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Universidad de Costa Rica Arabela Vega Aguilar Escuela de Agronomía Carné: A76908
Reguladores de crecimiento Noviembre 23 2011AF-5402
Efecto del 2,4-D y AIA en callogénesis de zanahoria ( Daucus carota )
Resumen
Se estudió el rol de dos auxinas, 2,4D y AIA en el establecimiento de callos a partir
de tejidos de raíz de zanahoria (Daucus carota) con el fin realizar una curva de
crecimiento. Se probaron dos protocolos distintos. El primero consistió en 10
repeticiones de un explante por frasco compuestos de cambium sobre MS
complementado con 1ppm de AIA y 1ppm de 2,4D bajo condiciones de día largo a
28°C donde se hicieron observaciones frecuentes y se midió el peso semanalmente. El
segundo protocolo consistió de 10 repeticiones por tratamiento de 1ppm de AIA, 2ppm
de AIA, 1ppm de 2,4D y 2ppm de 2,4D con 4 explantes por unidad experimental (placa
de Petri) bajo las mismas condiciones anteriores, realizando el mismo procedimiento de
documentación. Se obtuvo que el 2,4 D para ambos protocolos induce la formación de
callo en lapsos distintos mientras que el AIA produce la diferenciación de otros órganos
(raíces); se observó también la formación de pigmentos coloreados sobre los explantes
cultivados. Se concluye que se deben mejorar ambos protocolos para optimizar la
formación de callos.
Introducción
George et al (2008) definen un cultivo de callos o bien cultivo de tejidos como el
crecimiento y mantenimiento de masas de células enormemente desorganizadas que
surgen del crecimiento descoordinado y desorganizado de pequeños órganos de la
planta, piezas de tejido de la planta o células previamente cultivadas. Para la inducción
de callos de zanahorias se utilizan reguladores de crecimiento como el ácido 2,4
diclorofenoxiacético (2,4D) y el ácido indol acético (AIA) que al igual que la mayoría de
los reguladores de crecimiento se utilizan a muy bajas concentraciones ya que así son
capaces de modificar el crecimiento y morfogénesis de la planta.
Desde el descubrimiento de la embriogénesis somática por Stewart y Reinert la
zanahoria ha sido empleada como sistema modelo para investigar la gran cantidad de
aspectos bioquímicos, fisiológicos y genéticos del cultivo de células. (McDonald et al
1995)
A nivel celular el ácido 2,4 diclorofenoxiacético (2,4 -D) es utilizado como regulador
de crecimiento con frecuencia para el cultivo in vitro ya que este es capaz de imitar a
las hormonas naturales del crecimiento de las plantas causando un crecimiento celular
anormal y acelerado (Bejarano et al 2007); en general el 2,4-D afecta el metabolismo
de la planta, síntesis de ácidos nucléicos y proteínas que alteran la actividad
enzimática, respiración y división celular, de ahí que su uso comercial más común es
como herbicida ya que ocasiona un crecimiento celular anormal acelerado causando
bloqueos y destrucción de los sistemas de transporte dentro de la planta
El ácido indolacético es una auxina natural que es considerada como inestable ya
que se degrada fácilmente en presencia de luz (Hall 2000) sin embargo es utilizada
como regulador de crecimiento ya que modifica el crecimiento y morfogénesis de la
planta, en general el AIA actúa en el crecimiento indiferenciado a nivel de meristemas
de modo que puede considerarse un inductor de callo en ciertos tejidos.
El establecimiento de cultivo de callo de zanahoria a partir de médula de raíz se va a
analizar en presencia de los reguladores de crecimiento mencionados anteriormente
con el propósito de crear una curva de crecimiento.
Materiales y métodos
El experimento fue realizado en el Laboratorio de Biotecnología del Centro de
Investigaciones Agronómicas de la Universidad de Costa Rica.
Se probaron dos protocolos distintos para estudiar el rol de dos diferentes auxinas
en el establecimiento de callos de zanahoria, para ambos el procedimiento de
desinfección fue el mismo que se describe a continuación:
Se tomaron dos zanahorias de aproximadamente 20cm de longitud y 4cm de
diámetro, estas se lavaron con agua corriente y jabón dentro de un recipiente agitando
manualmente, luego se pelaron eliminando aproximadamente 2mm de tejido.
Se cortaron las zanahorias en rebanadas de 1 centímetro de grueso, estas
rebanadas fueron sumergidas en una solución de etanol al 70% por 30 segundos y
posteriormente se sumergieron en hipoclorito de sodio al 10% durante 10 minutos en
agitación, a partir de este paso se trabajó en una cámara de flujo laminar.
Las rebanadas de zanahorias fueron lavadas cinco veces con aguada destilada y
estéril, con agitación dentro de un Erlenmeyer, durante 30 segundos.
Protocolo 1 Según Mc Donald et al 1995.
Se preparó medio de cultivo Murashige y Skoog (MS) según el protocolo del
laboratorio; éste se complementó con:
1ppm de 2,4D que se preparó a partir de una disolución madre de 500ppm
disuelta en EtOH y NaOH 1N y
1ppm de AIA que se preparó a partir de una sisolución madre de 1000ppm
disuelta en EtOH y NaOH 1 N.
Se vertieron 25ml por frasco y se esterilizaron en autoclave a 121°C y 15lb de
presión durante 25 minutos. Se pesó cada uno de los frascos individualmente.
Posterior a la desinfección se tomaron las rebanadas de zanahoria y se cortaron
cubos de tejido de la zona del cambium de un centímetro por lado, se colocó un cubo
de tejido de cambium por frasco, procurando que la superficie de uno de los lados del
cubo quedara en contacto con la superficie del medio de cultivo.
Se utilizaron 10 repeticiones por tratamiento, cada uno de los frascos donde se
colocó el tejido fue pesado y etiquetado según las condiciones planteadas.
Se volvió a pesar los frascos con los explantes y se calculó el peso de los explantes
por diferencia, finalmente se colocaron en un cuarto con 16 horas de luz por 8 horas de
oscuridad a una temperatura de 28°C.
Se realizaron observaciones cada tres días del desarrollo de los cultivos, se
descartaron los frascos con explantes contaminados; se documentó el tiempo de
aparición de los callos y semanalmente se pesaron para calcular la tasa de crecimiento
de cada callo.
Protocolo 2 Según PhytoTechnology Laboratories, Inc. (2003).
Se preparó medio de cultivo MS según el protocolo del laboratorio, este se
complementó con:
1ppm y 2ppm de 2,4D que se preparó a partir de una disolución madre de
500ppm disuelta en EtOH y NaOH 1N y
1ppm y 2ppm de AIA que se preparó a partir de una sisolución madre de
1000ppm disuelta en EtOH y NaOH 1 N.
Se esterilizó el medio de cultivo en autoclave a 121°C y 15lb de presión durante 25
minutos, se dispensó medio de cultivo en placas de Petri de manera que el medio
cubriera el fondo de la placa uniformemente y se pesó y etiquetó cada una de las
placas individualmente.
De las rebanadas de zanahoria se cortaron piezas de tejido de la región cambial del
floema secundario y se colocaron en las placas de Petri, ubicando 4 piezas por placa
con 10 repeticiones para cada tratamiento.
Cada uno de los frascos donde se colocó el tejido fue pesado y etiquetado según las
condiciones planteadas.
Se volvió a pesar los frascos con los explantes y se calculó el peso de los explantes
por diferencia, finalmente se sellaron con Parafilm y colocaron en un cuarto con 16
horas de luz por 8 horas de oscuridad a una temperatura de 28°C.
Se realizaron observaciones cada tres días del desarrollo de los cultivos, se
descartaron los frascos con explantes contaminados; se documentó el tiempo de
aparición de los callos y semanalmente se pesaron para calcular la tasa de crecimiento
de cada callo.
Resultados
Protocolo 1
De las observaciones y pesaje de los explantes semanalmente se descartó mucho
material por contaminación, 4 semanas después de haber iniciado el cultivo ya no se
contaba con suficiente material para generar una curva de crecimiento representativa
para cada uno de los tratamientos, los pesos obtenidos durante las 2 semanas iniciales
disminuyeron, sin embargo con el material restantes se documentó lo siguiente:
Formación de tejido nuevo sobre una cara del explante, color verde claro y blanco
que se considera como callo.
Figura 1. Aparición de callo en el tratamiento de 2,4D a los 21 días de cultivo.
Formación y crecimiento de nuevos callos
Figura 2.Formación y mantenimiento de callo en 2,4D a 29 días de cultivo.
Formación de pigmentos sobre explante en AIA.
Figura 3. Pigmentos sobre explante a 62 días de cultivo. a Antocianinas (morado). b
Clorofila (verde).
Diferenciación de tejido en raíces.
Figura 4. Formación de raíces en tratamientos de AIA.
ba
Protocolo 2
De las observaciones y pesaje de los explantes semanalmente se descartó mucho
material por contaminación, no se contaba con suficiente material para generar una
curva de crecimiento representativa para cada uno de los tratamientos, los pesos
obtenidos durante las 2 semanas iniciales disminuyeron, sin embargo con el material
restantes se documentó lo siguiente:
Figura 5. 7 días de cultivo en 2,4 D. a. presencia de tejido muerto (blanco). b.
contaminación sobre explantes (mancha verde).c.41 días en cultivo, contaminación.
Discusión
Jiménez y Bangerth (2001) establecen que la iniciación de suspensión de células en
zanahoria es sencilla a partir de casi cualquier parte de la planta cultivada en 2,4D, se
ha observado que en este medio se incrementan los niveles de AIA endógenos lo que
podría explicar la similitud de comportamiento en los tratamiento del primer protocolo
utilizado en dónde los callos para los tratamiento de AIA y 2,4 D son de aspecto similar.
El 2,4D fue según el experimento planteado el mejor inductor de callo en todos los
tratamientos realizados como se muestra en las figuras 1 y 2.
a b c
Para pejibaye, Valverde et al 1992 coinciden en que el 2,4D es el regulador de
crecimiento que induce la formación de callo, sin embargo destaca detalles
importantes como que aún en condiciones de oscuridad los tejidos en presencia de
2,4D sufren oxidación lo que explica la aparición de coloración leve (menos que para
AIA) en el tratamiento de 2,4D para ambos protocolos. Este autor indica también, que
después de 8 semanas una concentración de 30mg/L de 2,4D resulta tóxica o
inhibitoria ya que al mover los explantes a una condición de ausencia de 2,4D se
induce un nuevo crecimiento del tallo sobre el tejido oxidado.
La aparición de callo predominó en los tratamientos con 2,4D; se dio una aparición
más temprana en el protocolo 1 (21 días) en comparación con el protocolo 2 (41 días)
a pesar de que en el protocolo 2 se utilizaron explantes de menor tamaño con mayor
superficie expuesta con el fin de inducir la callogénesis con mayor facilidad.
Además del retardo en la callogénesis visto en el segundo protocolo se presentaron
algunos otros problemas como la muerte de tejido por errores en el procedimiento de
desinfección (figura 5a) que se le atribuyen a exceso en el tiempo de inmersión del
tejido y las concentraciones utilizadas, ya que algunos autores sugieren un máximo de
3% de NaClO y se utilizó 10%.
Asimismo el protocolo de desinfección fue deficiente en la limpieza del tejido ya que
en la figura 5b se observa contaminación originada por el tejido vegetal.
Otro punto importante para el protocolo 2 es el que sugiere Hall (2000) ya que se
debería considerar la calidad y concentración del agente gelificante que se utiliza en la
preparación del medio de cutlivo, además destaca que por lo general los materiales
disponibles comercialmente como el Phytagel son estables por un período prolongado
y no se unen excesivamente a los componente del medio; sin embargo en el ensayo
realizado, principalmente en el protocolo 2 se dificultó al manipulación del medio y
posterior crecimiento de los explantes ya que el medio se gelificó temprano y causó
una distribución desuniforme de los componentes como el azúcar que facilitaron la
reproducción y diseminación de patógenos entre las placas.
Hubo tres fuentes importantes de contaminación, la cristalería (en los bordes de los
frascos), mala manipulación dentro de la cámara (al centro del medio del cultivo) y
sobre el tejido vegetal; estos factores fueron determinantes en ambos protocolos ya
que debido al alto porcentaje de material descartado no se contaba con un cantidad
representativa de repeticiones para realizar un curva de crecimiento que se planteó en
los objetivos.
El aislamiento de antocianinas por lo general se ha estudiado en variedades de
zanahoria oscuras como la llamada “negra” o bien de color morado, Kammerer et al
(2004) sugieren que existen diferencias entre el contenido y composición de pigmentos
del tipo antocianinas entre cultivares y dentro del mismo cultivar en esta variedad de
zanahoria lo que indica que se requiere un estudio muy detallado y específico de este
fenómeno.
Sin embargo Narayan, y Venkataraman (2000) plantean un estudio en dónde a partir
de zanahorias de color “naranja pálido” se logran aislar dos pigmentos de antocianina;
este principio explica las coloraciones obtenidas en los explantes que se muestran en
la figura 3 ya que el genotipo de la zanahoria no fue escogido con ninguna
especificación y éste puede ser un genotipo alto en estos pigmentos.
Adicionado al contenido de pigmentos endógenos del tejido vegetal, la aparición de
antocianinas en zanahoria es señal de estrés, producido posiblemente por las
condiciones de deshidratación, agotamiento del medio y sensibilidad a las condiciones
de luz presentes lo que provocó una reacción fotosensible y de producción de clorofila.
Las condiciones de luminosidad asimismo afectaron principalmente al protocolo 1 ya
que el AIA se degrada en presencia de luz, aunado a este factor el medio de cultivo
complementado con AIA fue autoclavado lo que ocasionó mayor cantidad de pérdida
del mismo por ser insoluble en agua.
Finalmente, la presencia de raíces en el tratamiento de AIA que ilustra la figura 4 se
le atribuye principalmente a la diferenciación y especialización de tejidos como
respuesta a la ausencia de 2,4D que es el inductor de división celular por excelencia
como lo demuestran los tratamientos en dónde este cumplió su función.
The growth so induced has been measured in terms of the
Conclusiones y recomendaciones
Para evitar la muerte del tejido por causa del proceso de desinfección, se
recomienda reducir las concentraciones a no más de 1% para el etanol y no
más de 3% para el hipoclorito de sodio, reduciendo también los lapsos de
inmersión.
Definir previo al cultivo de los callos lo que se busca obtener (callos
embriogénico o no embriogénicos).
Comparar los tipos de corte utilizado para los explantes en igualdad de
condiciones para determinar cuál es el ideal.
Evaluar detalles como desinfección apropiada de cristalería y equipo de
trabajo para minimizar las pérdidas por contaminación.
Mejorar procedimiento de pesaje, utilizando pesaje directo de los explantes
para minimizar fuentes de error (transpiración, parafilm, desidratación, etc) o
bien realizar peso seco.
Mejorar condiciones de luminosidad según requerimientos (AIA).
Realizar mayor número de repeticiones para crear curva de crecimiento con
cantidad de datos representativos.
Literatura citada
Bejarano, F; Harikrishan, V.R.; Souza, J; Rozas, M.E.; Nivia, E.; Ramírez, F.;
Cárcamo, M.; González, H. 2007. 2,4D Razones para su prohibición mundial. RAP-AL.
Cooperativa Tlatolli. 1era edición. México.
George, E. F.; Hall, M. A.; De Klerk, G. 2008. Plant Propagation by Tissue Culture.
The Background. Volumen 1. Tercera Edición. 504p
Hall, R. E. 2000. Plant Cell Culture Initiation. Practical Tips. Molecular
Biotechnology, Humana Press Inc. 13p.
Jiménez, V. M.; Bangerth, F. 2001. Endogenous hormone levels in explants and in
embryogenic and non-embryogenic cultures of carrot. Physiologia Plantarum 111. 7p.
Kammerer, D.; Carle, R.; Schieber, A. 2004. Quatification of anthocyanins un black
carrot extracts (Daucus carota ssp. sativus var atroruben Alef.) and evaluation of their
color properties. EurFoodResTechnol. (219) 8p.
Mc Donald, K; Jackman, A; Thorup, J; Dandekar, A. 1995. Applied Biochemestry
and Biotechnology. 54.15p.
Narayan, M.S.; Venkataraman, L.V. 2000. Characterisation of anthocyanins derived
from carrot (Daucus carota) cell cultura. Food Chemistry 70. India. 3p.
PhytoTechnology Laboratories, Inc. 2003. Establishment and Maintenance of Carrot
Callus. Product Information Sheet. Kansas. EEUU.
Steward, F. C.; Rao, K.V.N. 1971. Investigation on the Growth and Metabolism of
Cultures Explants of Daucus carota. Universidad de Cornell. Nueva York. EE.UU.
Valverde, R.; Arias, O.; Thorpe T. 1992. Estudio histológico en callos de pejibaye
(Guilielma gasipaes). Agronomía Costarricense. 16 (2) 5p.
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