título de la conferencia - cámara nacional de...
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Uso de la metagenómica para la caracterización de la microbiota del camarón Litopenaeus vannamei y para el diagnóstico
certero de las infecciones bacterianas.
Juan QUIMI, Jordana LÓPEZ, Jefferson INTRIAGO, Steve ACEDO, Yuliana SAAVEDRA, Luis CRUZ, Virna CEDEÑO, Eric MIALHE .
Concepto azul, Guayaquil, Ecuador.
Incabiotec, Tumbes, Perú.
Universidad Nacional de Tumbes: Maestría en biotecnología molecular CIENCIACTIVA
Fragata, Tumbes, Perú
Acuacultura en Perú
Producción Nacional 2015:La producción del langostino representa el 25%.Región de Tumbes: 18 mil toneladas de langostinosRegión de Piura: 4 mil toneladas de langostinos
Exportaciones 2015: (ADEX)Total de exportaciones $ 145.2 millones (EEUU)
Presentaciones de exportaciones 2015: (ADEX)Cola de langostino congelados 77.6%Langostino enteros 23.2%
Sistema intensivo (45 a 200 langostinos por m2)Sistema semi intensivo (12 a 35 langostinos por m2)
Problemas bacterianos
Las bacterias Gram negativas en
particular los género Vibrio sp,Pseudomonas sp y Photobacterium spcausando lesiones, erosiones o
manchas en el exoesqueletos oapéndices.
Técnica de diagnostico molecular dependiente de cultivo
Extracción de muestras biológicas
Siembra y purificación de colonias bacterianas
Extracción de ADN BacterianoPCR ADNr 16S y electroforesis en gel de agarosa Secuenciación y análisis bioinformático
Identificación molecular bacteriana (base de datos NCBI)
Identificación molecular de genes de toxinas AHPND-associated plasmid pVA1
Conclusiones:• Identificación del 1% de todos los
microorganismos de la microbiota.• Diagnostico no confiable.• Medios de cultivos favorecen el
desarrollo de ciertos microorganismos,cubriendo al verdadero patógeno.
Técnica de diagnostico molecular independiente de cultivo
Extracción de muestras biológicas
Extracción de ADN total Bacteriano
PCR ADNr 16S y electroforesis en gel de agarosa Secuenciación de próxima generación (NGS)
Análisis metagenómica de las secuencias bacterianas
Conclusiones:• Identificación del 100% de todos los
microorganismos de la microbiota.• Diagnostico confiable.• Identificación de bacterias cultivabes,
bacterias difícil de cultivar y bacteriasno cultivable. (Metagenómica)
Técnica de diagnostico molecular mediante co-cultivo en medio liquido enriquecido
Muestras biológicas en medio liquido enriquecido
Extracción de ADN total Bacteriano
PCR ADNr 16S y electroforesis en gel de agarosa Secuenciación de próxima generación (NGS)
Análisis metagenómica de las secuencias bacterianas
Conclusiones:• Identificación del 10% de todos los
microorganismos de la microbiota.• Diagnostico no confiable.• Medios de cultivos favorecen el
desarrollo de ciertos microorganismos,cubriendo al verdadero patógeno
Resultados: Identificación molecular de bacterias cultivables de camarones enfermos.
HEPATOPANCREAS
Pseudomonas putidaAcinetobacter johnsonii
Bacillus firmusVibrio parahamolyticus
HEMOLINFA
Vibrio harveyVibrio hispanicus
Vibrio nigripulchritudoVibrio sinaloensis
Pseudomonas hibiscicolaStaphylococcus epidermidis
Staphylococcus warneriStaphylococcus hominis
Staphylococcus haemolyticusAerococcus viridansAcinetobacter pittii
Chryseobacterium gambriniBacillus cereus
INTESTINO
Vibrio alginolyticusVibrio brasiliensisVibrio campbellii
Vibrio harveyVibrio hepatariusPhotobacterium
damselaeProvidencia rettgeriBacillus megaterium
Resultados: Identificación molecular de genes de toxinas relacionadas a AHPND.
Transferencia de genes
Concepto Azul e Incabiotec
Implementación de la técnica LAMP PCR en campo.
Concepto Azul e Incabiotec
Detección de AHPND en Perú y Ecuador (Pir AB toxinas)
Resultados: Identificación molecular de bacterias mediante análisis metagenómico
directo de hemolinfa de camarones enfermos.
Resultados: Identificación molecular de bacterias mediante análisis metagenómico
directo de hemolinfa.
32%
15%10%
6%
6%
5%3%3%2%
18%
GENEROS PREDOMINANTES EN HEMOLINFA DIRECTA DE LANGOSTINO
SANOSHalospirulina
Bradyrhizobium
Lactococcus
Maritimimonas
Burkholderia
Streptococcus
Neisseria
Hylemonella
Mycena
Otros Generos < 2%
0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%
100%
Porcentaje de abundancia de generos en hemolinfa de camarones
Sanos Enfermos
Resultados: Identificación molecular de bacterias mediante
análisis metagenómico entre co-cultivo y directo de hemolinfa.
Comparación a nivelde especies entre
metagenómica directa (verde) y metagenómica de co-cultivo (rojo)de hemolinfa de langostino
Resultados: Identificación molecular de bacterias del hepatopáncreas
mediante análisis metagenómico entre camarones sanos y enfermos.
Comparación a nivelde géneros entre
metagenómica de sanos (verde) y metagenómica de enfermos (rojo)de hepatopáncreas de langostino
Resultados: Identificación molecular de bacterias del hepatopáncreas
mediante análisis metagenómico entre camarones sanos y enfermos.
18%
11%
9%
8%6%6%
4%4%
4%
4%2%
2%2%
1%1%
1%
1% 1%
1%
13%
Generos predominantes en hepatopancreas de camaron sanos lutimonas
roseobacterruegeriahalieaphaeobactertamlanapseudomonasmaribacterformosaflavobacteriummeridianimaribacterpseudoalteromonastenacibaculumhalioglobusoceaniovalibusplanctomycesvibriodesulfonatronumalgoriphagusOtros generos <1% (119)
9%
5%
5%
5%
4%
4%
3%
3%3%
3%3%3%3%
2%2%2%
2%2%
2%1%
1%
1% 1%1%
1%
1%
26%
Generos predominantes en hepatopancreas de camaron Enfermos
segetibacterconexibactersphingomonasmassiliakaistobacternocardioidesgemmatimonasmycobacteriummethylobacteriumacidisphaeraamnibacteriumburkholderiaphenylobacteriummodestobacteracidobacteriumflavobacteriumgaiellasolirubrobactermicrovirgaverrucomicrobiumphycisphaerablastococcusrhodovastumcorynebacteriuminquilinusthermobifidaOtros generos <1% (79)
020
406080
100
luti
mo
nas
rose
ob
acte
r
rue
geri
a
hal
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ph
aeo
bac
ter
tam
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mar
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flavobacteriu…
meridianim
a…
pseudoaltero…
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mo
nas
mas
silia
kais
tob
acte
r
no
card
ioid
es
gemmatim
o…
mycobacteri…
methylobact…
Porcentaje de abundancia de generos en hepatopancreas de camarones
Sanos Enfermos
Resultados: Identificación molecular de bacterias del intestino
mediante análisis metagenómico entre camarones sanos y enfermos.
Comparación a nivelde especies entre
metagenómica de enfermo(verde) y metagenómica de sano (rojo)de intestino de langostino
Resultados: Identificación molecular de bacterias del intestino
mediante análisis metagenómico entre camarones sanos y enfermos.
66%
26%
4%1% 3%
Generos predominantes en intestino de camaron enfermos
vibrio
propionigenium
photobacterium
sphingomonas
Otros generos <1% (23)
25%
21%
19%
15%
10%
3%
2%2% 1% 1% 1%
0%
Generos predominantes en intestinos de camaron sano flavobacterium
candidatus bacilloplasma
vibrio
mangrovibacterium
photobacterium
thalassobius
meridianimaribacter
phaeobacter
tamlana
haliea
psychromonas
propionigenium
0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%
100%
Porcentaje de abundancia de generos en intestino de camarones
sano enfermo
Resultados: Identificación molecular de bacterias en cultivo larval con
probiotico CA (concepto azul).
NC NP ZP ZC
Alteromonas 42,769096 62,5909254 2,16730425 8,95074028
Vibrio 12,6284668 2,80680986 1,14183479 11,4397817
Nautella 9,02279162 7,40175387 30,1589841 6,07087024
Marinomonas 8,78814898 2,43609913 0,00727283 0,01226129
Flexibacter 8,47529213 4,56534945 0,0174548 0,00153266
Pseudoalteromonas 7,45068594 5,4749926 0,25745829 0,44447169
Neptuniibacter 1,40316298 3,50617592 0,31418639 2,83695552
Donghicola 0,58034946 1,52957119 12,4830907 19,1689912
Flavobacterium 0,98862765 1,13705394 0,14545666 0,23296447
Tropicibacter 0,4473853 0,83176275 5,3193501 2,38788585
Coccinimonas 0,08759992 0,10435975 1,18256266 0,1180149
Pseudoruegeria 0,49274954 0,23519883 1,16219872 0,42914508
Roseobacter 0,60381373 0,6884628 1,04437883 0,82303896
Lewinella 0 0,02336412 0,45673392 1,96946939
Skeletonema 0 0 0,34909599 1,90049965
Otros Generos 6,2618299 6,66812043 43,792637 43,2133771
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
NC NP ZP ZC
Generos predominantes en cultivo larval de camaron
Otros Generos
Skeletonema
Lewinella
Roseobacter
Pseudoruegeria
Coccinimonas
Tropicibacter
Flavobacterium
Donghicola
Neptuniibacter
Pseudoalteromonas
Flexibacter
Marinomonas
Nautella
Vibrio
Alteromonas
0%
20%
40%
60%
80%
100%
Probioticos T29 Control T 31
Generos Predominantes en Larvas de Camaron
Otros Generos
Ruegeria
Phaeobacter
Thiovirga
Photobacterium
Roseobacter
Vibrio
Otras técnicas de diagnostico molecular: Espectrometría de masas MALDI TOF
MALDI TOF
Tabla de MALDI TOF/TOF . Microbiota del hemolinfa de camarones enfermos, según secuencias
de aminoácidos
sequence Description Accession
LKKANIAEFKR Bacillus alveayuensis WP_044895943.1
ANAEIAHGVR Bacillus megaterium WP_013060107.1
DAGMTR Citrobacter koseri ABV16087.1
AMVNLFR Corynebacterium genitalium WP_005289717.1
MAQDR Fusarium oxysporum EGU82499.1
ARNAAEAR Mycobacterium phage AKF14494.1
ADGESVSR Mycobacterium sp. WP_046301330.1
IPLPTISIPPR Photobacterium aphoticum GAL04160.1
FDALYINLR Pseudoalteromonas sp. WP_052140898.1
GTALHALAAAR Streptomyces baarnensis WP_030076096.1
AMLTSK Vibrio cholerae CSI79098.1
EREERGALLVR Vibrio cholerae KFE15748.1
ADGVRMR Vibrio cholerae WP_032480263.1
DAYKRNFDGSSQTNGMNAR Vibrio coralliilyticus WP_043010219.1
EDGKPDHCQYTKGEITEAR Vibrio harveyi WP_049535690.1
ANGGMLWK Vibrio harveyi WP_017817645.1
AGLQAMKAEMQR Vibrio navarrensis WP_039426966.1
KDCADPR Vibrio neptunius WP_045976469.1
VAMEYND Vibrio nigripulchritudo WP_038123309.1
ITDYDLKNIR Vibrio parahaemolyticus KED45415.1
SRSFDDQAR Vibrio parahaemolyticus WP_031838943.1
GANLVSTAQINNANR Vibrio phage 1 [VHS1022 protein] AEH21835.1
MLQRLQEARDAGR Vibrio phage 1 [PH108-56(+3)] AAL87214.1
GAFDNDKGTDDSGTVTGR Vibrio phage 1 [VHS1103 protein ] AEH21916.1
SSASAPSVTDRFANMLK Vibrio shilonii WP_051647211.1
GALRSKLDNWPIFSLYR Vibrio sp. GAL12096.1
AGDVIPQVVSVVLERRPESAR Vibrio sp. WP_040987623.1
ESQHIDGKSTSDQTSFLR Vibrio sp. WP_009843789.1
ATALEVFGFPR Vibrio variabilis GAL24966.1
DAFIRVVER Vibrio variabilis GAL25028.1
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