuevosparámetros

y el otro por la produciónde grandescantidadesde energía.

Volviendo a laanalogíaanterior, lafusióndepartículas produceinclusomucha

más energía quela fisión; igualmenteel estudio de las relacionesentre ritmos,

equivalente ala fusión, proveede unainformación adicionalen unaaproximación

integrativa,pararelacionarlas característicasentreunosritmos y otros,y con las de

otros resultadosclínicos.

37

La detección deun componentedado requiere,al menos, reunir los datosy

calcularla media; pudiéndose detectarentoncesel efecto deltiempo,pero aúnexiste

la necesidad adicionalde una reducción temporalde los datos,en parámetroscon

plenosignificado, ellorequiere herramientas’especiales,comoes unordenadorcon

el adecuado“software”, al igual quesenecesitaninstrumentosespecialespara‘ver’ las

frecuenciasde las ondaselectromagnéticasque estánfueradelmargenvisible, u otro

tipo de ondascomolas de radioo rayosX.

A simple vista se pueden observarmuchascosas,pero no todas.La vista no

puedereemplazaral microscopioparaobservarla célula, de la misma formaqueno

se puedenreemplazarlos ordenadores paracuantificarun ritmo.

La alternativacronobiológicaconsisteenobtenermedicionesen serie deforma

sistemática(antesde cualquierestudioo diagnosis)y analizarestasseriesde datos

para determinarlos parámetrospredeciblesde las variacionesde los mismos. Los

procedimientosy estudioscronobiológicosson necesariospara reducir a simples

términosla esenciade algunosdatoscomplejos.

Los datospueden parecerirregularesy, comodijimos al principio, puedenno

ser cuantificadosa simplevista, pero estose solucionafácilmente conel uso de los

ordenadores.Una primera aproximaciónes la resoluciónde un ritmo circadiano,

medianteel empleodel métodocosenor,lo queimplica ajustarunacurvacosenode

24 horas a los datos,a través del método de los mínimos cuadrados.Se obtienen

entoncesestimacionesdelMESOR,mediaajustadaal ritmo,de laamplitudy acrofase

circadianos,que son medidasde la duracióny momentodel cambioquese produce

enel díay que es predecible.Estascaracterísticasde los ritmosestánilustradas enla

figura 7, junto con el periodo,duración de un ciclo completo,obtenido mediante

métodosde cronobiometría(Halberg, 1980) con estimaciónde un error. El método

cosenor se explicará posteriormentecon mayor precisión, al igual que las

característicasde los ritmos quede él sededucen.

38

4

~ —

Tiempo dereferencia

mpo

MESOR/~

funcióny\/’ritmica

AMPLITUD R

DOBLE AMPLITUD

ACROFASEFunciónrítmica

Figura7

39

Siempreesdeseablecuantificarla dinámicade cualquiercambio,mediantela

estimación de la extensióny el momento de ese cambio, ambos determinados

medianteel métodocosenorcomoparámetrosde los ritmos. Halberg,en 1969, dijo

que la cronobiologíasirve para evitarerrores,cuantificarnuevosparámetrosy para

decidirlos momentos oportunosde los muestreos,bien mediante latomademuestras

aisladaso bien medianteseriesde datos(Halberg, 1969; Halberg, 1980).

La aplicación de la cronobiologíay sus conceptosa la medicina humanay

veterinaria, depende fundamentalmentede una evaluacióncuantitativa delos datos

recogidosen funcióndel tiempo.Sólo sepodráobteneruna información cuantitativa

de los ritmos si disponemosde unabasede datosadecuada,y si las seriesde datos

biológicas,normalmentecontaminadas,seanalizanmediantemétodosde ritmometría,

estadísticamentededucible,que también separanel ritmo del mido.Estos métodos

hansidodesarrolladosy mejorados comotécnicasrutinariasdeordenadordurantelas

pasadasdécadas(Panofskyy Halberg, 1961; l-lalbergy Panofsky,1961; Halberga a!,

1965; Bunning cf aL, 1973). Partede la metodologíaritmométricabásicaha sido

incluso adaptadapara su uso con ordenadores portátilesy pequeñascalculadoras

(Cornélissenet aL, 1980).

Para queuna función fisiológica se puedaconsiderar como rítmica, el

acontecimiento,el intervalo y las secuenciasno necesitanrepetirseexactamente,

aunque deben mostraralgunaregularidadde repetición.Paraser calificadas como

ritmos, estaregularidaddebetenerun patrónidentificable, y debe mostrar quesu

ocurrenciano se debeal simpleazar.

Paradetectarbioperiodicidadesenseriesdetiempo cortas,sin tenerencuenta

el problemade los datosno equidistantes(problemacomún en muchosanálisis) se

desarrollóel modelocosenor (Halberg,1969). Estees un métodobastanteatractivo

y que hasido usado ampliamentepor su simplicidad,versatilidady la sugestiva

presentaciónde los resultadosanalíticos. El método cosenorsimple consisteen

ajustar, mediantemínimoscuadrados, unafuncióncosenoa los datos,asumiendoque

se conoceel periodo,r. El modeloes el siguiente:

40

Y (t) = M + A cos (2rt +

El ajuste de un sólo componente,p.e., 24 horas(figura 7) se caracteriza por tres

parámetros:el MESOR (M), (medialíneadel ritmo estimada estadísticamente)o

media ajustadaal ritmo; la amplitud (A), medida de la extensióndel cambio

predecible, alrededor delMESOR,en unciclo;y la acrofase(a), medida delmomento

en el que se producencasi todos los valoresmásaltos recurrentesen cadaciclo.

Cuandolos datosno son equidistantesy/o cubrensólounapartedel ciclo, el

MESOR puedeserdiferentede la mediaaritmética,y normalmenteproporcionauna

estimaciónmásexacta (menosdesviada)del valor medio asumido por la variable

rítmica. Cuandolos datosson equidistantesy cubrenun númeroenterode ciclos, el

MESOR es idéntico ala mediaaritmética, pero estáasociadonormalmente aun

error estándarmenor. Por tanto, normalmenteel MESOR es más precisoque la

media aritmética(Halberg, 1989; Cornélissenet al., 1992) (figura 8).

Si comparamosla dobleamulitud de la funciónajustada,comouna medidade

la extensióndel cambio del ritmo, estapuedeser considerablemente diferentedel

margen generalde los datos(figura 8).

El momentode los valoresmáximosno se puedecompararcon laacrofase,al

ajustar la función a los datos, la acrofase del ritmo estimada puede diferir

considerablemente,en tiempo,de unvalor extremofortuito e inifluenciable(figura 8).

La acrofasetambién puedeser definidacomoel retraso queexistedesdeun

tiempo de referenciadado,hasta que se produceel pico en el tiempo de la función

coseno ajustada alos datos; los tiempos de referenciamás usadosincluyen: la

medianochelocalparalos ritmos circadianos,el domingoparalos ritmos circaseptanos

y el 22 de diciembreprecedente alos datos recogidos,para los ritmos circanuales

(figura 9). Si empleamoslos tiemposde referenciaanteriormentecitados,la acrofase

41

VENTAJAS DE LA RITMOMETRIA

MESORvs MEDIA

AMPLITUD VS MARGEN

dobleampihud

ACROFASE (~> VS TIEMPO MAXJMO (tm)

tiempo

Figura 8

dato

e

Igualdadde áreas

MESaR

margen

(tJ

función

etiem~odetare rancia

42

Tiempo (Fechas del calendario)00:00D¡cn

1•00:00

Domingo240

160

80

a

00:00

Erie Feb Mar Abr Mayiunjul AgoSep CtA f4ov Dic Dic 22U U U U ¡¡ ¡ U U U ¡

Dom Lun Mar tAle Jue Vie SÉ 00:00Dom¡ngo

Tiempo <Horas de reloj>

Figura 9

00:00 06:00 12:00 18:00 00:00 06:00 12:00

43

recibeel nombre deacrofasecomputativa.Otro tiempodereferenciapuedeseralgún

puntoenel ciclo ambientalsincronizante(ciclo LO), por ejemplo,el punto mediodel

intervalo de luz (HAML) en el casode los ritmos circadianos(Halberga al., 1958;

Halbergcf aL, t959). Cuandoesésta lareferenciaseleccionada,la acrofaserecibeel

nombre deacrofase externa.Otra fasede referencia,usada frecuentemente, puedeser

un punto de otro ritmo con la mismafrecuenciadel ritmo que estamosinvestigando

y en el mismo sistemabiológico,por ejemplo,la acrofasedel ritmo circadianode los

linfocitos circulantespuedeser elegidacomofase dereferenciay conésta,la acrofase

seráacrofaseinterna(figura 10).

La acrofasese puede expresar en grados negativos, igualando 3600 a la

extensióndel periodo,o en unidades detiempo(minutos,horas,días,meses,etc.),por

ello, cuanto mástardeocurra laacrofaseenun ciclo, más negativaserá. Laacrofase

varia en el sentidode las agujasdel reloj desde~0O a ~360o.Debemos remarcar,que

la acrofasees el pico de la curvacosenoque másseaproximaa los datosy no tiene

que correspondersecon el valor más altode la serie temporal.

El MESOR y la amplitud se expresanen las unidadesen las que se está

trabajando. Comolos valoresde la amplitud representan, porconvenio,sólo la mitad

de la medidatotal de la curvacoseno,y comoésteno alcanza necesariamenteel pico

de los valores medidos, la amplitud no siempre representaun gran cambio.

Frecuentementees de gran utilidad expresarel cambio relativo predecibleen los

datos,como porcentajede cambio (A/M).

Junto conlos parámetrosestimadosdel M, A y q, el método cosenor

proporciona también intervalos estimadospara los parámetrosde los ritmos.

Asumiendovarias hipótesis y tras deducciones estadísticas,la F estadísticaque se

obtiene puedeser usadaparadeducir unaregión de confianzaelípticaparala A y la

‘p, en el caso de que los datos se representende forma polar (figura 11). Esta F

estadísticatambiénpuede usarsepara comprobarla hipótesis nula,H0: A = 0. Si se

rechaza estahipótesis,en un determinadonivel de probabilidada (p.e., 0,05), se

puedeasumirquelas fluctuacionesde los datosno son debidasal azar,sino cíclicas

44

oo

oQ

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45

a,

REPRESENTACION POLAR DE LOS PARAMETROSDE LOS RITMOS ESTIMADOS (A,*>

JUNTO CON LA REGION DE CONFIANZA

Figura 11

46

C 4 8 oS

con un periodo i, proporcionando entonces una validez estadística a las

bioperiodicidades.Otra medida de la dominancia de una bioperiodicidad es el

porcentaje delritmo, estoes la proporciónde la variabilidad total de los datosen las

seriesde losmismos,quesonatribuiblesa la curvacosenousadaparadescribirritmos.

Despuésde recogerlos datos en función del tiempo, el método cosenor

(Halberg, 1969) se puede usarajustandomedianteel método de los mínimos

cuadradosunafunción periódica alos datos,de forma queunao varias funciones

coseno tenganperiodosanticipadosa los datosrecogidos.En la mayoríade los casos,

los periodosse conocendebido a unainformación biológicaanterior, comoson los

componentesdel cronoma, este asumenormalmenteuna periodicidadparejaen

frecuencia a la delmedioambiente.

Unavez determinadoslos componentesperiódicosse puedenrepresentar,el

modelo ajustadosedibuja junto a los datos originales,en función del tiempo,en la

figura de los mínimoscuadrados(figura 12).

Los componentesdel ritmo tambiénse puedenresumir en unafigura polar

(figura 13), dondeel par,amplitudy acrofase,estárepresentadocomoun vectorjunto

a una escalacircularde tiempo, la longitud de estalíneaindica laamplituddel ritmo

y la orientaciónde la línea,esdecir, su direccióncon respectoa la escala circular es

indicativa de la acrofasedel ritmo. Los 3600 de la circunferenciarepresentanla

extensióndelperiodoy 00 el tiempodereferencia.Al hacerla analogíaentre laesfera

del reloj y los ritmos, el 00 está en la partesuperiorde Ja figura y la acrofasese

expresará engradosnegativos,de forma que la acrofasevaría enel sentidode las

agujasdel reloj. El momentode referenciade la fase, alternanciade luz y oscuridad,

estacionesdel año, acontecimientosespeciales,etc.,puedenreflejarseen la porción

externade ¡a circunferencia.

En dicha figura también aparece unaregión de confianzadel 95% para la

combinaciónde amplitud y de la acrofase, comounaelipse de error alrededordel

extremodelvector.Cuandola elipseno incluyeel centrode la circunferencia, indica

47

Grados (36O0E24h)

¡300

Tiempo (Horas de íe¡oj)

Figura 12

.1 Región

deconfianza

[0

[05

[00

95

0.occ

Limites de Confianza

1~~

0600 0000

48

Cne P N pm B0118 AmpUte AaV(ff

Chscn 0,00? 00 21 104 11

U 100 7

si gis o»47<24 rip

~ ~-“ •1I1>sr¿w •iig>

—. .rn do lat~Us: M~Uk¿d’ONaUúuwo U. ebi.nrtcnflP**crestq. da rna.• LI.tn de cwCc~n d.f 15% @attk> dalvudcs de b eSpie w.u~o

Figura 13

49

Horario

Para 0 en Grados3Wu 24 horas0~ medianoche local

que elritmo es estadísticamentesignificativo, o lo que eslo mismo, la amplitud es

diferentede cero.Inherente acualquierfunción biológica existe un cierto grado de

variabilidady estedebeser aceptadoennuestrasdeterminaciones,con talde quesus

limites puedanser estimados.Por tanto, de acuerdo con estas estimaciones,la

amplitud y acrofaseno son valores aislados,sino que cadaparámetrodebe estar

acompañadode unamedidadedispersión,llamada intervalo estimado.Las ventajas

de la representacióndel cosenose fundamentan enel hechode queproporcionan,

además deuna estimaciónde un punto para la amplitud y la acrofase, intervalos

estimadospara estosdos parámetros, enforma de región de confianza (Hausce

aL,1979).

En el casode estudioslongitudinales, desdeel momentoqueseespera quelas

característicasde los ritmos sufran cambios espontáneamente, será importante

detectary determinarestoscambios-en función del tiempo-y con estepropósito,se

desarrollaronlas seccionesen serie cronobiológicas(figura 14) (Halbergcf aL, 1977).

Este método estanto analíticocomo gráfico, la parteanalíticaes básicamenteigual

a ladel cosenosimple; primerodebemos considerarunasecciónde los datoscon una

extensión fija (llamada intervalo),posteriormenteeste intervalo es desplazado

progresivamente,a través de las seriesde tiempo con un incrementodado. Se va

ajustando a cadaintervalo de datos un coseno simple con un periodo fijo,

obteniéndoselos parámetrosdel ritmo, que aparecenrepresentadosen paralelo con

los datosoriginales.Esteprocedimientoesparticularmenteútil para mostrarcuando

ocurre unadesincronización,comoen el caso de los ratonesciegos,en los cualesla

luz no puede actuarcomosincronizador(Brusscf aL, 1958);o los estudiosen simas

o bunkers especialmentepreparados, donde algunas personas pasanmeses,

voluntariamente,sin ningún tiempo de referencia(Aschoff cf aL, 1971). Si no

dispusiésemosde estas seccionesen serie, los datospodríanser representados alo

largo de la escalade las frecuencias,enun espectrode los mínimoscuadrados.

Uno paso importante enla evaluaciónde los ritmosbiológicosesla inspección

de los datos originales.El cronogramanosproporciona unarepresentaciónútil de los

datos,obviamentela ritmicidad se podráreconocerfácilmente,si bien éstaes una

50

-

SECCION EN SERIE CRONOBIOLOG ¡CA

pordón dela representación

esque¡náuca que se om~eN

1 f 1.incrementos .

‘~~1

4• ....,.,,. •0~

- 1

.IÁtt4’

úlb¡no dato

k— Series de bempo analizadas

finComienzo

A—

~27Oo

1 •• 1

Acrof ase 1aO

~1

u-95%jo

- 9O~

P~mer dato

Figura 14

51

aproximaciónmacroscópica.Para una descripción cuantitativade los datos sería

necesariouna aproximaciónmicroscópicade estos. El cronogramapuede además

proporcionarnosunainformaciónmuyútil concernientea lanecesidadde transformar

los datos, la existenciade puntosextremos (incorrectos)o conocersi el modelo es

apropiado.El cronogramase puedeobteneral realizaruna secciónen serie de los

datos(figura 15).

Lasumaresidualde los cuadrados(RSS)sirve paradospropósitos:parael test

dehipótesis(deteccióndel ritmo) y parala estimaciónde los intervalosde confianza.

Los intervalosde confianzapara el periodo pueden estar determinados medianteel

métodono lineal de los mínimos cuadrados (Rummelcf aL, 1974; Binghamcf aL,

1992). Cuandolos límites de confianzadel periodo deun determinadoritmo no

incluyenel periodo ambiental,se dice que el ritmo presentaderiva de la acrofase,

cuando ésta reconocetodo el ciclo ambiental,sedice queel ritmo presentaencurso

libre. Estecursolibre hasidodocumentadode formaextensivaenausenciadetiempos

de referencia(Halbergcf aL, 1953; Halberg, 1969; Halbergcf aL, 1990), tal como

sugierela deriva de la acrofase,y su continuacióna lo largo de un ciclo completo,

afirma la endogenicidadde un ritmo fisiológico. Cuandoel desplazamientode la

acrofasede un ritmo ocurreenun momento dado,y duranteun determinadoespacio

detiempo, recibeel nombrede movimientode la acrofase.El desplazamiento puede

ser gradualo brusco.

En el plexograma(figura 16) los datospueden agruparseenun sólo ciclo, y un

número de claseselegidasaplicarsea un análisis de varianza (ANOVA) de una

dirección,paradeterminarlos efectosdel tiempo. Debemosteneren cuenta quelos

resultados van adependerdel númerode claseselegidasy del tiempo de referencia,

en el casode seriesde datos longitudinalesque cubren variosciclos en pequeños

intervalos(Hilíman cf al., 1990). Se debe señalar también queun efectodel tiempo,

estadísticamentesignificativo,encontradomedianteel empleodelANOVA, no puede

ser interpretadode inmediatocomoun ritmo. El ANOVA sólo revela queel tiempo

puedeser consideradocomouna fuentede variaciónestadísticamentesignificativa.

52

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54

Pararesumirlos resultadosindividuales,obtenidosde diferentesanimaleso

individuos que pertenecena la misma población, las característicasde los ritmos

obtenidasmedianteel coseno simple,puedenser analizadasposteriormentemediante

el cosenode mediasdepoblación(Halberget aL, 1967) (figura 17). Lascaracterísticas

delritmo, obtenidas medianteel cosenosimple,sonconsideradasentoncescomo datos

de entrada. Elcosenode mediasde poblacionescontribuye en unaestadísticade

segundoorden,que seaplicapara deducirregionesdeconfianza,relacionadas conel

total de la población. Los parámetrosestimadosestánbasadosen medias de las

estimacionesobtenidasparacadaindividuo en la muestra.Lasregionesdeconfianza,

para estos parámetrosde población,van a dependerde la variabilidad entre los

parámetrosindividuales estimados.Los test de ritmo y MESOR, son pruebas

deduciblesestadísticamentede la similitud de los parámetrosde los ritmos,en dos o

másritmos.

Cuandosedesconocela duracióndel periodode los ritmos,perose asumeque

está dentro deun cierto margen,se puedeaplicar una ventanacronobiológica. Este

procedimientoes muyútil también,cuandotratamosconbioperiodicidadesque están

desincronizadasdel periodo del medio ambiente. También se debeaplicar

preferentementecuandolos datoscubrenun númerosuficientede periodosy/o en

contra del componentebiológico. Este métodoconsisteen aplicarel procedimiento

del cosenosimple,no únicamente aun periodoprefijado,sino a una seriede periodos

de prueba que están dentrode unmargen(lineal enperiodo),y a disminucionesentre

periodosconsecutivosajustadospor la ritmometríade los mínimoscuadrados(lineal

en frecuencia).En tal caso, estaremosinteresadosen determinarla extensióndel

periodo, dentrode estemargen,para el cual la sumaresidualde los cuadradoses

mínima.

Otro procedimientoposible,para so]ucionarel problema delos datosno

equidistantes,es el uso del métodono lineal de los mínimoscuadradosparaestimar

el periodo, asícomo la amplitud y la acrofase.Este método tambiénnos permite

ajustar al mismo tiempo varias componentes.Para este propósito se usó una

combinaciónde programasde ordenador(Rummelet aL, 1974; Marquart,1963).

55

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56

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Primerose emplean métodos linealesy posteriormenteseaplica unaritmometríano

lineal contodos los periodos“candidatos”y suscaracterísticas(obtenidasdel método

lineal), usadoscomoestimacionesiniciales. Despuésdeuna serie deprocedimientos,

se obtienenlos parámetrosfinales (figura 18).

Desdeun puntode vistaclínico, la determinación deritmos con unaamplitud

relativamentegrande se basa enreconocer la necesidadde unos intervalos de

referenciaespecificadosen el tiempo. Se necesitanritmos con distintasfrecuencias

paracaracterizarvariablesde vital interésespecificadasenel tiempo,pero ignoradas

habitualmente.Estosritmos contribuyen,en gran parte, ala gran variabilidadquese

observaen los datos clínicos.Desdeahorase podrá mejorarel diagnóstico,si no se

recogenlos datos únicamente en undeterminadomomento,sino en intervalosde

referencia especificadosen el tiempo; los cronodesmos(Ha)berg et aL, 1978)

colaboraríaneficazmentea la interpretaciónde los datos.

Parala comparaciónde los parámetrosobtenidosmedianteel métodocosenor,

seempleanunos testde parámetrosdiseñados especificamenteparaello (Bingham

cf aL, 1982), estostest comparanlos MESORes,las amplitudesy/o las acrofasesque

se obtienen de ajustarla curvacoseno,bien aseries longitudinales,o alos parámetros

de un ritmo circadiano, aplicado a una determinadapoblación; por tanto, la

comparaciónse puedellevar a cabo, tanto de forma individual, como de forma

colectiva.

Al recogerlos datosenfunción del tiempo,ademásdeobtenerun valor medio

másexactoy preciso,tambiénobtendríamosuna dobleamplitud, quenos mostraría

cuál esla variaciónpredeciblede estosvaloresdel ritmo,y obtendríamosla acrofase;

por ejemplo, si estuviésemosanalizandolos eosinófilos,en dos gruposde animales,

perrosy ratas,supuestamentealojados bajolasmismas condicionesambientalesy bajo

el mismo ciclo de ]uz-oscuridad(LO 12:12), encendiéndosela luz a las 08:00horasy

apagándosea las 20:00h.; nospodríamos encontrarconun valor medio,enun grupo

de perrosde 0,5 x iO~/í y el valor mediode ungrupode ratasde 0,4 x íO~/í, lo único

que podríamos deciresquepresentanunasconcentracionessimilaresde eosinófilos;

57

Orthophase*(N = 24>

1000

oOO:aO a4:ao08:aO

Figura 18

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3000

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12:aa 16:aO 20:00 00:00

58

en cambio, si empleasemosel método cosenor,obtendríamosel MESOR, que para

el primer grupo seria,p.e., igual a 0,44 x 10~/l y para elsegundo0,47 x io~/í; pero

tambiénobtendríamos laacrofase,dato fundamental enlo referenteal ritmo de los

eosinófilos, puesto quela acrofaseen los perros tendríaun valor de ~30Ó,lo que

significaquelos valoresmáximossealcanzanduranteel periodode oscuridady en el

grupo de ratas obtendríamosuna acrofasede -210~, lo que indica quelos valores

máximossealcanzanduranteel periodode luz, apartede obtenerla dobleamplitud.

Mientras que conlos métodosempleadoshastaahora,sólo podríamos decir quelos

valores de eosinófilos en rata y perro son similares,únicamente conestos tres

parámetrosnos damos cuenta quesus ritmos están enalofase (son opuestos).

También obtendremosnuevosparámetros,que puedenser evaluadospor sí mismos,

comoguíasdel efectode un tratamientoo de la prognosisde unaenfermedad.

El empleo del métodocosenor y la obtenciónde estos nuevos parámetros

-MESOR, amplitudy acrofase,quedefinenlos ritmos circadianos, circaseptanos,etc,

de forma más exacta, en el diseño experimental de una investigación— nos

proporcionaráresultadoscronofisiológicosmásprecisos.

59

MATERIAL Y METODOS

Al ser ésta,unaTesis dirigida por un Veterinarioy un Médico, en ellavamos

a encontrar, en cuanto asujetosempleadospara el posibledesarrollode la misma,

personasy animales,puesto que lacronobiologíaes unacienciaaplicable enambos

camposy de la cual sepuedenbeneficiar,tanto unos comootros.

OBTENCION Y ANÁLISIS DE LAS MUESTRAS

EXPERIMENTO1: Variación Circadianadel Cortisol

Animales:

En esteestudioseemplearonun total de 150 conejosmachosadultos,Blancos

de NuevaZelanda(NZW), cruzadosentresí a lo largo de másde 20 generaciones,

mantenidos en un ambiente microbiano convencional y con un peso de

aproximadamente2,90 0 15 kg. Los animalessedividieron endosgrupos,segúnel

métodode recogidade muestrasa seguir:serialmentedependientes(25 animales)y

serialmenteindependientes(125 animales),estosdos grupossesubdividierona suvez

en cinco subgrupossegúnel ciclo de luz empleado.

Alojamiento y alimentación:

* jaulas de malla metálicaindividualesde 48 x 61 x 46 cm

* condicionesambientalesestándar:

- temperaturaambiental:180 - 240C

humedad relativa delaire: 50-55%

- renovacióndel aire: 10 a 15 ciclos por hora

61

La dietaconsistió en 150 g/día de Purina LaboratoryRabbitChow

- 16,2% de proteína

- 2,5% de grasa

- 13,5%de fibra

y condisponibilidadde aguaad libiturn.

Los animales fueron alojadosbajo 5 ciclos diferentes deluz, con unas

duracionesde los periodosde luz-oscuridad(LO) de:

- LO 16:08- LO 14:10

- LO 12:12

- LO 10:14

- LO 08:16

En las cualesel primer númerose correspondecon la duración de la luz

(fotofracción)y el segundoconla duracióndel periodode oscuridad (escotofracción),

en unrégimende luz cíclico de 24 horas.En todos los ciclos la luz se encendió alas

08:00 am.

El periodo de adaptaciónparacadaunade estascondicionesfue de 20 días.

Toma de muestras:

Material

- Agujasde0,8 x 25 mm (21 G x 1”) (Becton Dickinson).

- Tubosvacutainerheparinizadosde 100 x 16 mmm (Becton Dickinson).

- Xileno (Panreac).

- Algodón.

62

Metodolo2iaempleadaparala toma de muestras

En laobtenciónde muestras,paradeterminarel ritmo circadianodel cortisol

en los conejosseempleóun estudiotransversaly dos métodos diferentes.Unade las

técnicasconsistió en la obtenciónde datosen los mismosanimales,o recogida de

muestrasde forma serialmentedependiente.En este procedimiento,cada conejo

proporciona5 muestrasdesangre aintervalosde 4 horas,duranteun ciclode24 horas

(se omitió unade las tomas de muestra).

La otra técnica consistió en la obtenciónde muestrasde forma serialmente

independiente, cadavalor de cortisol seobtuvo deun conejodiferente,es decir cada

conejoúnicamente proporciona unamuestrade sangre.Por tanto, en cadamomento

de la obtención de muestrasy para cadaciclo de luz, en un método serialmente

independiente,se obtienen5 valoresde cortisol, cada unoproviene de un conejo

diferente; necesitando25 conejospor cadaciclo deluz. Comoempleamoscinco ciclos

de luz diferentesparaestudiarel efectoqueéstostienenenel cortisol,necesitaremos

utilizar un total de 125 animales.

Las muestrassanguíneasserecogierona las 08:00, 12:00, 16:00,20:00y a las

00:00 horas,de la venamarginalde la oreja. Despuésde la extracciónde sangre,el

plasmafue separado en unacentrífugaMinifuge RF (Heraeus)a 1200 x g y a 40C,

durante20 mm. El plasmaobtenido seextrajo medianteel usode unapipetapasteur

(Brand) y se introdujoen tubosde plásticode 50x 15 mm, tapándoloscon parafilm

(AmericanCanCompany).Se identificó cadatubo medianteunaetiqueta enla que

se anotóel númerode animal, la horay la fechade recogida,así comoel númerode

alícuota. El plasmase conservó congeladoa -300C, hastael momentodel análisis

hormonal.

Determinaciónde las concentracioneshormonales

El procedimientoparadeterminarlas concentracionesplasmáticasde cortisol

fue el ELISA de competición, según el protocolo descrito por Silván (1991),

63

empleando como fasesólidaunamicroplacade poliestireno de Dynatech(Germany)

de 96 pocillos.

Los derivadosesteroides paralos conjugados(4-Pregnen-llWl7a,21-triol-3,20

dione 3-CMO) y la hormona estándar(4-Pregnen-11B,17a,21-triol-3,20dione) se

adquirieronen SteraloidsInc. (Wilton, New Hampsire,USA).

Los anticuerposy conjugadosfueron los producidosy caracterizadosen el

Departamentode FisiologíaAnimal de la Facultad de Veterinaria,UCM; la HRP

RZ=3,2(peroxidasade rábanopicante)seobtuvodeBoebringer Mannheimy la OPD

(O-phenylenediaminedihydrochloride)de SigmaChemicalCo. (St. Louis, Missouri,

USA).

La determinación delcortisol se realizó en el plasma sin extraer. La

sensibilidaddel ensayoesde 0,1 pg/pocillo y el coeficientede variación (CV) intra-

e inter-ensayofue menor del5%, en todos los casos. Lasdosisy las curvasestándar

de la hormona seobtuvieronusando un programaespecialde ELISA (Informatics

Department,Universityof California,Davis, California,USA).

EXPERIMENTO2: Marcadores dcCrecimiento,CA125 y CAI3O

Sujetos

En esteestudio la recogidade muestras salivaresse realizó tanto enpersonas

como en animales.

En lo concernienteal grupo de personas,éste estabaconstituidopor un total

de 32 mujeresy por un hombre.

El grupo de mujeresestabasubdivididoen tresgrupos:

- el primero secorrespondecon un grupo de personassanascon edades

64

comprendidasentrelos 28 y los 48 años.

- el segundogrupo estabaconstituido por un total de 5 mujerescon

tumores,casi todas ellaspresentaban cáncer deovario, susedades

estabancomprendidasentrelos 35 y los 72 años.

- el tercero y último lo constituíanun grupo de mujerescon ovarios

poliquisticos,cuyasedadesoscilabanentrelos 38 y los 45 años.

El hombre queparticipó enel estudioeraun hombreclínicamentesanode 72

añosde edad.

Los animales empleadosen el estudio de los marcadoresde crecimiento,

CA12S y CAI3O, fueron:

* vacas:

- RazaFrisona

- Edad: 2-4 años

- Alojamiento:explotaciónde producciónlechera

- Alimentación: dieta equilibradacompuestapor:

- soja44 20,0%

- maiz 20,0%

- cebada 55,5%

- grasaby-pass 1,5%

- corrector 3,0% (carbonato, fosfatoy oligoelementos)

- Agua: ad Iibitum

* conejos

- Raza:Blancosde NuevaZelanda(NZW)

- Edad:6 meses

- Peso:3 - 3,5 kg

- Alojamiento:jaulasindividualesde 48 x 61 x 46 cm

65

- Alimentación: 150 g/día de alimento paraconejos(Purina)

- proteína 16,2%

- grasa 2,5%

- fibra 13,5%

- Agua: att libitum

- Condicionesambientales: 21-240C

45-55% de humedad

LO 14:10, encendiéndose la luz alas

07:00horas

* ratas

- Estirpe:Wistar

- Edad: adultas

- Peso:250-300g

- Alimentaciónen forma de pellets (PurinaLab Chow) ad libitum

- Agua: att libifurn

* ratones

- Estirpe:Balb/c

- Edad:adultos

- Peso:22-25 g

- Alimentación: igual que laanterior

- Agua: att libitum

Toma de muestras

Material

- Tubos de plástico50 x 10 mm.

- Embudodep]ástico.

- Cánulasparala obtencióndesaliva (Andersen).

- Vasomedidorparadeterminar lacantidadde aguadel enjuaguede la boca.

66

Metodoloulaemuleadaen la toma de muestras

La saliva de las personasse recogió a lo largo del día, a intervalos de

aproximadamente4 horasdurantelas 24 horasy en algunoscasoscon ocasionales

interrupcionesdurantela noche.Lasmuestrasse recogíanal menos una horadespués

de cualquieringestióndecomidao líquidos. La obtenciónde estasalivase hizo antes

y despuésde un completo enjuagadode la boca. En cadacaso se recogió

aproximadamente1 ml de saliva en tubos de plástico de 50 x 10 mm (a veces

mediante laayuda de unembudo)y se congelóinmediatamente a-250C. El periodo

de recogida varíasegunla persona,éstese detallaposteriormenteen la tabla 6.

El diseño delestudioen estecasoesdetipo mixto o hfbrido,puessedetermina

envariaspersonas (transverso)y durantevariosdías en cadapersona(longitudinal).

El horario seguidofue similar en todasellas, levantándoseentrelas 07:00y 08:00 h

de lamañanay acostándoseentrelas 00:00 y la 01:00 h de la noche.

La saliva de los animales se recogiómediantecanulación de la glándula

parótiday siempreuna horadespuésde cualquier ingestiónde comidao líquido. Se

recogieronaproximadamente0,5 ml de saliva en pequeñosanimalesy de 1-2 ml en

vacas.Todaslas recogidasserealizaronsin enjuagarla boca.La saliva se congeló

a -250C hastasu posterioranálisis.

Las extraccionessanguíneasde las vacasse realizaronde la vena caudaldel

rabo; delos conejosde la venamarginalde la oreja,y de lasratasy de los ratonesde

la vena centralde la cola. La sangrese centrifugó y almacenó,hastasu posterior

análisis,siguiendolospasos descritosanteriormenteparalosconejos.Lasmuestrasse

recogierona las 08:00de la mañana entodos los animales.

67

Determinaciónde las concentracionesde los marcadores decrecimiento

Trabajamos condosmarcadores decrecimiento,CA12S (CancerAntigen 125)

y CA13O (CancerAntigen 130), inicialmentellamadosmarcadorestumorales,puesto

queal principio únicamenteseutilizabanparadeterminartumoresováricosdeorigen

no mucilaginoso (Bastcf aL, 1981).

Marcadorde crecimientoCA125

Fue determinadoen salivay suero,medianteradioinmunoanálisis(RíA), con

kits procedentesde Centocor(Malvern, Pennsylvania, USA),un test in vifro parauna

valoración cuantitativa del determinanteantigénico CA125. Las determinaciones

químicasfueronllevadasa cabosegúnlos métodosdescritosoriginalmentepor Bast

cf aL (1981)y Chena aL (1990),estosautores produjeronun anticuerpomonoclonal,

llamado 0C125, el cual reconoceal determinanteantigénico CA125, con una

sensibilidad del 88% en la detección de carcinomas ováricos epiteliales no

mucilaginososy de un 60% en cáncerde útero,necesitándoseúnicamente50 gl de

volumenpor muestra.

Marcadorde crecunienfo CA130

LasdeterminacionesdelCA13Oserealizaronmedianteradioinmunoanálisiscon

kits D-7111, procedentesde Daiichi Radioisotope Laboratories(Tokyo, Japan).Se

utilizó un análisisinmunoradiométricotipo “sandwich” (double-determinantassay)con

anticuerposmonoclonales130-22y 145-9 (Kobayasliia aL, 1991),obtenidosde ratón.

El ensayo muestra unaexcelente sensibilidad, especificidad, reproducibilidad,

cubriendo lacurvaestándarun margende 10 a 500 U/ml.

Lasmuestrasde los animalesdescritosfueronempleadas,tantoparacomprobar

la existenciade marcadoresde crecimiento, como para determinar, encaso de

encontrarestosmarcadores,cuál erasu concentracióna nivel sanguíneoy salivar,así

como su relación con los nivelesencontradosen la especiehumanay su posible

68

utilización eninvestigaciónanimal.

EXPERIMENTO3: PresiónSanguíneay FrecuenciaCardiaca

Sujeto

El estudiose realizó en unamujer clínicamentesanade28 años,en la quese

controló y midió la presiónsanguínea(PS) y la frecuencia cardiaca(FC). Iniciando

el día, aproximadamente,a las 07:00h y acostándose,aproximadamente,a las 00:00

horas.

Metodología

Material

- Monitor portátil automáticoABPM-630 (Colin Medical Instruments

Ltd., Komaki City, Japan).

- Casete dememoria.

- Cartuchode CO2.

- Procesadorde datos (Colin Medical InstrumentsLtd., Komaki City,

Japan).

- Ordenadorportátil IBM con una impresora LaserjetIII.

Método empleado en larecogidade datos

La recogidadedatos sellevó a cabodeformalongitudinal, desdeel 17 de abril

al 28 de julio de 1992, conun monitorportátil automático.

Este monitor esfácilmentetransportabley estáconstituidopor dos partes,la

unidadprincipal y un manguito,conectadosmedianteun tubo de plástico,por donde

circularáel CO2, y un cablequelleva la informacióndesdelos sensoresdel manguito

a la memoria delmonitor; el manguitosesitúaconlos sensoresen la cara internadel

69

brazo izquierdo, inmediatamente antes delcodo. En la unidad delmonitor se

encuentranalojados,apartedel programadiseñadoespecialmente parael control de

PSy FC, una memoria dondequedaránalmacenadoslos datos;conunacapacidadde

almacenajedeaproximadamente4-5 días(40.000bytes),dependiendode la frecuencia

con que éstos se recojan, esta memoria es extraible para poder conectarse

posteriormentea un procesadorde datos,conectado a un ordenador.

La unidad tambiéntiene capacidadpara alojar unabateríarecargabley un

cartuchode CO2 con el quese inflará elmanguito;ésteesde plásticoy estácubierto

por una funda de tela que aloja en su interior dos sensoresde presión, para

determinarcon una mayor precisiónla PS y FC, bien de forma oscilométrica(por

sensoresque detectanlas ondas de la presión sanguínea)y/o por sonidos de

Korotkoff. Apareciendolos datosmedidosen unapantallade cristal líquido.

El monitor que vacolocadoen la cintura puedeser programado paraobtener

datos,cada 15, 30 ó 60 minutos, de la presión arterial sistólica (PAS), la arterial

media (PAM) y la presiónarterialdiastólica(PAD), así comomedicionesde la FC.

Aunque en este caso, como hemos citadocon anterioridad, las medicionesse

realizaron cada 15 minutos, durante Las 24 horas del día, con ocasionales

interrupciones.

Al conectar la memoria al procesador de datos y éste al ordenador,

obtendremoslasseriesdedatosenel tiempo,partefundamental encronobiología.Los

datosde la PAS, PAM y la PAD vienenexpresadosen mm de Hgy la frecuencia

cardiacaen ppm (pulsacionespor minuto).

METODOLOGíA ANALíTICA CRONOBIOLOGICA

Despuésde la obtenciónde las seriesdedatos,tanto de la presiónsanguínea,

frecuencia cardiacay marcadores decrecimiento,comolasseriesdedatos delcortisol,

todas ellas fueron analizadasde forma cronobiológicamediante, unordenador

70

compatibleIBM, y con la ayudade programasdesarrolladosen los Chronobiology

Laboratories, University of Minnesota, Minneapolis (MN, USA) y cedidos

amablemente porel Dr. FranzHalberg, directorde dicho laboratorio.

Experimento1: Variacionescircadianasdel corfisol

Los datos delcortisol obtenidos fueronanalizadospor el métodocosenor

simple (Halberg, 1969).En estecasoel procedimientoconsistióen ajustar,mediante

el método delos mínimos cuadrados,una curva cosenode 24 horas (circadiana)y

también,unade 12 horas(circasemidiana),por separadoy unacombinaciónde ambas

curvascoseno,a los datos.

Por cada componenteconsideradoen el modelo (24 horas y 12 horas),se

obtienenunaamplitudy unaacrofase, éstasson medidasde la magnitudy el tiempo

del cambio que se producey que son predeciblesen un ciclodel ritmo, por tanto

obtendremos3 amplitudesy tresacrofases (unapara24 h, otrapara 12 h y la última

parael modelode dos componentes).Además,se estimael MESOR, media ajustada

al ritmo, siendoéstesimilar paralos tresmodelos.

Se eligió como fasede referencia,para todos los métodos,el HAML (punto

mediodel intervalode luz), despuésde realizardiferentescálculos previosy teniendo

en cuentatrabajosanteriores,en los quese tratanlasventajasde la utilización de las

distintasetapasde los ciclos de luz-oscuridad, comotiemposde referencia (Sothern

y Halberg, 1979; Sothernef aL, 1978).

Para simplificar los resultados obtenidosde cada conejo, en el muestreo

serialmentedependienteseusóel métodocosenordemediasdepoblaciones(Halberg

ef aL, 1967).Los datosobtenidosde cadacinco conejos,en el sangrado serialmente

independendiente,se analizaron medianteel método cosenorsimple, para poder

generalizarlas deducciones hechas,a la población.

71

Dos aspectos de este estudio fueron particularmenteinteresantes:uno

relacionado conla comparacióndel ritmo circadianodel cortisol de los conejos,

determinadoen dos esquemasde sangrado diferentes(serialmentedependientey

serialmenteindependiente),y el otro consiste en una comparación del perfil

circadianodel cortisol, entrediferentesciclos de luz, en ambos gruposde sangrado.

Para poder procedercon estas comparacionesse emplearonlos test de

comparaciónde parámetros, creados amedida para ello (Bingham a aL, 1982);

medianteestostestsecomparanlos MESORes,amplitudesy/o acrofases,primero de

forma separada(esdecir MESORconMESOR)y posteriormentede forma conjunta

(considerandoal mismo tiempo MESOR, acrofase y amplitud). Utilizando los

parámetrosque seobtuvierondeajustarunacurvacosenoa lasseries simplesde cada

conejo o bien, aplicándoloa los parámetros delritmo circadianode la poblaciónde

conejos,por tanto la comparaciónse puede llevara cabo tantode forma individual,

comode forma colectiva, comparandocadaparámetrodeforma separadao bien de

forma conjunta.

En el estudio del muestreo serialmente independiente, decadaconejo se

obtuvo una sola muestra,y las seriesde tiempo se construyeron considerandode

forma concomitantelos 25 datosde los 25 conejosen un determinadorégimen; es

decir, de entrelos 25 valores que proveníandel sangradode los 25 animales,no

existiópreferenciaal seleccionar5 seriesde 5 valores,quesecorrespondiesenconlas

5 series obtenidasde los 5 conejossangradosde formaserialmentedependiente,sino

que fue unaselecciónal azar. Porsupuestoexistíala posibilidadde considerar todas

las ordenacionesposibles,mediantecombinacionesy permutaciones,paraconstituir

seriesde 5 valoresparaanalizar,pero esteprocedimientono fue empleado eneste

caso.

72

Experimento2: Marcadores decrecimiento> CA125 y CAJ3O.

Las seriesde datosse analizaroncon métodosritmométricos,principalmente

medianteel método cosenorsimple, descritoanteriormente, con un periodo,r,

anticipadode 24 ó de 168 horas.

Primerofue necesariala detecciónde la existenciade un ritmo circadianoen

los marcadores decrecimientode laspersonassanasy de varias de laspersonascon

cáncer, cuando no se pudo detectar el ritmo circadiano, se abrió una ventana

cronobiológica, lineal en frecuencia, para detectar laexistencia de otras

bioperiodicidades,tambiénse ajustóuna curvacosenocircaseptana(168 h ó 7 días)

a los datos.

Para las diferentes característicasse obtuvieron los puntos e intervalos

estimados,estosparámetrosfueronel MESOR(M), la medialíneadel ritmo de los

marcadores decrecimiento estimadaestadísticamente;la dobleamplitud circadiana

(2A), o la medidade la extensióndel cambio de las concentracionesde CA125 y

CA13O, que se produce enun día y quees predecible;y la acrofase(~), unamedida

del momentoen que se produceel conjuntode los valoresmásaltosde CA125 y de

CAl3O y que recurren en cadaciclo.

La acrofaseestará expresada engradosnegativos,relacionandolos 3600con r,

si r 24 horas la acrofasese podráexpresartambién enhoras,y si r = 168 h se

podráexpresaren díasde la semana.El tiempo de referenciaelegidoparael estudio

de estosritmos fue la medianochelocal.

Seutilizaronmétodosconvencionalesde estadísticaqueconsistenenel cálculo

de medias,error estándary de un análisis devarianza (ANOVA) (Sokaly Rohlf,

1981). En vista de la distribucióndel CA125 y del CA330,algunosde los análisisse

realizarontambién,despuésde unatransformaciónlogarítmica,en base 10, de los

datos.Los análisis,por tanto, se llevarona cabo tanto enlos datos originales como

en los transformadosen logaritmosparafacilitar la interpretaciónde los mismos.El

73

primer análisis(datosoriginales)sirve paravisualizarla localizacióny la dispersión

de los datos originalesy el segundo(1og10 de los datos)paraaproximarde forma más

exactalo asumidoen los testsclásicos.

Los datosse agruparonen unosperiodosideales,circadianoy circaseptano,y

se analizaron medianteun análisisde varianza,para determinarel efectodel tiempo

enlos mismos,obteniendoal mismo tiempo plexogramaso representacionesgráficas

de los datosagrupadosen clases.

Experimento3: >4lofasecircatrigintana entrePS y FC

En estaocasión,al igual que enlas anteriores,los métodosempleados están

basadosen el coseno,empleandoel métodocosenorsimple.Primeramentese ajustó

unacurvacosenocon r = 24 horas,a los 8.583 datos,determinandola ya conocida

ritmicidad circadianade la presiónsanguíneay de la frecuencia cardiaca,por tanto

esteajustede la curvase realizó porcuatriplicado,esdecirunavez parala PAS, otra

vez paraPAM, posteriormentepara la PAD y por último parala FC. Por tanto el

volumen de datosempleadosfue de 34332datos. Comodía de referenciaparaesta

determinaciónse tomó el primer díadel ciclo menstrual,pueses el sincronizadorde

muchosde los ritmos en las mujeres,comoson el circaseptanoy el circatrigintano.

Trasla detección elritmo circadianoseprocedióa realizarseccionesen serie

de los datosde la presión sanguínea(PAS, PAM, PAD) y de la frecuencia cardiaca,

tomandocomoperiodo,intervalo e incremento24 horas,en todos los casosobtenido

un MESOR, una amplitud y unaacrofasepara cadadía. Estascaracterísticasde los

ritmosseránconsideradas,posteriormente,como datosde entradaparala realización

de otros análisis cronobiológicos.

Para la obtención del gráfico medianteel método lineal de los mínimos

cuadrados,seajustó la curvacosenode 720 horas(30 días>a los 92 MESOResdiarios,

obtenidosde ajustarla curvacosenocircadianaen la secciónen serie.

74

La figura polarcircadianaseobtuvomediante laaplicacióndel cosenorsimple

a los 92 MESORes,amplitudes,acrofases,P.R.y valoresde p, obtenidosde la sección

enserie,mientras que para lacircatrigintanase emplearonlos datosoriginalesdeuna

semana.

75

RESULTADOS

A continuación vamosa pasar a detallarlos resultados obtenidosa lo largo de

estaexperimentación;primeroexpondremoslos resultadosdel análisisde lasmuestras

de cortisol plasmático,en dos gruposde conejos,sangradosmediantedos métodos

diferentes:serialmente dependientey serialmente independiente.

A continuacióndetallaremoslos resultadosobtenidosal analizarel cronoma

de dos marcadoresde crecimiento,el CA125y el CAI3O, tanto ensujetossanos como

enfermoscon tumoresováricos.

Finalmente,expondremoslos resultados obtenidosal analizarlas largasseries

longitudinalesde la frecuencia cardiacay la presiónsanguínea.

77

EXPERIMENTO 1: VARIACIONES C!RCADL<4NASDEL CORTISOL

En la tabla1 están detalladaslascaracterísticasde] ritmo circadiano (MESOR,

amplitud y acrofase)del cortisol plasmáticoen conejosmantenidosbajo 5 ciclos de

luz diferentes, y que fueron sangradossiguiendo dos metodologías distintas:

serialmentedependientey serialmenteindependiente.Cadacaracterísticadel ritmo

esta expresada consus límites de confianzadel 95% (ES: para el MESOR y ~a

amplitud e IC: parala acrofase).La amplitud estáreferidaen susunidadesoriginales

y en porcentajedel MESOR; este tiltimo empleado paraeliminar el efectode la

variabilidad inter-individual.

La tabla 2 resumedos de los parámetros(A y acrofase)de los componentes

del ritmo (r = 12 horasy r = 24 horas)del cortisolplasmáticoy cómocontribuyen

(p y PR) estosdos componentesa la forma de la curva, asícomola probabilidady el

porcentaje delritmo, cuando consideramosel modelode la curvacosenoconstituido

por esosdos componentes(Total). Estas característicasdel ritmo se describende

forma independientepara cadaciclo de luz primeroy, posteriormente,los datosson

consideradoscomo unapoblación, es decir, se analizanlos datos comosi todos los

conejosperteneciesenal mismo colectivo,sin considerarlos distintos ciclos de luz.

En la tabla 3 estánrecogidos los parámetrosdel ritmo, y se indican las

diferenciasquese observanen el ritmo circadianodel cortisol plasmáticode mujeres

sanasa lo largo del año.

El esquema1 relacionalas horasde reloj con las horasHXML (Hours After

Mid Light: horasdespuésde la mitad del intervalo de luz) en los cinco ciclos de luz-

oscuridad.

En las gráficas1 a 5 estánrepresentadaslas diferentesconcentracionesdel

cortisol plasmático,a lo largo del día, en conejossangradosdc forma serialmente

independientey serialmentedependiente.Cada puntodel gráfico se correspondería

78

con la media de unaserie dc cinco conejos,y cadagráfico se correspondecon cada

uno delos 5 ciclos de luz empleados(LO 16:08, 14:10, 12:12, 10:14,08:16). En el eje

de ordenadasestá representadoel tiempo (HAML), y en el de abcisas las

concentracionesde cortisol (ng/mí).

En la gráfica 6 están representadoslos niveles de cortisol plasmático en el

conjuntode conejossangradosserialmentedependiente,y en la gráfica 7 el conjunto

de los sangradosde forma serialmenteindependiente(obsérvesela diferenciade

concentraciones).

La gráfica8 representala relaciónexistenteentrela duraciónde las horasluz

y la amplitud,determinadaen cadaconejo.

Las gráfica9 y 10 son representaciones polaresde los valoresdel cortisol. La

gráfica 9 de los conejossangradosserialmentedependiente,y la gráfica 10 de los

sangradosserialmenteindependiente.Cadaelipsedeconfianzarepresentalos valores

del cortisol en cadaciclo de luz-oscuridad.

79

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Gráfica 10

93

EXPERIMENTO 2: MARCADORESDE CRECIMIENTO. CA125 Y CA130

La tabla 4 es un resumenestadísticode los dos marcadores decrecimiento

estudiados.Este resumen fue realizadoen los datos originales,y en los datos

transformadosen logaritmos.La salivafue recogidaantesy despuésdelenjuagadode

la boca.

En la tabla 5, primero,se detallacomovarían las concentracionesdel CA12S

y del CA13O, a lo largo del día (porclasesde 4 horas); tanto cuandoseconsideran

únicamente23 muestras(10-14de abril), comocuandoseconsideran61 muestras(10-

21 de abril), en los valoresoriginalesy en los valorestransformadosen logaritmos.

Posteriormentemedianteel análisisde varianza(ANOVA) de los datosy aplicando

el métodocosenora los mismosdatos,obtenemoslos valoresde p, quenos indican

en qué medidalos datos dependendel tiempo. Obteniendoademás,al aplicar el

métodocosenor,las característicasdel ritmo, las cualesquedanreflejadasen la parte

inferior de Ja tabla. Podemos observarlas diferencias existentesentre media y

MESOR.

En la tabla6 serecogenlascaracterísticasde los sujetosqueparticipaneneste

estudio,asícomolas fechasen que sellevarona caboéstos,y se comparanlos valores

del CA125y delCAl3O dedichossujetos,unode ellos con cáncerde ovario (lO1EH)

y otros tres sanos (21OHM, 209GC, 21lAP); mostrando las diferencias de

concentracionesentreel CA125y el CA13O, antesy despuésdelenjuagadode la boca.

La tabla7 se confeccionécon los resultados obtenidosde comprobarsi las

diferencias encontradasentre las concentracionesde ~A125 y de CAI3O eran

consistentes.Para ello se analizaron series más largas, proporcionadas por una

paciente con cáncerde ovario (EH). Las diferenciasfueron estimadasen varios

espaciosde tiempo: entre00:00 y 04:00; 04:00 y 08:00; 08:00 y 12:00; 12:00 y 16:00;

16:00y 20:00; y 20:00y 00:00 horas.

94

En la tabla 8 se resumenlos análisis llevadosa cabo, para conocersi las

diferenciasentrelos dos marcadores estabanen función de las concentracionesde los

mismos.Se usaronlos datosde la pacientecontumor ovárico,paraformar diferentes

clasesbasadasen los valoresde las concentracionesde CAI2S. Se consideraronlas

siguientesclases:CA125 entre200 y 300 (no habíavalorespor debajode 200); 300y

400; ...; 900 y 1000; 1000 y 2000; 2000 y 3000; ...; 9000 y 10000; y mayoresde 10000.

En la gráfica 11 se comparanlas concentracionesde los marcadoresde

crecimiento CA125 y CA13O salivares,de dos personassanas,antesy despuésdel

enjuagadode la boca.En ambossujetosseobservanconcentracionesmenoresdespués

del enjuagado. Las diferencias de concentraciónentre CA125 y CA13O son

estadísticamentediferentesen todos los casos(medianteun t-test por parejas)

En lagráfica 12 se comparanlos MESOResdel CA13Osalivarentreun grupo

depersonassanas(n=2), y otro de personascon tumoresováricos (n=5). Se aprecia

la gran diferenciade concentracióndel marcadorde crecimiento entre estos dos

grupos,siendoéstaestadísticamentesignificativa.

En la gráfica13 secomparanlas distintasconcentracionesdelmarcadorCAI3O

salivar, entredos gruposde sujetossanos(n= 10), y otros con cáncerovárico(n= 6).Obteniendoquela diferencia entrelos MESORes,tanto enunidadesoriginales, como

en las transformadas enlogaritmos,son estadísticamentesignificativas.

Lasgráficas14. 15. 16 y 17 sonplexogramasen los que estánrepresentadaslas

concentracionesde los marcadoresde crecimiento,a distintashoras del día. En los

gráficos 14 y 15 secomparanlas concentracionesde CAI2S y CA130de muestrasde

saliva,halladasen los datos originales(14> y en datostransformadosen logaritmos

(35). En los plexogramas16 y 17 se puede vercomovarían las concentracionesdel

CAÍ3O a lo largo deldía, con datos originalesy transformadosen logaritmos,en 61

muestras desaliva.En todos los plexogramaspodemos ver lasignificaciónestadística

del ritmo circadianode los marcadores,halladatanto medianteel ANOVA comopor

el métodocosenor.

95

La gráfica18 representala curvacoseno(circadiana)que mejor seadaptaa los

23 datos del marcadortumoralCA12S de una mujer clínicamentesana,medianteel

método linealde los mínimoscuadrados;indicándonoscual essu MESOR, amplitud,

acrofase,valor de p y porcentaje delritmo. En el eje de ordenadas estárepresentado

el tiempo, días de abril de 1992, y en el eje de abcisas se representalas

concentracionesde CA12S en U/ml.

En la Rráfica 19, seobserva,al igual que enla gráfica anterior, que lacurva

cosenoque mejor se adaptaa los 61 datos del CAl3O esuna curva circadiana,y

también las característicasdel ritmo obtenidas medianteel método lineal de los

mínimoscuadrados.En el eje deordenadas estárepresentadoel tiempo(díasdeAbril

de 1992), y en el de abcisaslas concentracionesdel marcadorCAl3O (U/mí).

La gráfica20 representala curvacosenoque mejorseadaptaa los 14 datosdel

marcadorcrecimientoCA13O en otro sujeto (GC) en estecaso,y a diferencia del

anterior, la curva que mejor se adapta no es una curva circadiana sino

circasemiseptana.En este gráfico también se obtienen los valores delMESOR,

amplitud, acrofase,valor de p y porcentajedel ritmo. En el eje de ordenadasestá

representadoel tiempo, endíasde abril de 1992, y en el eje de abc¡sasserepresenta

las concentracionesde CA13O, en U/ml.

La gráfica 21 esunarepresentaciónde la amplitud delCAI3O, comoespectro

de frecuencias,de tressujetosclínicamentesanos.En los dos de la izquierda(AP y

JH) se observaunaprominenciadel espectrocircadiano(24 horas);mientras queel

sujeto cuyo espectro está representadoa la derecha (GC), presentaun ritmo

circasemiseptano(84 horas) predominante,con ausenciadel ritmo circadiano.

Las gráficas22 y 23 representanparte del cronomade unapacientecon un

adenocarcinoma queenvuelveel ovario, obtenido de un total de 669 muestrasde

saliva recogidasentre el 23 de Enero y el 6 de Julio de 1992. Aparte del ritmo

circadianoprominente con>r = 24 horasy dos arménicosde 12 y 8 horas,de ambos

marcadoresde crecimiento(parte superiorde lasgráficas),podemosver que elCAI2S

96

presentaun ritmo circaseptanosincronizadode 7 díasy un componentede 22,7 días,

mientras queel CA130 presentaritmos infradianosdiferentes alos del CAl2S:

circanuales, circadiseptanoy un ritmo circaseptanodesincronizador = 7,6 días

(p= 0,009)(parte inferiorde las gráficas).

En la gráfica 24 seobservala evolución detalladade los dos marcadoresde

crecimientoa lo largo de la escalacircadiana,cuandorepresentamoslos datos del

CA125 y del CA130, de EH, en unplexogramacircadiano;en el que los datosde

aproximadamente4 mesesse agrupan en un periodo“ideal de 24 horas(ideal,puesto

que enél se incluyen la totalidadde los datos),asignándose dichosdatosa 24 clases

diferentesde 1 hora.Se observaque ambos marcadorespresentanun ritmo circadiano

muy similar, demostrado estadísticamente,tanto mediante ANOVAcomo por el

métodocosenor.Esto nos da unaaproximaciónde la evoluciónde estosmarcadores,

a lo largodeldía, asícomolas concentracionesaproximadasen cada hora(clase).Los

valores máximos se producen entrelas 06:00y las 07:00, similaresa los descritos

anteriormenteen los gráficos 14 a 17, en los quelos valoresmáximosse alcanzaban

entrelas 04:00y las 08:00,al ser lasclasesde 4 horas.Seobservaconun segundopico

entrelas 18:00y las 19:00.

En la gráfica 25 está representadoel patrón circaseptanodescrito por el

CA125salivarde una pacientecon cáncer.En esteplexogramavemosque los valores

máximosdel CA125 seproducenlos lunes,y en menor medidalos domingos.Los 513

datos,recogidosentreel 22 de Febreroy el 29 de Mayo de 1992, se agruparonen 7

clases,de 24 horascadaclase,correspondiéndosecadauna, conun díade la semana,

comenzandopor el domingo.

Estosmarcadores decrecimiento,hasta ahoraexclusivosde la especiehumana,

fuerondeterminadostambiénen diferentesespeciesanimales,en sueroy/o saliva.

Estosresultados aparecen en lagráfica26, juntocon los de otrasmujerescon cáncer

ginecológico, conovariospoliquisticos, sanasy con los de unhombre.

97

En la gráfica 27 se aprecia quelas concentracionesde CA125 y CA13O

salivaresestáncorrelacionadasde forma positiva con las séricas,y son mucho más

altas en el primer fluido, que en el segundo,en humana, siendo la relación

saliva/suero> 30 en personassanas;la relación en ratasfue de 1,76. Resultados

basados en3 muestrasde suerofrente a8 de saliva,y la relación envacasesde 1,58

(basadoen 14 muestrasde saliva frente a2 de suero),similar al observadoen ratas.

98

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102

TABLA 8: COMPARACION ENTRE LOS MARCADORES DE CRECIMIENTO,CA12S Y CA13O, EN UNA PACIENTE CON CANCER DE OVARIO PARA

DIFERENTES CONCENTRACIONES DE CA 125*

CA125(U/mí) N

Media+ES

CA 125(UImí) CA 130(UImI)200-300 7 264 + 7 200 + 16300-400 15 348 + 6 269 + 17400-500 16 453 + 7 332 + 16500-600 20 550 + 6 403 + 27600-700 13 641 ± 7 500 + 31700-800 11 750 + 9 512 + 40800-900 19 865 + 6 569 + 38900-1000 18 947 + 7 647 + 37

1000-2000 86 1471 + 32 984 + 312000-3000 57 2506 + 37 1607 + 653000-4000 51 3407 + 40 2244 + 884000-5000 27 4469 + 56 3252 + 2375000-6000 29 5540 + 53 3356 + 1576000-7000 18 6435 + 75 3912 -4- 1877000-8000 12 7302 + 75 4039 + 2428000-9000 18 8347 + 58 4713 + 2479000-10000 13 9534 ± 61 5076 + 417

> 10000 8 12846 + 906 6292 + 587

438 muestras de saliva sin estimular (sin enjuagarse la boca),de 1.992; N=n’> dedatos por clase; ES=error standard

recogidasentre el 6de Marzo y el 27 de Mayo

103

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Amplitud 854

Valor de P= 0,090

Porcentaje Ritmo = 21No. Pts. 23

Acrofase rn -89~ (05:57)

Gráfica 18

10 11 12 13 14Tiempo (Días de Abril, 1992)

111

Ritmo circadiano del CAl 30

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Valor de PPorcentaje Ritmo

No. Pta.

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Gráfica 20

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Gráfica 22

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115

Periodo, (Olas)

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Gráfica 23

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1 100 200 300Frecuencia (Ciclo por Año)

116

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cAl2S F = 20,810 (P <0,001)VAlSO F = 19,544 (P <0,001)

II}lESdeV7.500-

5.000-

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Gráfica 24

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MUJERES

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oEspecies

Numero deAnalísísSalivaISuero: 811 14/2 >250/>100

Gráfica 27

Rata yace Hombre

CC 10,92

120

EKiPERIMENTO 3: MOFASE CIRCATPJGINTANA ENTRE LA PRESION

SANGUíNEA Y LA FRECUENCIA CARDIACA

En la tabla 9, se resumenlas característicasde los ritmos circadiano y

circatrigintano (MESOR, amplitud y acrofase),acompañadasde sus límites de

confianzadel95%.Todoséstos,calculadosmedianteel métodocosenor,considerando

parael ritmo circadianolos datosoriginales(n= 8583) y parael circatrigintanolos 92

MESORescircadianos.

La tabla 10 muestralas característicasdel componentecircasemiseptano(3,5días),quese aprecia en lafrecuenciacardiaca,perono en ningunade lasvariablesde

la presión sanguínea(PAS, PAMy PAD).

La gráfica 28 obtenida medianteel método de los mínimos cuadrados,

representala evoluciónde la presión sanguíneasistólica,arterialmediay diastólica,

y de la frecuencia cardiaca,a lo largo de 3 mesesaproximadamente;y muestrala

curva coseno,de aproximadamente720 horas (1 mes), que mejor se ajusta a los

valoresde la PSy FC, enestecasolos MESOResqueseobtienende cadadía (cada

puntorepresentaun MESORcircadiano,considerandointervalosde 24 horasqueno

se superponen).Las líneasverticalessecorrespondencon el comienzode cadaciclo

menstrual.El eje de ordenadasrepresentael tiempo (mesesde 1992) y el eje de

ordenadasla presiónsanguínea(mm de Hg) y la frecuencia cardiaca(ppm).

El gráfico 29 nos proporciona unarepresentaciónpolar de los resultados

anteriormenteobtenidos en la gráfica 25. En la representaciónpolar circadiana

(derecha),se han empleadolos datosde unasemana.Se puede observar quese ha

tomadocomotiempode referenciala medianochelocal (00:00),por tanto 00 = 00:00

y 3600 24 horas.La banda oscurasecorrespondecon la duraciónde las horas de

sueño.Las elipsesde confianza(A, B, C y D), referentes a laPS y a la FC, están

localizadasen la mismazonade la circunferenciapolar,esdecir susacrofasesocurren

aproximadamentea las mismashoras.Las elipsesde confianzase superponen entre

121

sí, y al no encerrarel centro de la circunferencia,el ritmo es estadisticamente

significativo.

Al observarla representaciónpolardel ritmo circatrigintano,la circunferencia

equivale a 720 horas y 00 al primer día de un ciclo menstrual; se puedever la

diferenciaen gradosentrelas fasesde la PS (A, B y C) y de la FC (D).

122

TABLA 9: RELACIONES EN LA FASE CIRCADIANA Y CIIICATRIGINTANAENTRE LA PRESION SANGUNEA Y LA FRECUENCIA CARDIACA

EN UNA MUJER CLINICAMENTE SANA

Variable PR p MESOR±ES 2A+ES 4495%IC)

Componentecircadiano (datos originales; 17/04-28/07;n8583)

PASPAMPADFC

25,126,328,322,1

<0,001<0,001<0,001<0,001

107 0 + 0 182 0 + 0 163 9 + 0 178 3 + 0 1

19 4 + 0,418 8 + 0,415 0 + 0,218 8 + 0,4

~258Ó(~255,-260)-255~(-253, -257)~255O(~253,-257)~247o(~245,-250)

Componente circatrigintano (periodo: 720 horas; 17/04-28/07;n’92)

PASPAMPADFC

15,316,210,38,5

<0,001<0,001

0,0100,024

1070 +0482 9 + 0 364 5 + 0 379 2 + 0 4

4 8 + 1,24 0 + 1,02 4 + 0,83 6 + 1,2

~131o(40l,-160)~144o(416,-172)~170o(~132,-208)~292O(~245,-336)

¡‘AS: ?reuióruarterial aiatólic,u¡‘AM: PresiónarterialmediaPA)): Preuic5n arterialdiastólicaFC: FrecuenciacardiacaPR: Porcentajedel ritmo proporciónde la variacióntotal calculadaal ajustarcl modelop: Valor p de unu leaL de amplitud (12A: Doble amplituda: Acrofase (3ÓIY — duracióndcl periodoenhoraso dias; O> £Ú:Ú~ del primerdía dcmenstruaciónparalos componenlescireadianoy circatrigintano>ES: ErrorstandardIC: IntervalodeconfuanzaEl anílisis circatrigintanofué realizado enlos Ñ2 MI3SOReacircadianos

123

TABLA 10: COMPONENTE DE APROXIMADAMENTE 3,5 DíAS(CIRCASEMISEPTANO) EN LA FRECUENCIA CARDIACA DE UNA MUJER

CLINICAMENTE SANA

Variable PR p MESOR+ES 2A+ES 4495%IC)

PASPAMPADFC

0,61,50,8

10,3

0,9370,6440,8630,010

107,7 + 0 582,8 + 0464,5 + 0 379,2 + 0 4

0 5 + 1,31 0 + 1,10 4 + 0,83 9 + 1,3

~j39O

~162o

~106o

~197o(~158, -237)

PAS: Presión arterial sistólicaPAM: Presión arterial mediaPAD: Presión arterial diastólicaFC: Frecuencia cardiacaPR: Porcentaje del ritmo, proporción de la variación total calculadaal ajustar el modelop: Valor de p de un test de amplitud O2A: Doble amplitud~: Acrofase(3600= duración en horas del periodo;00 = 00:00 del 17 de Abril)ES: Error standardIC: Intervalo de confianzaEl análisis circatrigintano fié realizado en los 92 MESORes circadianos

124

Presion Sanguirlea <PS)

,5

5~• . 5

—0’•~• 5. 5 5

— ¡

eN55 •s

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.5

½ÑÁ•

Su

c-~.

Sistolica

Media Arterial

Diastolica

Frecuencia Cardiaca (FC>

Mayo

• ..5 5~

MESOR Diaria

(N 92)

JunioTiempo (Meses de 1992>

Acrofase ~e~95%I.C~~131 ( -92,.1440 (.107,.1700 (•118,.2920 (-226,

-169)

..202).358)

Gráfica 28

120

100 -

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clzE

O.0

80-

60-

A

90

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Abril Julio

SBPMAPDepMR

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126

DISCUSION

:

EXPERJMENTO 1 VARIA ClON CIRCAL)IANA DEL CORTISOL

El mayor glucocorticoide,producidopor la corteza adrenalde los conejos,es

el cortisol; la relaciónentrecorticosterona:cortisoles 1:20 (Ganjama aL, 1972).Esta

relación cambia hacia un exceso en la producción de cortisol bajo algunas

circunstancias;unade estases la acciónde estímulosexógenos,comoson, el manejo

o las repetidaspuncionesvenosasdel sangradoserialmentedependiente(Singh et al,

1975; Redgateel al., 1981; illera a aL, 1992).

El ritmo de los corticosteroides adrenalesde los mamíferos,fue descrito,

inespecíficamente,en los pionerosestudiosde Pincus,y más tardefue confirmada

medianteel empleo de distintos protocolospor otros autores,como Ganjamet al

(1972),Singhel al. (1975)y Sowersel aL (1981).Asimismo fueestudiadaendiferentes

especiesde laboratorioy principalmenteen la especiehumana porHalberg(1964),

Weitzmanel al. (1971), Aschoff (1979), Dalle el al. (1980), Fujieda el al. (1982) y

Garris (1986).Pero, pesea esto, la mayoríade las citasconsultadassuelenreferirse

a la existenciadeun granmargenqueoscila entre0,6 y 5,8 ng/dl (Depaoloy Masoro,

1989) y citan que por las mañanaslos valores son más altos. Como podemos

comprobar, nuestrosvalores de los conejos sangradosde forma serialmente

independiente, se encuentran dentrode esteamplio margen,no ocurriendolo mismo

conlos conejossangradosde formaserialmentedependiente.Estospresentanalgunos

valoresque sesalenfuera delmismo margen. Al indicar, estosautores, que porla

mañana presentanvaloresmásaltos,se nos presentala duda de, si es porla mañana

nuestra(es decir podríanser las6:00, las 7:0<), las 8:00, las 9:00 h) siendoestemargen

bastanteamplio (dependiendode la personaque recojala muestra);o bien si esla

mañanadel conejo,quese correspondecon nuestranoche,pues, como esde todos

conocido,los conejos(Oiyctolaguscuniculus)son animalesnocturnosal igual que ratas

y ratones,y además la mañanade los conejosdependeríade cuándoseenciendela

luz en cadaanimalario.

128

Halbergel al. (1981) realizaronestudiossobreel cortisol plasmáticoenmujeres

clínicamentesanas,describiendounaforma de la curva circadiana delcortisol, que

presentabaun pico principal por las mañanasy un segundo picopor las tardes.

Nuestrosresultadosconfirmanla existenciade estosdos picos,comoquedareflejado

en la tabla2, en la que podemos vercomo, tantoel componentede 24 horas comoel

de 12 horas,sonsignificativosestadísticamente;y al considerarlosde forma conjunta

obtenemosun valor p<0,001, tanto para los conejossangradosSD y SI, lo que

significa la aceptación dela existenciade un ritmo circadianocon un componente

circasemidianoque influye en la forma de la curva, de forma estadísticamente

significativa.

Ritmocñcadianoen el con’isolplasmáticode los conejos.

Los datos del cortisol, de todos los conejos,fueron analizadosmedianteel

empleo del método cosenorsimple, en un ciclo de luz dado y de acuerdocon un

esquemade obtención de muestrasdeterminado,revelando un ritmo circadiano

estadísticamentesignificativo entodoslos casos,bajo todoslos ciclos de luz:oscuridad

(LO) delestudioserialmentedependiente(SD) conunasignificaciónde p < 0,001;en

el experimento serialmente independiente(SI), los ciclos LO 14:10,LO 16:08 y LO

10:14 mostrabanunasignificaciónestadísticaconunap < 0,001 y, sin embargo,bajo

LO 12:12, la p= 0,002,y bajo 08:16, la p= 0,003 (tabla1).

El ajustede un modelocompuestopor dos componentes,con períodosde 24

y de 12 horas,mediante elmétodode los mínimoscuadrados,indica que ambosson

estadísticamentesignificativos (p < 0,001) para los animales alojados en los 5

diferentesfotoperiodos,tanto en el casode quelas muestrasseobtuviesende forma

serialmente dependiente,comoindependiente (tabla2).

El componente circasemidiano contribuye,de forma estadísticamente

significativa,a la forma de la curvadel ritmo circadianodelcortisol de los conejos(p

< 0,001, salvo en el régimen LO 10:14 del grupo SI, p= 0,029). La prominencia

relativa deestos dos componentes,circadianoy circasemidiano,va a diferir entre

129

conejossangradosde forma serialmentedependiente,y aquellos sangradosde forma

serialmente independiente; mientras queparalos primerosel componentede24 horas

es más prominente queel componentede 12 horas,paralos segundosel componente

circasemidianoes más notableo de la mismamagnitudqueel circadiano.Unanálisis

cosenode medias depoblación,aplicadoa lascaracterísticas(M, A, q, PR) delritmo

del cortisol delos conejosbajo los diferentesciclos de luz, revelaun ritmo circadiano

y circasemidianodepoblaciónestadísticanientesignificativo, enlos conejossangrados

de forma SD (r =24h: p~ 0,019 y r = 12 h: p= 0,028),pero no paralos sangradosSI,

aunquesu componente de12 horas es casi significativa, (p= 0,079) (tabla2). Estos

resultadosindican, que las caracteristicasdel ritmo circadiano del cortisol son

diferentes,dependiendode la forma de extraer las muestrassanguíneasen los

animales.

Obtención de muestras deforma serialmente dependiente (SD)o serialmente

independiente (SI).

Los MESORes,amplitudesy acrofasesdel ritmo circadianodel cortisol se

compararonentrelos conejossangradosSD y SI, de forma separadapara cadacilco

de luz (tabla 1).

De forma global, existeunagran diferencia encuantoal MESOR delcortisol,

los conejossangradosSI tienenmenorconcentraciónde cortisol,quelos sangradosSD

(p’CO,OOl, en todos los ciclos de luz), por tanto presentanMESOResmenores.

Se apreciatambiénuna diferenciaen la amplitud circadiana,los conejos

sangradosSI tienenuna menoramplitudsi los comparamosconlos conejossangrados

SD (pc 0,001para los conejos bajociclos de LO 12:12, LO 14:10 y LO 16:08; p=

0,068paraaquellosbajo un ciclo deLO 10:14 y p= 0,092 paralos conejosalojados

en LO 08:16). Como se puede ver enlas gráfica 1-5; unas altasconcentracionesde

cortisol,y unagranamplitud circadiana,caracterizan alos conejossangradosde forma

serialmentedependiente,en relaciónconaquellos sangradosde forma independiente.

130

Al compararlos valoresdel MESORdel cortisol de los conejossangradosSD

y SI, por parejas,medianteel t-test, aparece una diferenciade 3 2 + 0 6 ng/ml

(t=5,421; p= 0,006).Parala amplitud circadianaseencuentraunadiferenciasimilar,

siendo estade 32 + 0,9 ng/mI (t=3,671;p= 0,021).Sin embargo,cuandoexpresamos

la amplitud en relaciónal MESOR, la diferencia(25,1 ± 13,2%)no es significativa,

aunque estácasi enel límite (u= 1,902;p= 0,130).

En LO 10:14 y en LO 08:16, esdecir, en ciclos de luzcon una fotofracción

menor de12 horas,la amplitud circadianarelativa(A/M), del ritmo del cortisol fue

estadísticamentediferente, aunqueno de forma significativa, siendomayor en los

conejosSI que enlos SD; sin embargo,cuandolas amplitudesestánexpresadasen

unidadesoriginalessucedelo contrario (tabla1).

En resumen,seobservaun ritmo con aproximadamenteel mismo periodo en

cadaciclo de luz, y en ambosmétodos de obtención de muestras(SD y SI). El

sangradoSI estáasociadocon un MESORy una amplitud circadianadel cortisol

menores,si los comparamoscon los sangradosSD.

Relación entre la amplitud circadianadel cort¿voly la duración delperiodode lui

En los conejossangradosSD seobserva,quela regresiónlineal de la amplitud

circadianacon la duraciónde la fotofracción del ciclo de luz, es estadísticamente

significativa(R 0,642;p 0,005),gráfica8. Estosresultados provienende los análisis

individuales,en los que cadaconejoprovee unaestimaciónindividual de la amplitud.

En los conejossangradosde forma SI, no se encuentraunarelaciónsimilar entrela

amplitud circadianadel ritmo del cortisol y la fotofraccióndel régimende luz.

Estos resultados a lavez soninteresantes porque, enmujeres clínicamente

sanas,se vió quela amplitud circadianadel cortisol es mayor enprimaveray verano

(más horasde luz), que en otoño einvierno. Esta diferenciase hacemayor incluso,

si comparamosúnicamenteveranoe invierno (tabla3).

131

Comparaciónentre los diferentesregímenesde luz.

Muestreo serialmentedependiente.

Aunquelascomparacionessehayan hecho,tanto enbasea seriessimplescomo

en base a procedimientosdel método cosenor de medías de poblaciones,se

encontraronlos siguientes resultados:

El MESOR delcortisol esmayor en los conejosalojadosen un ciclo de LO

12:12,que enaquellos alojadosen otros ciclos (p< 0,050) y el MESOR delcortisol

de los conejosmantenidos en unrégimen de LO 08:16, es menor queel de los

alojadosen el restode los ciclos (p< 0,001).

La amplitud circadianadel cortisol de los conejossometidosa los ciclos LO

10:14 y LO 08:16,es menor quela amplitud de los conejosalojadosen otros ciclos

(p.c 0,020).La amplitud, en los conejoscon LO 08:16 esligeramentemenor quecon

LO 10:14 (p 0,018,medianteel testdepoblaciones).Cuando seexpresala amplitud

circadianaen relaciónal MESOR (% del MESOR),estasigue siendomayor en los

conejosalojadosenLO 14:10queen los conejosalojadosbajo otros ciclos (p.c 0,050,

exceptoparaLO 16:08).

La acrofase circadianadelcortisol de los conejosenLO 12:12ocurremás tarde

(p.c 0,020,medianteel test de poblaciones),mientrasquela acrofasedel cortisol en

los conejosmantenidosen LO 14:10ocurre más temprano(p.c 0,050) quela de los

conejosalojadosenotros regímenes.

Muestreo serialmente independiente.

Con estetipo demuestreoel MESORdel cortisol de los conejos,en LO 10:14,

es mayor queel de los conejosen LO 12:12 (p~ 0,035), el cual es, a su vez, mayor

queel MESOR delos conejossometidosa otros regímenesde luz (p.c 0,010).

132

En los conejosdel ciclo LO 10:14 seobserva unaamplitud circadianaalgo

mayor (pc 0,050), con respectoa los demás(exceptoparaLO 08:16). Cuandola

amplitud se expresaen relación al MESOR, no se encuentrandiferencias

estadisticamentesignificativasentrelos diferentes regímenesde luz.

Las diferenciasen laacrofase circadianadel cortisol, no son constantesentre

los conejossangradosde forma SD o SI. Los intervalosde confianzapara los conejos

sangradosSI, bajo diferentesciclos de LO, no se solapan(figura 3). Por lo que se

refiere a la dispersión de las acrofasesdel ritmo circadiano, en los diferentes

regímenesde luz de los conejossangradosde forma SD (gráfica9), ésta esmucho

menorsi la comparamoscon la dispersiónque existeen las acrofasesde un régimen

de luz a otro enlos conejosSI <gráfica10), aunque seelija comotiempo dereferencia

HAML u otros tiempos (HALO, HADO o HAMD). Existe la posibilidadde quelos

animales,alojados bajodiferentesregímenesde luz, fueran estudiadosen una etapa

diferente de otroritmo biológico, comopuedeser el circanual,el cual puedehaber

contribuido enlas diferenciasen acrofase. Estose podríaexplicar en posteriores

estudios,al confirmar unamodulación circanualde lascaracterísticascircadíanas,en

conejossangradossistemáticamenteendiferentes regímenesde luz, paracomprobar

cambiosconcomitantesa lo largo dela escalacircadiana, circaseptana(Uezonoct al.,

1984) y circanual.La existenciade estasvariaciones circanualesen el cortisol de un

grupo demujeresfue estudiada por Halberg(1991) y quedareflejado en la tabla3.

Los resultadosobtenidosennuestro estudiodemuestranla existenciadel ritmo

circadianodel cortisol plasmáticoen conejosNZW machos,sin quetengainfluencia,

en este ritmoendógeno, la forma de obtención de las muestras.También se

demuestrany cuantificanlos parámetrosdel ciclo adrenocortical enlos conejos,tanto

en los sangradosserialmentedependientecomo en los serialmenteindependiente.

Hallazgos similaresfueron descritosen ratones (Halbergy Visscher, 1950, 1952;

HalbergeraL, 1958, 1959))utilizando comoparámetroa estudiarlos eosinófilos,yen

rataspor Glick a aL (1961); en estoscasos, la relacióncorticosterona:cortisoles

inversa a la del conejo, puesto que enestos animales el mayor glucocorticoide

producido por la corteza adrenal,no es el cortisol, sinola corticosterona.

133

Una vez demostradala existencia del ritmo circadiano del cortisol,

comprobamosla influencia del fotoperiodo (tantode la fotofracción como de la

escotofracción)en las concentracionesde cortisol plasmático,dependiendodel tipo

de sangrado(SD y/o SI). La amplificacióndel ritmo circadiano,medianteregímenes

de luz con unamayor fotofracción,puede deberse, en parte, a unahiperproducción

de cortisol por partede la corteza adrenal estimuladapor el efecto dela luz, como

quedareflejado en la gráfica 8, en el que podemosobservarla existenciade una

correlación positiva(R= 0,642> entre laduraciónde lashorasde luz y la amplitud del

cortisol (p.c 0,001). Aunque anteriormentese llevaron a cabo estudiossobre este

tema,endiferentesespeciesde laboratorioy en seres humanos(Nichoisy Tyler, 1967;

Nichols y Chevins,1981; Fujiedaet al., 1982; Haenet al., 1984; Garris, 1986), se

encuentranmuy pocostrabajosde la influenciade los ciclos de luz-oscuridaden las

concentracionesde cortisol plasmáticoen los conejos(Sothernet al., 1978; Sotherny

Halberg, 1979). Observamosque a mayor duración de la fotofracción más

pronunciadoes el ritmo circadiano,produciéndoseel pico de las concentraciones

plasmáticasde cortisol antes delinicio del periodo deoscuridady la gran influencia

delperiodode luz enel descensode los dospicosdecortisol discutidosanteriormente.

Haciendoun breveresumende lo tratadoanteriormentepodemosdecir, que

se demuestrala existenciadel ritmo circadianodel cortisol, con participaciónde]

componentecircasemidianoen la forma de la curva, sobre todoen los conejos

sangradosde forma serialmenteindependiente.Estos a su vez presentanmenores

MESOResy amplitudesquelos sangradosde forma serialmente dependiente,lo que

nos indica una mayor síntesiso liberacióndel cortisol ante determinadosestímulos.

Tambiénestudiamosla influenciade la luz enel ritmo delcortisol,comprobandoque

en los animalesquesangrabamosde formadependiente,cuanto mayorerala duración

de la fotofracción, mayor era la amplitud; produciéndoselas acrofasesantesdel

periodode oscuridad.

Todoello nos conducea teneren cuenta,y utilizar, los diseñoscronobiológicos

a la horade investigarcualquier variablefisiológica,puesto queel conocerlos ritmos

biológicos (en este caso sincronizadospor el régimen de luz) de muchas de las

134

característicasde los animalesde laboratorio, puede ayudarnosa reducir la gran

variabilidadde las mediciones cuantitativasen los mismos(Wollnik, 1989).

135

:

EXPERIMENTO 2 MARCADORESDE CRECIMIENTO, CA125Y CA130

Cuando analizamos los 23 datos de los dos marcadores de crecimiento,CA1125

y CA13O (transformadosen logaritmos) procedentesdeunamujer clinicamentesana,

medianteun análisis de varianzade un sentido,se muestraun efecto deltiempo,

estadísticamentesignificativo, (CA125:F= 3,149;p= 0,034), (CA13O: F= 3,081;p=

0,037> (gráfica 15). Cuando los análisis se llevan a cabo en los datosexpresadosen

unidadesoriginales,el efectodel tiempoes casiestadísticamentesignificativo (CA125:

F= 2,395; p~ 0,081> (CA130: F= 2,230; p= 0,099) (gráfica 16); encontrándose

también unasignificación estadísticadudosa parael componentecircadiano, al

analizarlos 23 datosmedianteel métodocosenorsimple (gráficos 15 y 16). Unavez

que disponemosde másdatos,como en el caso del CA13O, determinadoen las 61

muestras recogidasentreel 10 y el 21 de Abril, los resultadosson estadísticamente

significativos(p.c0,001) tanto medianteANO VA, comomedianteel métodocosenor

simple (p’cO,OOl) (gráficos 17 y 18).

Parala obtencióndeestosgráficos,los datosfueronagrupadosunos conotros,

en unas24 horas“ideales’ y asignadosa6 clasesdiferentesde 4 horas,de acuerdocon

la hora deldía. Cuandose comparanlas variaciones circadianasdel CA125 y del

CA13O, se puede observar queentrelas 04:00 y las 08:00horas,y en menor medida

entrelas 08:00y las 12:00 horas,tanto el CA125 comoel CA130estánaumentados,

al compararloscon los valoresdel resto de las horas.

El ritmo circadiano de los marcadores decrecimiento CA12S y CA13O

encontradoenesta personasana,separeceal encontradoenuna pacientecon cáncer

de ovario (EH) (Cornélissenet aL, 1991), sibien conunaamplitud circadianamenor

y un considerablemenor MESOR enla primera.En las gráficas 12 y 13 se pueden

observarestasdiferencias,estadísticamentesignificativas, entre los MESORes de

sujetossanosy con cáncer,tanto cuandose calculaen valoresoriginales (t = 2,837,

136

p = 0,0 13) como en valores transformados en logaritmos (t 3,384, p= 0,004).

Anteriormente citamos la existencia de un ritmo circadiano, en ambos

marcadores de crecimiento, demostrandolo tanto mediante análisis de varianza como

mediante el método cosenor (gráficas 14 a 17 y tabla 5>. Cuando representamos la

curva coseno que mejor se adapta a los 23 datos de CA12S (gráfica 18) y la quemejor

se adaptaa los 61 datos del CA13O (de AP), medianteel método lineal de los

mínimos cuadrados,obtenemosdos curvascircadianasdeigualescaracterísticasa las

encontradas anteriormente.

Se puede apreciar, de forma casi invariable, que el pico de la concentración

salivar de CA13Oocurre por las mañanas. Pero cuando tratamos de ajustar una curva

coseno, a los 14 datos del marcador de crecimiento CA130, de otro sujeto (GC), la

curva que mejor se adapta es una circasemiseptana, Esto quizá esté en relación con

una histerectomia sufrida unos añosantes (gráfica 20). Estos ritmos están

representadoscomoespectrosde frecuenciaen elgráfico 21, dondeseapreciacómo

sobresalenlos ritmos predominantesde entre los demás.

La tabla4 esun resumen estadísticode las23 muestrasde CA125y de CAI3O

de una persona clínicamente sana, expresados en unidades originales y despuésdesu

transformación enlogaritmos,antes ydespuésdelenjuagadode la boca.En ella están

reflejados: la media, su error estándar, el valor mínimo y el máximo, y la mediana de

cadavariable. El CA125 presentamayoresconcentracionesque CA130, cuandose

recoge la saliva antes del enjuagado de la boca; pero cuandoestasdeterminaciones

sellevan a cabo en muestras recogidas despuésdel enjuagado, encontramosque las

concentracionesde CA13O son ligeramente superiores,quelas de CA125.

De nuevo, al observar detalladamente cómo varían las concentracionesde los

dos marcadores alo largo del día (tabla5), observamos que los valores totales o los

MESORes enlasseriesde 23 y en lasde 61 datos,el marcadorde crecimientoCA125

es,en general,mayorqueel CA130, en los datos originalesy en los transformadosen

logaritmos,al dividir las concentracionessegúnel momentocircadiano.

137

Si comparamos las medias del CA125 y del CA130, antes y después del

enjuagado de la boca, de AP, con los de otro sujeto sano (GC), se obtienen unas

diferencias estadísticamente significativas, tanto para el CA125 (AP, p = 0,003; GC,

pc 0,001), como para el CA13O(AP, p= 0,007; GC, pc 0,001) (gráfica 11). Por tanto,

las concentraciones de los marcadores de crecimiento son mayores antes de enjuagarse

la boca quedespués.

Otrohechoa destacar,esqueencontramosquelasconcentracionesde CA13O

eran menoresquelas de CA125, estoesopuestoa lo publicadopor Kobayashiet al.

(1991),dichosautores determinaronambosmarcadores endiferentestejidos,asícomo

en fluidos, como amnios,corion, placentay líquido amniótico, para estudiar la

relaciónexistenteentreel CA12Sy el CAI3O. El coeficientede correlación(de 0,987)

entrelos dos marcadores,dadopor estosautores,seobtieneenasociacióna la recta

de regresión:

Y = 377,7+ 0,969X

dónde Y representala concentraciónde] CAI3O en U/ml y X representala

concentraciónde CA125, también enU/ml. Cuando usamos estaecuaciónpara

deducirlosvaloresrelativosde los dosmarcadores,seesperaríaqueel CABO tuviese

concentracionesmás altas queel CA125, pero nuestrosresultadosindicaban lo

contrario.

Resultó entonces interesante investigar otrasseriestemporales,paracomprobar

si el CAI3O era menor queel CA12S salivares,de forma consistente,o bien las

diferencias encontradasse debían a unamera variación interindividual. Al

comprobarlo,conotrossujetos,seencontróqueel CA13Oeraconsistentementemenor

queel CA125, tanto ensalivarecogidasin estimular,comoen la recogida despuésdel

enjuagadode la boca, comoquedareflejadoen la tabla 6; únicamenteen el casode

AP, cuando se recoge la saliva despuésde enjuaguarsela boca, el CA130 es

ligeramentemásalto queel CA125.

138

Al analizar las concentracionespor espaciosde tiempo, se encontróque la

diferenciaentreestosdos marcadoresesmayor, cuandolasconcentracionesson más

altas durante la noche y menor cuando las concentraciones sonmáspequeñas (tabla

7). Al comprobar si las diferencias estaban en función de las concentraciones de los

marcadores,vemos quede nuevoel CA13Oes consistentemente menor queel CA125

(tabla8).

Se compararonentresilos marcadoresCA13O y CA125 séricosde lamisma

paciente con cáncer de ovario, y comprobamos que la diferencia de 238±47U/ml era

estadísticamente significativa en una prueba (test) t por parejas (t = 5,082;p = 0,001)

y guardan relación con los resultados obtenidos en la saliva.

Podemos asumir, que el CA13O, tanto de sujetos sanos como con cáncer, tiene

menores concentraciones al compararlo con el CA125 y estos dos presentan un ritmo

circadiano con similares características entre sí, y con los de una paciente con

adenocarcinoma que envuelve el ovario. Esta prominente variación circadiana,que

caracteriza ambos marcadores, se debe tener en cuenta a la hora de establecerlos

críticos momentos de recogida de muestras, tanto satguíneas como de saliva,

especificadosen el tiempo, así como al instaurarun tratamientoterapéutico,para

determinar en quemomento exacto del día se deben administrar los fármacos

(Halberg, 1983).

Chenet al., en 1990 propusieronun valor límite de 3000 U/ml parael CA125

salivar,recogidopor la mañanay despuésde uncuidadoso enjuagadode boca.Esta

estipulación,usar el valor de la mañanadespuésdel enjuagado,es un paso en la

dirección correcta. Aunque, si se refiriese al momento de levantarse,sería una

especificaciónen el tiempo más precisa,y reduciríaciertas dudasrelacionadascon el

momentodeacostarse;por ejemplo,enun trabajador concambiode turnode trabajo.

Estaconsideraciónsólotendríasentido,cuandolasdeterminacionessehiciesenen las

muestras recogidas en el momento de levantarse,puessi lo hiciésemosen muestras

recogidas sobre la 13:00 horas, no detectaríamos ningún paciente con cáncer, y es

cuandolas concentracionesde los marcadoresde crecimientoson mínimas.Aunque

139

queda demostrado quelos MESOResde CA125y deCA130sonmayoresen pacientes

con tumores, que en individuos sanos.

Aparte de todo lo citado con anterioridad sobre el ritmo circadiano de los

marcadores de crecimiento, éstos quedan patentes en los espectros de frecuencia

(gráficas 22 y 23), en los que, aparte del ritmo circadiano (p.c 0,001), podemos

observar el resto de los componentes de cada cronoma: el CA12S tiene además un

componente circaseptano (p = 0,003) y circavigintano (p < 0,001), en el CA13O no se

observan estos componentes, sino un circanual y uno circadiseptano (p = 0,002, para

ambos) y un componente de 7,6 días (p=O, 009), pero no de 7 días. Hasta ahora se

conocen escasos cronomas completos, el más estudiado ha sido el de la presión

sanguínea y el de la frecuencia cardiaca, encontrando en éstos un componente

circadiano (el más estudiado), ultradianos y también infradianos, pero ésta esla

primera descripción detallada de los distintos componentes del cronoma de los

marcadores decrecimientoCAI2S y CA13O, anteriormente había sido descrito con

másdetallesólo el circadiano(Halberga al., 1992; Xu et al., 1992)

Tras determinarlos componentesdel cronomadeambosmarcadores,quisimos

estudiar conmayorprecisión,el componentecircadianoy paraello representamoslos

datosdel CA125y del CAI3O (EH) enun plexogramacircadianode24 clases.Estos

plexogramas nos dan unaaproximaciónde la evoluciónde dichosmarcadores,a lo

largo del día, así como de las concentracionesaproximadasen cada hora(clase),

gráfica24. Los valoresmáximosse producenentrelas 06:00y las 07:00 horas,como

se ha descrito anteriormente para las 23 muestrasde saliva deun sujetoclínicamente

sano (AP>, cuyos máximos valores se alcanzaban entre las 04:00 y las 08:00 h, al ser

las clases de 4 horas. Observamos que ambos marcadorespresentanun ritmo

circadiano muy similar, demostradoestadísticamente,tanto medianteANOVA como

por el método cosenor (CA125: F=20,810, 2A=5347, p.c 0,001 y CAI3O: F=19,544,

2A=3242,p.c 0,001)

En resumen,de todos los análisis macroscópicosy microscópicosanteriores,

se deduceque,losmarcadoresdecrecimiento,CA125 y CAI3O, tanto de sujetossanos

140

como de pacientes con tumoresováricos, presentanun ritmo circadiano de gran

amplitud y quesiguenpatronessimilares,cuya acrofaseselocalizaentre..600 y ~8Oo,

aunque con diferencias en cuanto a amplitud y MESOR.

El componentecircaseptanodelCA125,que juntoconel circadianocaracteriza

el cronoma de EH, se puede observar representado mediante un plexograma en la

gráfica 25, en el que, los mayores valorespredeciblesse producenlos lunes.Este

ritmo es detectadocuando los datos se analizan mediante el método cosenor

(2A= 1195;p= 0,017),y medianteel análisisdevarianza,empleadoen el plexograma

(F=2,594;p= 0,017).

Estosmarcadoresde crecimiento,hastaahoraconsideradoscomomarcadores

tumoralesdel crecimientode tumoresrelacionadosconel aparatoreproductorde las

mujeres,han sido determinadostambién enel suero de unhombrey en diferentes

especiesanimales (sanos),tantoensalivacomoensuero(exceptoenel ratón) (gráfica

26). Por tanto no son exclusivosde la mujer, tampocodel género humanoy no

deberíandenominarse marcadorestumorales,sino marcadoresde crecimiento.

De los resultados obtenidos en animales, y en los seres humanos,se puede

apreciar que las concentraciones de CA125 y CA13O salivares estan correlacionadas

de forma positiva con las séricas; en la especie humana, son mucho más altas en el

primer fluido queen el segundo, siendo la relación saliva/suero > 30, en personas

sanas;la relación encontrada en ratas fuede 1,76, resultadosbasadosen 3 muestras

de suerofrente a8 de saliva y la relación hallada envacasesde 1,58 (basado en14

muestrasde saliva frente a2 de suero).

Pero, en la actualidad, es muy difícil de explicar por qué enun individuo

aparentemente sano, el CAI3O no presenta un ritmo circadiano (p 0,442) sino que

éstees reemplazado porritmo de 3,5 días o circasemiseptano(p.c 0,001), quizá esto

esté relacionadocon la histerectomíasufrida 8 años antes.Tampoco existe, en la

actualidad,unaposible explicaciónde por quéel CA125 deuna pacientecon cáncer

presentaun ritmo de 7 díasexacto (p=0,OO3),mientrasque el CA13O muestraun

ritmo, estadísticamentesignificativo, con un periodo que difierede los 7 díasexactos

141

(r =7,6; p=0,0O9). Algún día esperamos poder encontrar la solución a todas estas

dudas y a otras muchas de las que se plantean actualmente, como es la posible

prevención de esta enfermedad o, si ésta no es posible, una temprana detección del

cáncer, mediante el control de algunos de los parámetros empleados en la

cronobiología.

142

EXPERIMENTO s: Ah OEASE CIRCATRIGINTANA ENTRE PRESION

SANGUíNEA Y FRECUENCIA CARDIACA

Anteriormente hablábamos de la posible prevención de algunas enfermedades

como el cáncer; otras de las enfermedades“actuales’ son las relacionadas con el

corazóny con la presión sanguínea;por esocuanto más podamosconoceracerca de

estas variables antes podremos dar una solución a estos problemas y evitar al mismo

tiempo fallos humanos, comolos cometidosal administrar unfármacoquedisminuye

la tensión a pacientes diagnosticados como hipertensos, y que realmente no lo son,

únicamente porque fueron al médico, a medirse la presión sanguínea durante la

consulta de la tarde (cuando la presión sanguínea y la frecuencia cardiaca presentan

susvaloresmáximos>(Cornélissenet al., 1990).

Ambas variables (PS y FC) presentan un ritmo circadiano, (p <0,0010),y se

encuentransincronizadasen fase(isofase),a lo largo de la escala circadiana; es decir,

se puede considerarque a lo largo de la escalacircadianadel tiempo, tanto la PS

como la FC presentansus máximosvalores,aproximadamentea las mismashoras,

entrelas 17:00y las 18:00horas (tabla8); por ejemplo,los valoresde la FCen un día

puedenoscilar, desdeunosvaloresmínimospredecibles (batifase)de 60 pulsaciones

por minuto (ppm>a las6:00 de la madrugada,hastaunosvaloresmáximospredecibles

o acrofasede 97 ppm a las 18:00 horas,sin queello presupongapeligro algunopara

la salud.

Este ritmo circadiano fue demostrado,medianteel método cosenor, por

Halberg(Halberga’ al., 1980; Halberg a’ al., 1988), y ampliamenteestudiado porél

y el grupo internacional que con él colabora (Cornélissen et al., 1992; Kumagaia’ al.,

1992; Wrbsky et aL, 1992), demostrando la existencia de éste y de otros ritmos, en

cientos de personas; este ritmo está amplia y detalladamente reflejado en esta

investigación.

Con las evidenciasque nos proporcionanlos resultados(gráficas 28 y 29),

sirvenparaconfirmar la afirmación de quela frecuencia cardiaca(FC) y la presión

143

sanguínea(PS) presentanvariacionesparalelas;asícomoestaconsideraciónesválida

en lo referente al ritmo circadiano, no puede hacerse extensiva al ritmo

circatrigintano.

Al hacer referencia al ciclo circatrigintano (de aproximadamente 30 días)

(Kawasaki et al., 1978), con unos valores de p <0,001 para PASy PAM, p = 0,010para

PAD y p = 0,024 en FC, vemos que la presión sanguínea y la frecuencia cardiaca se

encuentran en alofase circatrigintana, es decir, se observa una gran diferencia en fase

(de aproximadamente 1500) entre las dos variablescuandoconsideramosun periodo

arbitrariode 30días(720 horas),para realizarel análisis(tabla8).

Por tanto, en el transcurso de unmes (aproximadamente30 días), en el

momentoen que la PS alcanzasusvalorespredeciblesmásaltos, los de la FC son

mínimos. Esto se puedeobservar, tantosi ajustamosuna curva coseno a los 92

MESORescircadianos(n= 92) (figura 28), y en la Tabla 8; en la que al observarel

componente circatrigintano se aprecia que las acrofasesde la PS estánrelacionadas

entre sí, pero en alofase respecto de la FC. Esto no ha podido ser consultado con

otros autores, pues no se han encontrado citas al respecto. A diferencia de esto, en

dicha tabla, podemos comprobarque la PAS, la PAM y la FAO, siguenel mismo

patrón circadianoque la FC, alcanzandolos valores máximos a] mismo tiempo;

quedando reflejado, tanto en la gráfica 28 como en la gráfica 29.

La gráfica 29 nos proporciona una representación polar de los resultados;

circadiana a la derecha y circatrigintana a la izquierda. En la circadiana, las elipses de

confianza (A, B, C y O) referentes a la PS y la FC, se localizan en la misma zona de

la circunferenciapolar, es decirsusacrofasesocurrenenaproximadamentelasmismas

horas,las elipsessesuperponenentresí y no encierranel centrode lacircunferencia,

lo quesignificaqueel ritmo esestadísticamentesignificativo.En la representacióndel

componente circatrigintano (izquierda), en la cual 3600 720 horas, las elipses de

confianzade la PS ( PAS, PAM, PAD; A, B y C respectivamente) se superponen

presentando una relación entre fases, estando la FC casi en antifase respecto de la PS

(O).

144

Los MESOResde la presiónsanguíneay de la frecuencia cardiaca,circadiano

y circatrigintano,son aproximadamentelos mismos(tabla 8). Como el componente

circadianoes más prominente queel circatrigintano, existirá una mayor variación

predecible en laPSy FCcircadianas,con amplitudesde aproximadamente10 mm de

Hg, por tanto,lasvariacionesdiariastotales seránde ± 20mm de Hg, mientrasque

a lo largo del messólose aprecianvariacionescircatrigintanasmáximasde ± 5 mm

de Hg. Estos datospuedenservirparadar unaexplicaciónde la gran variabilidadde

la PS y FC, como hemoscomprobado(tabla 9).

También se demostró un componente de aproximadamente84 horas

(circasemiseptano) en la FC (p = 0,010), pero no en la PS (p >0,05) (tabla 9), lo que

apoyala teoríade la existenciade ciertadisociaciónentrela presión sanguíneay la

frecuenciacardiaca, lo que podríaayudarnosa ponersolución a los problemas

cardíacos,en .un futuro no muy lejano.

145

CONCLUSIONES

Unavez analizadoslos resultados obtenidosennuestroestudio,podemos sacar

deellos las siguientes conclusiones:

IP CONCLUSION:

2~ CONCLUSION:

3~

43 CONCLUSION:

CONCLUSION FINAL

Existe un ritmo circadiano endógeno, con dos

componentes (circadiano y circasemidiano), del cortisol

plasmático en conejos NZW, cuya acrofase está

sincronizadapor el ciclo de luz-oscuridad.

Se define el cronomade los marcadores decrecimiento

salivares,CA12Sy CA13O.Estefluido biológicopuedeser

unaalternativa alas extraccionesquese realizanparael

control de crecimientode los tumores.

Se demuestra la existencia de los marcadores de

crecimiento en personas sanas, hecho hasta ahora

desconocido.El ritmo circadiano es similar al de las

personascon cáncer,con unaacrofaseentrelas 04:00y

05:00 de la mañana,y con una amplitud y MESOR

mayores.

Sedemuestra laexistenciadeunaalofaseinfradiana,pero

no circadiana, entre la frecuencia cardiaca y la presión

sanguinea.

El empleode la cronofis¡ologíase recomiendaen

cualquier estudio experimental, con el objeto de

reducir la gran variabilidad de márgenes, hasta

ahora existentes en los parámetros fisológicos. Por

lo que se aconseja un diseño experimental

cronofisiológicopara llevar acabo correctamente

un protocolo de investigación.

147

GLOSARIO

Acrofase (0):

Distanciaquehaydesdeun tiempode referenciadado(comopuede ser

la medianoche o el despertar), hasta el momento en que se producen los

valores máximos de un ritmo (pico), definida mediante una función

matemática ajustada a los datos. La acrofase se expresa en grados

(negativos), donde 3600 equivalen al periodo elegido (circadiano,

circaseptano,etc.) y setoma 00 comotiempo de referencia.En el caso

de los ritmos circadianos,cuandose elige 0~ como la medianoche, la

acrofasetambién se puedeexpresaren horasy minutos.

Camputativa (t):

Externa ( ):

Interna (e):

acrofasereferida a una fecha y hora de reloj

arbitrarias fisiológicamente, por ejemplo, la

medianoche local.

el tiempo de referenciaes un punto enun ciclo

ambiental sincronizante, por ejemplo, la mitad del

intervalo de oscuridad.

acrofase referidaa la acrofasede otroritmo conel

mismo periodo enla misma unidadfisiológica.

Mofase:

Se dice que dos variables están en alofase en un periodo dado, cuando

sus acrofasesson estadísticamentediferentesuna dela otra, de forma

significativa.

Amplitud (A):

La mitad del cambio rítmico predecible que se produce en un ciclo

estimado mediante una función (sinusoidal u otra). En una curva coseno

es la diferencia quehaydesdeel pico de la curvahastael MESOR.El

cambio total predecible es la doble amplitud (2A).

149

Antifase:

Grandiferencia,deaproximadamentela mitad deun ciclo (1800 ± 15’),

en la localizacióntemporal(acrofaseu ortofase)de dos ritmos con el

mismo periodo.

Armónico:

Cualquier función periódica, con un periodo dado (r) se puede

considerarcomo la suma de un término constante(MESOR) y de

funcionescosinusoidalescon periodosr, r/2, r/3, etc., conamplitudes

y acrofasesdadas.El componentecon un periodo r es el armónico

fundamentalo armónicodeprimer orden;el componentecon r /n es el

armónicoeneavo,donden=2, 3, etc.

B¡oaliasing:

Ambigíledado erróneainterpretaciónde uno o máscomponentesde]

periodo t~, en las seriestemporales asociadasa intervalosun poco

largos entre muestrasconsecutivasy separadas enel tiempo por

intervalosiguales( t =r/2); por ejemplo, simulaciónde un ritmo o

tendencia,que resultadel inapropiadomuestreode un ritmo oculto de

alta frecuenciay másgeneralmente,todoslos productosresultantesde

unadensidadde muestreo,insuficientepara detectarlas características

(cambianteso estacionarias)de los ritmos (acrofase,amplitud,forma de

la onda o frecuencia).

Bioperiodicidad:

Ciclos ocultos,aunquesepresuponesu existencia.

150

Bisincronizacién:

Sincronización debida a dos factores, por ejemplo, dos factores

ambientales,comopuedenser la alternanciade luz y oscuridad,y la

disponibilidado no decomida.Por estomismotri- o multisincronización

puede significar sincronización por tres o más factores(incluyendo,p.e.,

los fármacos).

Características de un ritmo:

Parámetros cuantificables objetivamente, comoson el periodo (r), la

acrofase(~), la amplitud (A) y el MESOR (M), determinadosmediante

deducciones estadísticasal ajustar una función matemática mediante

aproximaciones.

Ciclo:

Conjunto de estados consecutivos y/o cambios específicoso

acontecimientos que se repiten regularmentede una forma

fisiológicamentecompleta,con unafrecuencia reconocibleo con un

periodo quese repite enel tiempo.

Circadiano:

Término que deriva del latín circa (= aproximadamente) y dies (= día ó

24 horas), relacionado con ritmos o variaciones biológicas, conuna

frecuencia de aproximadamente un ciclo en 24 horas, r = 24 + 4

horas.

Cron:

Elemento particulardentrodelcronoma,comosonlascaracterísticasde

un ritmo.

151

Cronobiologia:

Cienciaque cuantificae investigaobjetivamentelos mecanismosde la

estructuratemporalbiológica(cronoma),incluyendolasmanifestaciones

rítmicasde la vida. Neologismoqueprovienede los términos:chronos

(=tiempo),bio (=vida) y logie (= ciencia). Diseñada para describir las

característicasde los ritmos; en términos fisiológicos, proporciona

conceptosde aplicacióngeneraly técnicaspara resolver(observary

cuantificar),problemasreferentesal estudiode los ciclos predeciblesen

los organismosy, paraaislar los efectosambientales,de los mecanismos

endógenospropiosque estánenmascarados.

Cronodesmo:

Intervalo de referencia especificadoen el tiempo y respecto del

momento del ritmo.

Cronofarmacologla:

Debe entendersecomola aproximación cronobiológicaa los fenómenos

farmacológicos(una metodologíacronobiológicaenvuelveun menor

riesgo de error y/o falsa información, que el método homeostático

convencional).

Cronofisiología:

Estudia las manifestaciones temporales de los procesos fisiológicos,

evahia las interaccionescíclicas biológicas (endocrinas, nerviosas,

metabólicas, etc.) con el organismo, el cual sirve de base a las

características biológicas temporales y a la interacción de éstas con el

medio ambiente.

Cronograma:

Representacióngráfica de los datosde forma individual o en conjunto

en función del tiempo, haciendo que la ritmicidad sea fácilmente

reconocida.

152

Cronoma:

Neologismoque proviene de chronos (= tiempo), nomos (= regla) y

cromosoma.Se define como la estructura temporal delas variableso

sistemas biológicos, que se resuelven como aproximaciones, mediante

parámetrosdeducidosestadísticamente(crones)y resuelto conla ayuda

de ordenadores, enlas seriestemporalesde datos. El cronomaestá

codificado genéticamentey estásincronizadoambientalmentepor los

ciclos del hábitat socioecológico;estáinfluido por la dinámica delos

campos magnéticosinterplanetariosy puede alterarse porprocesos

endógenos(como son, la elevación del riesgo de enfermedado

cualquier patología),o también por factores externos, comoson,

cambios en los hábitos sociales o en los horarios habituales,

administración de fármacos y por el medio ambiente. La cronobiología

se encarga delestudiode laspropiedadespredecibles a]gorítmicamente

y del significadobiológico de] cronoma.

Cronopatología:

Estudia las alteraciones de las características biológicas temporales

como causantes,resultantes o concomitantesde los estados de

enfermedad (endocrinopatías,cáncer, alteración de la presión

sanguínea, por citar algunas).

Cronoterapia:

Tratamiento terapéuticoefectuado, teniendo encuentalos factores

temporalesy enparticularlos ritmos.

Cronotolerancia:

Momentos predecibles,con una significaciónestadísticamásalta de la

normal, en los que se presenta resistencia a los tratamientos psico -

químicos u otros, sin mostrar un efecto desfavorable, debidoa los

diferentes tiemposde su administración.

153

Cronotoxicologla:

Se encarga de ladescripciónde los efectosno deseadoso nocivosde los

agentesquímicos, físicos o de otra naturaleza (incluyendo una

sobredosificación)en las característicasbiológicas temporalesy en

función del tiempo biológico.

Curso libre:

Cuandounabioperiodicidadcontinúa consufrecuencianatural,aunque

estébajo unascondicionesambientalesfijadas(porejemplo,condiciones

constanteso cíclicas de24 horas), porlo general,ligeramentedistinto

de cualquierfactor ambientalconocido.

Deriva de la acrofase:

Desplazamiento gradualy continuo de la acrofasede un ritmo, a lo

largo de la escala del tiempo, con un periodo que difiere ligeramente al

del ciclo de referencia.

Descensoo valle (momentode):

El punto o lospuntos más bajos del modelocompletorecurrente de una

variable.

Desincronización:

Se dice que dos variables están desincronizadas, si difieren

estadisticamentede forma significativa en su frecuenciao en su acrofase

(desincronización en frecuencia o acrofase), habiendo estado

sincronizadaspreviamente.

Externa: cuando un ritmo biológico sedesincroniza respectoa un

ciclo ambiental.

Interna: cuando dos o más ritmos biológicos de la misma unidad

fisiológica, se desincronizan el uno respecto del otro.

154

Dominio del espectro:

Subdivisión del amplio espectrode ritmos

circadianoso infradianos) o exhibición de

ritmos a lo largo de la escalade frecuencias,

escala deltiempo.

fisiológicos (ultradianos,

las característicasde los

en vez de a lo largo de la

Elipse de confianza:

Ver Regiónde confianza.

Fase:

Ver Acrofase.

Forma de la curva (W):

Patróncompletode unavariación periódica.

Frecuencia (f):

Es el número devecesqueocurreun tipo deacontecimientodado,o el

número demiembrosde una poblaciónque se encuentrandentrode

una determinadaclase.En el estudio de las bioperiodicidades,es el

número de ciclos que ocurren porunidad de tiempo, es decir, el

recíprocodel periodo(i).

1

7-

Harbinger:

Acontecimiento o cambio de algunade las característicasdel ritmo,

previo al desarrollo de una alteración o enfermedad.

Infradiano:

Relativo a variacionesbiológicas o ritmos con un periodo superioral

circadiano,~ > 28 horas, vamosa ennumeraralgunosde ellos:

155

veinte días,

Circasemiseptanoo de aproximadamente media semana,

r = 3,5 ± 1 día

Circaseptano o de aproximadamente una semana,

r = 7 + 1 5 días

Circavigintanoo de aproximadamente

r = 21 ±3 días

Circatrigintanoo de aproximadamenteun mes,

T = 30 ±5 días

Circanualo deaproximadamenteun año,

r = 1 ±2 meses

Circasepteniano o de aproximadamente sieteaños,

r = 7 ± 1 año

confianza (IC):

Intervalodeducidoestadísticamenteparaunsoloparámetroinvestigado.

La afirmación de que un parámetro dado estádentro de esteintervalo,

será cierta en la mayoría de los casos,con una proporciónde 1 - a (1

menosa) de los casosanalizados,cuandosefija la probabilidada (p.e.,

0,05), enbasea la cual sehace estaafirmación.

referencia:

Margen de va]ores que se espera que contengan un numero específico

o unaproporciónde lasobservaciones futuras,tambiénsellama margen

normal, intervalo de predicción o intervalo de tolerancia. Ver

cronodesmo.

Sedice que dosvariables seencuentran en isofaseen un periodo dado,

cuando sus acrofases u ortofases son similares (±150) y no son

significativamentediferentes.

Intervalo de

Intervalo de

Isofase:

156

Límites de

Límites de

confianza:

Los valoresmás bajoy másalto queconstituyenlos límites del intervalo

de confianza.

tolerancia:

A diferencia de los límites de confianza, los limites de tolerancia son

valores que limitan dentro de los cuales caerá, con una probabilidad fija

(1 menos a), una proporción específica de una distribución. Dichos

límites pueden ser usados para decidir, si unas determinadas

observacionesprovienen de la misma población analizadacon

anterioridady usadaparadeterminarlos límites. En cronobiologíase

llama cronodesmo.

MESORAcrónimo de “Midline Estimating Statisticof Rhythm”. Valor mediode

una función rítmica (curva coseno) ajustada a los datos de una serie

temporal, normalmentees el puntomedioentrelos picosy descensode

la curva coseno. Es una media ajustada al ritmo.

Movimiento de la acrofase:

Desplazamiento relativamente sencillo, abrupto o gradual, aunque

transitorio,de la acrofasede un ritmo en relación aun ciclo dado,a lo

largo de la escala deltiempoy que tienelugar duranteun determinado

espaciode tiempo.

Ortofase:

Distanciadesde undeterminadopunto dereferenciaen eltiempo,hasta

el pico de la función no sinusal (múltiples componentes), aproximada

a un ritmo estimado de forma apropiada, que resulta al ajustar un

modelo que consiste en la combinación de dos o más armónicos.

157

Periodo (P):

La duración de un ciclo completo en una variación rítmica.

Pico (momento del):

Instante en el que se producen los máximos valores de un modelo

completo, expresadoa lo largo de la escala deltiempo. Momento en el

que el ritmo alcanzasu máximo.

Porcentaje del ritmo (PR):

Porcentaje de variabilidad explicadapor un modelo ajustado.

PR = VR x 100

Proporción de variabilidad (VR):

Es la parte útil de la señal (p.e.,del ritmo), calculado como la fracción

de la variabilidad total producida por la curva ajustada.

Referencia de la acrofase:

Punto en el tiempo, que se toma como referenciapara la estimaciónde

una acrofase.

Régimen de luz:

Aiternancia entre luz y/u oscuridad (LO), a la cual se expone un

organismo.

Región de confianza:

Generalización delintervalo de confianza, en el

consideren dos o más parámetros. Es la región en el

le correspondela probabilidad1 - a (1 menosa), de

estédentrode ella.

caso en que se

espacio a lacual

que el parámetro

158

Ritmo:

Cronobiológicamentedefinido, es lacomponenteperiódica predecible

de las series temporales biológicas, demostrada mediante medias

deducidas estadísticamente,preferiblemente mediantecaracterísticas

objetivamentecuantificables(es decir,frecuencia,acrofase, amplitud,

MESOR y/o forma de la onda).

Ritmo de referencia:

El ritmo de una variable usado como tiempo de referencia para otros

ritmos, acontecimientoso acciones.

Ritmometría:

Descripciónde un ritmo mediante pruebasde hipótesis definidas

estadísticamentey la estimaciónde suscaracterísticas,como: MESOR,

amplitud, acrofase, ortofase y/o periodo. La aplicación de la

cronobiologíasebasa,fundamentalmente,en la evaluación cuantitativa

de los datos recogidos en función del tiempo, mediante estos métodos

(ritmometría deducidaestadísticamente)y con una adecuadabasede

datos.

Secciónen seriecronobiológica:

Métodográficoy analítico.Se obtieneajustandounacurvacosenoa los

datos en cadasecciónde datos,solapadoso no, y desplazándolaen

incrementos a través de las series de tiempo. Este procedimiento

proporcionala estimaciónde los parámetrosdel ritmo (M, A, ~), los

valoresde la p (parael rechazoo aceptacióndel ritmo, asumiendola

hipótesisnula; A = 0) y el númerode datos porintervalo, los cuales

aparecen representados enparaleloconlos datos originales.

159

Series temporales:

Secuencias cronobiológicasde valoresparejos,uno de los cualesesel

tiempoy el otrounacaracterísticacuantitativadeun individuoo de una

población,en el tiempo considerado.

Sincronización:

Estado de unsistema, cuando dos o más variables muestran

periodicidades con la misma frecuencia y acrofases específicas, y/o con

frecuenciasqueson múltiplosenteroso submúltiplosde otra.

Sincronizador:

También llamadozeirbeger,es la periodicidadambientalque determina

la posición temporal de un ritmo biológico dado, a lo largo de una

apropiadaescalatemporal,obligandoal ritmo asincronizarse,esdecir,

a asumir su frecuencia, o un múltiplo entero o submúltiplo de su

frecuenciay unaacrofase específica.

Ultradiano:

Ritmo con un periodomenorde 20 horas,r c 20 h. Algunos ejemplos

de estos ritmos son:

Circaoctohorano o de aproximadamente ocho horas,

= 8 ± 1,5 horas

Circasemidiano o aproximadamentemedio día,

r = 12 ± 2 horas

Ventana cronobiolégica:

Estimaciónde cualquierade las característicasde un ritmo, en función

de los periodos de interés en regiones o dominios espectrales, mediante

la aplicaciónde losprocedimientosdel cosenorsimple,no sólamenteen

un sólo periodo fijado, sino en un conjunto de supuestosperiodosy

disminuciones entre periodosconsecutivos, ajustados mediante la

160

ritmometría de los mínimos cuadrados. Se puede aplicar cuando se

desconoceel periodode un ritmo biológico, pero seasumeque está

dentro de un cierto margen.

Zeitbeger:

Neologismoque provienede los términos alemanesZeit (= dador)y

beger(= tiempo),dador detiempo.Ver Sinctonizador.

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