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TRANSFERENCIA DE MATERIAL

GENÉTICO: INDUCCIÓN DE PROTEÍNA

RECOMBINANTE

OBJETIVOS

Conocer el fundamento de la inducción de la síntesis de proteínas

recombinantes en E. coli

Realizar la inducción de una proteína recombinante

Obtener la curva temporal de inducción de una proteína recombinante

Interpretar el patrón electroforético de producción de una proteína

recombinante

Conocer las aplicaciones biotecnológicas de las proteínas

recombinantes

Regulación de la expresión génica

De los 4,000 genes presentes en el genoma bacteriano, o de los

100,000 estimados para el genoma humano, únicamente se expresa

una fracción en un momento dado.

Existen al menos seis puntos potenciales en los que la cantidad de

proteína puede ser regulada:

1) Síntesis del transcrito primario de RNA

2) Procesamiento post-transcripcional del mRNA

3) Degradación del mRNA

4) Síntesis proteica (traducción)

5) Modificación postraduccional de proteínas

6) Degradación proteica.

Permeasa

LacY

lacZ lacO lacP

Promotor Genes estructurales

lacY lacA lacI

-Galactosidasa

LacZ

Transacetilasa

LacA Proteína reguladora

(represor)

LacI

Operón de la lactosa

(Operón lac)

Análogos de la lactosa

La mayoría de estos compuestos son galactósidos derivados de la

lactosa, donde la glucosa ha sido sustituida por algún radical o

grupo químico.

IPTG (isopropil-β-D-tio-galactósido)

Fenil-Gal (fenil-β-D-galactosa)

ONPG (orto-nitrofenil-β-D-galactopiranósido)

X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactósido)

Alolactosa

Un inductor del operón lac efectivo y no metabolizable que se usa a

menudo experimentalmente es el isopropiltiogalactósido (IPTG).

Estos inductores no metabolizables permiten la separación de la

función fisiológica de la lactosa como fuente de carbono para el

crecimiento de su función en la regulación de la expresión génica.

IPTG

El IPTG suele utilizarse como inductor artificial del operón lac, ya

que es capaz de unirse al represor LacI, pero no es un sustrato para

la β-galactosidasa y no puede ser metabolizado por la bacteria.

Proteínas recombinantes

Proteínas producidas artificialmente a partir de genes clonados

Aislamiento de la secuencia génica (ARNm) y traducción de la proteína blanco

Introducción en un organismo (Procariota / Eucariota)

Expresión y purificación de la proteína blanco

Tecnología de DNA

recombinante: Aislamiento de

un gen de un organismo para

introducirlo en otro

Clonación del DNA

• DNA foráneo (secuencia que se desea clonar)

• Vector de clonación (vehículo)

• Organismo huésped (E. coli)

• Selección de vectores

Vector híbrido o recombinante

Las bacterias DH5 alfa tienen una mutación de recA, no realizan una

recombinación heteróloga, lo cual garantiza una mayor estabilidad

del inserto.

Estas bacterias carecen de algunas endonucleasas, las cuales

podrían digerir los plásmidos durante el proceso para aislar el

plásmido.

Características de las bacterias DH5α

Mecanismo de acción del IPTG en la expresión de la proteína

mediada por el vector pEXP42 en la BL21 (DE3) Codon Plus RIL

Una copia del gen cromosomal

de la RNA polimerasa T7 bajo el

control del operador de la

lactosa

Esta bacteria está diseñada para propósitos de expresión de

proteínas. Es deficiente en algunas proteasas, por lo que no digerirá

las proteínas recombinantes

BL21 (DE3) es una bacteria lisógena, en cuyo cromosoma se ha

insertado el gen que codifica la T7 ARN pol precedido del promotor

lacUV5.

La expresión del gen de T7 ARN pol se controla mediante el

promotor LacUV5.

Este es un promotor del operón lactosa inducible por el IPTG.

Sólo niveles muy débiles de expresión de T7 RNA pol se producen

cuando éste no es inducido.

Características de las bacterias BL21(DE3)

Medio LB-ampicilina

Añadir IPTG a una concentración final de 0.75 mM

500 L

cultivo

saturado

5 mL

Aprox 56 kDa

Hexocinasa de maíz con dos tags V5 y His