viernes, mesa 6 alfonso alba menédez

Nuevas tecnologías de detección

HPV

Aplicación clínica

Alfonso Alba Menéndez

INSTITUTO DE ESTUDIOS CELULARES Y MOLECULARES DE GALICIA

HPV

Detectar la presencia

¿Qué método uso?

EDAD

AL DIAGNÓSTICO

CONTROL ASC-US

CONTROL POST-TTO

¿ VACUNA?

¿REQUIERO TIPAJE?

Tipar

¿Qué es persistencia?

CARGA VIRAL

INTEGRACIÓN

¡Valor predictivo negativo!

Ordi J, Alonso I, Torne A, Esteve R, Sierra E, Campo E, Puig-Tintore LM. Human papillomavirus load in Hybrid Capture II assay: does

increasing the cutoff improve the test?

Gynecol Oncol. 2005 Nov;99(2):313-9.

Vacunas

¿Se debe tipar?

ALTA SENSIBILIDAD

TIPO ESPECÍFICO

Persistencia

GRUPO DE RIESGO

TIPAJE ESPECÍFICO

VARIANTES

¿Es necesario?

Tiempo

Carga viral

Sensibilidad

45, 33, 56 16, 33 16

Dinámica de la infección VPH

VPH 45 VPH 33 VPH 56 VPH 16

Tiempo

Carga viral

Sensibilidad

45 16 Negativo

Dinámica de la infección VPH

VPH 45 VPH 33 VPH 56 VPH 16

¿ Cual es la base común de todas las técnicas de detección

molecular ?

Complementaridad del ADN

• 5'UTR 575..607 /gene=“E6” ORF 689..>762 /gene=“HPV16" /number=1 BASE COUNT 200 a 207 c 206 g 149 t ORIGIN 1 1 1gatctgcctt ccttcctgcc cccatgtttg tctttccttg tttgtcttta tatagatcaa 61

gcaggtttta aattcctagt aggagcttac atttactttt ccaaggggga

gggggaataa 121 atatctacac acacacacac acacacacca cactggagtt

cgagacgagg cctaagcaac 181 atgccgaaac cccgtctcta ctaaatacaa

aaaatagctg agcttggtgg cgcacgccta 241 tagtcctagc tactggggag

gctgaggtgg gaggatcgct tgagcccaag aagtcgaggc 301 tgcagtgagc

cgagatcgcg ccgctgcact ccagcctgag cgacagggcg aggctctgtc 361

tcaaaacaaa caaacaaaaa aaaaaaggaa aggaaatata acacagtgaa

atgaaaggat 421 tgagagaaat gaaaaatata cacgccacaa atgtgggagg gcgataacca ctcgtagaaa

Selección de la técnica

Todas las técnicas de detección se basan en la hibridación de secuencias complementarias de nucleótidos

Selección de la técnica

Captura de híbridos

La sensibilidad y especificidad de todas las técnicas moleculares depende de

parámetros de astringencia

Hibridación reversa

PCR

Secuenciación

Ventajas

• Captura de Híbridos: Manejo

• PCR: Sensibilidad

• Secuenciación: “Gold Standard”

• Hibridación inversa: Archivo; infección múltiple

Inconvenientes

•Captura de Híbridos: No diferencia tipos

•PCR: Personal experto

•Secuenciación: Costo

•Hibridación inversa: Costo /requiere

PCR previa

Los resultados citológicos dependen de la calidad de la toma y existen variaciones inter e intraobservador

Los resultados moleculares NO dependen de la calidad de la toma ni del realizador

FALSO

LOS RESULTADOS MOLECULARES DEPENDEN DE

MULTITUD DE FACTORES

Calidad de la toma, tipo de muestra y conservación

Extracción y purificación del ADN

SELECCIÓN DE LA TECNICA

Reactivos

Lectura e interpretación de resultados

Calidad de la toma, tipo de muestra y conservación

Garantizar criterios de calidad comparables internacionalmente en

la detección y tipaje del ADN del papillomavirus humano, (HPV)

Porcentaje de detección de VPH en muestras calibradas

72,87 (95%CI; 43–95)

Porcentaje de detección de VPH en muestras calibradas

72,87 (43–95)

Determinaciones estimadas de VPH en 2009

125.000

33900 mujeres deficientemente caracterizadas

cada año en España (Pob.49 millones)

CASO A CASO B CASO C

Infección superficial transitoria

Infección bloqueada por respuesta inmune

humoral

Infección intracelular con alto riesgo

¿ Cómo suplir las deficiencias de la determinación cualitativa del

ADN viral ?

Determinación de VPH

Depende de las características morfológicas y biológicas de la lesión

[ADN E6/E7] Potencial transformación

ALTA ?

MEDIA ?

BAJA ?

MEDIA ?

E6 / E7

El ARNm nos permitirá determinar la cantidad de proteína oncogénica presente

y, con ello, una estimación real de acerca de la respuesta celular

INSTITUTO DE ESTUDIOS CELULARES Y MOLECULARES

DNA

RNA-RNAs

PROTEÍNA

DOGMA GENERAL DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR

INSTITUTO DE ESTUDIOS CELULARES Y MOLECULARES

DNA E6 DNA E6

Transcripción a mRNA

Traducción a proteína

INSTITUTO DE ESTUDIOS CELULARES Y MOLECULARES

¿comportamiento de las lesiones?

[Prot E6/E7] Potencial transformación

ALTA ELEVADO

MEDIA MODERADO

BAJA BAJO

MEDIA MODERADO

Carga viral total ALTA BAJA

(respuesta)

Carga viral total ALTA BAJA

(respuesta)

Carga viral relativa ALTA BAJA ALTA BAJA

(persistencia)

Carga viral relativa ALTA BAJA ALTA BAJA

(persistencia)

Expresión de ARNm ALTA BAJA ALTA BAJA ALTA BAJA ALTA BAJA

(proteína)

Expresión de ARNm ALTA BAJA ALTA BAJA ALTA BAJA ALTA BAJA

(proteína)

Riesgo relativo MUY ALTO BAJO MEDIO BAJO ALTO MEDIO ALTO MUY BAJORiesgo relativo MUY ALTO BAJO MEDIO BAJO ALTO MEDIO ALTO MUY BAJO

ARN mARN m

Espectrometría de masas en tandem

MALDI-TOF

Matrix-assisted laser desorption/ionization

(MALDI) Time of flight (TOF)

Selección de la técnica

HPV % Total % relativo Expresión

16 53% 64%

18 16% 21%

31 11% 09%

33 n.d n.d

45 n.d n.d

56 20% 0,6%

E6-E7 HPV16 44 UR

E6-E7 HPV18 12 UR

E6-E7 HPV31 09 UR

E6-E7 HPV45 n.d.

p16 37 UR

E2F n.d

Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) Time of flight (TOF)

4518

31

3316

p16

E2F

MS/MS permite el análisis simultáneo de

hasta 80 analitos por paciente y no es

dependiente de parámetros externos

Sensibilidad MS/MS 91.4% [95% (CI), 84.3%–95.6%]

Sensibilidad RDBH 89.7% [95% (CI), 82.3%–94.3%]

Especifidad y PPV similares

Modelo de informe para la determinación múltiple de factores por MS/MS

HPV & Cytology

at 6-12 months

Women aged 25-64 y HPV Test

Normal 5 Year Recall

Cytology

Negative

Proposed New Screening Algorithm

Positive

Normal or Borderline ≥≥≥≥ Mild

Colposcopy

Normal 5 Year Recall

HPV & Cytology at

6-12 months

Colposcopy

Cyto Neg HPV Neg Cyto ≥≥≥≥ Mild

HPV Pos & Cyto < Mild

HPV Neg & Cyto Borderline

Dr. J. Cuzick

Routine cervical screening with primary HPV testing and cytology triage

protocol in a randomised setting

Kotaniemi-Talonen, L. (Finish Cancer Registry)

BJC, 93, 862 – 867, 2005

NegativoCONTROL

PositivaCOLPOSCOPIA

NegativaCONTROL

CITOLOGÍA COLPOSCOPIA

Positivo

HPV

NegativaCONTROL

PositivaCOLPOSCOPIA

CITOLOGÍA

Guidelines ASCCP

Conclusiones

- Las técnicas moleculares están sujetas a importantes variaciones en sus resultados

- La utilidad de las pruebas moleculares requiere, necesariamente, de una evaluación en el entorno clínico

- No solo es importante saber qué tipo de VPH tiene una paciente sino saber cómo se está relacionando con el huésped

- La disponibilidad de nuevos parámetros moleculares, el estudio de la dinámica de la infección a lo largo del tiempo o la expresión de proteínas que interaccionan con el ciclo celular nos permitirá, en un futuro próximo, la caracterización del riesgo individual de cada paciente

- La tecnología de MS/MS se perfila como la herramienta diagnóstica más potente y más eficiente para el estudio de patologías de base molecular

Gracias por su atención

Muralla de Lugo, Siglo I D.C.Patrimonio de la Humanidad

alfonsoalba@e-icm.net

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