transferencia de genes mediada por espermatozoides para la producción de embriones transgénicos

TRANSFERENCIA DE GENES MEDIADA POR ESPERMATOZOIDES PARA LA

PRODUCCIÓN DE EMBRIONES TRANSGÉNICOS

M.C. Graciela Calderón Mendoza

Centro Multidisciplinario de Estudios en BiotecnologíaFacultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia

Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo

Animales transgénicos

Microinyección pronuclear

Transferencia nuclear

Integración genética ratones 30-50%

animales de granja 3%

Eficiencia

Transferencia de genes mediada por espermatozoides (SMGT)

FIV

Cultivo de embriones transgénicos

PASO 4

IncubaciónEspermatozoides/ADN

PASO 1

PASO 2

ADN EXÓGENO

IncubaciónEspermatozoides transfectados con ovocitos

ICSI

Implantación de embriones

transgénicos viables

Descendencia transgénicaIntegración genética

PASO 3

•liposomas•electroporación•REMI•vectores retrovirales•anticuerpos monoclonales•detergentes•crioprotectores•congelación•RecA Tn5

Métodos Transfecciónespermatozoides

* Brackett et al. (1971)

* Lavitrano et al. (1989)

*Perry A. (1999) 94% expresión genética

Inseminación artificial

Ratones, Conejos, Peces, Aves, Monkey Rhesus, macaques, Cabras, Ovinos, Cerdos, Bovinos, Felinos y Equinos

Interacción e integración de ADN exógeno en el espermatozoide

SMGT

Interacción de moléculas de ADN exógenas en el núcleo espermático

Spadafora, 1998

MP

Núcleo

MN

Protaminas

ADN cromosomal

IF-1

DP

B CD4

ADN exógeno

MHC II

DPB: binding proteinsIF-1: Factor inhibidor

Integración

ADN exógeno

Protaminas

ADN cromosomal

Integración del ADN exógeno en el ADN cromosómico del espermatozoide

Topoisomerasa II

Elementos nucleares tipo I

Spadafora, 2008

Transferencia de genes “inversa” mediada por espermatozoides (SMRGT)

SMGT94% EXPRESION GENETICA

R A T O N

Animales granja baja eficiencia: B O V I N O S

Incubación ADN/espermatozoides

LiposomasElectroporación

I.A FIV

SMGT EN BOVINOS

Castro et al., 1990: incubación ADN 0.3% espermatozoides (EGFP)

Gagné et al., 1991: electroporación 12% embriones FIV (pRGH527)

Rieth et al., 2000: electroporación 27% espermatozoides (Pst1 -actin GFP)

Francolini et al.,1993: incubación de ADN 15-22% espermatozoides (GFP)

Schellander et al. 1995: incubación ADN 2.4% embriones I.A (pSV2-cat)

Sperandio et al., 1996: incubación ADN 0.4% embriones FIV (PALu)

Shemesh et al., 2000: REMI 13% espermatozoides (pEGFP)

 Alderson et al.,2006: incubación ADN 10.2% embriones (pCX-EGFP- protaminas) FIV

Hoelker et al., 2007: liposomas 3.6% embriones (CMV-INF-t-IRES-EGFP) FIV

Pereyra et al., 2008: incubación ADN 24% embriones (pCX-EGFP) FIV

Crioprotectores en congelación y/o detergentes - Transfección espermatozoides (pCMV-GFP) (UPII-GFP) – Embriones transgénicos ICSI

Lavitrano et al. (1992)Incubación ADN exógeno

autorradiografía 80% periferia del núcleo entre MP y MN

20% internaba núcleo ratón

Francolini et al. (1993)Incubación ADN exógeno

autorradiografía 6-30% internado núcleo ratón

Sperandio et al. (1996) Incubación ADN exógeno

autorradiografía 50-80% región postacrosomal , toro y

cerdo

Huguet and Esponda (1998) Incubación ADN exógeno

microscopia electrónica 34% núcleo y 7.5% MP y acrosoma ratón

Lavitrano et al. (1997)Incubación ADN exógeno

inmunofluorescencia segmento posacrosomal cerdos

Anzar and Buhr (2006)Incubación ADN exógeno

microscopia fluorescencia región acrosomal 49% bovinos

Localización de ADN exógeno en espermatozoides

Estado funcional del espermatozoideEspermatozoide no capacitado

Espermatozoide exocitósis acrosomal

Espermatozoide reacción acrosomalNo Capacitado Capacitado Reacción acrosomal

ADN exógeno

Anzar and Buhr (2006)

Harrison, 1997: capacitation like

Perry, 1999: transfección de espermatozoides congelados de ratón

• Disuleve proteínas

• Elimina la MP

•Elimina membrana acrosomal

• Elimina acrosoma

•Ingresa ADN exógeno

• Acrosoma interfiere en descondensación de la cromatina espermática

• Expuesto núcleo espermático

núcleo

acrosoma

membrana plasmática

núcleo

ADN exógeno

cabeza

parte intermedia

flagelo

membranaacrosomal

Desestabilización de la MP del espermatozoide con detergentes

núcleo

núcleo

• Crioprotectores

• Protege al espermatozoide en congelamiento

• Almacenamiento • Daños en membrana plasmática

• Formación de cristales de agua en espacio extracelular e intracelular

• Muerte celular

Espermatozoide con crioprotector

Espermatozoide sin crioprotector

Desestabilización de la MP del espermatozoide con crioprotectores

• Bajas concentraciones crioprotectores

• Ingresa ADN exógeno

Espermatozoides de bovino transfectados

crioprotector

ADN exógeno

espermatozoides

Congelación -80°C

Espermatozoides transgénicos

APLICACION DE ESPERMATOZOIDES DE BOVINO TRANSFECTADOS

Espermatozoides MP desestabilizada con

detergentes y crioprotectores permiten la transfección

Producción de animales

transgénicos“BIORREACTOR

ES”

Producción de

embriones bovinos

transgénicos

Transferencia de embriones

Producción de proteínas terapéuticas

(UROPLAQUINA) en orina

ICSI Aumenta la captura ADN exógeno

ANIMALES BIORRECTORES DE UROPLAQUINA EN ORINA

Kerry et al. (1998)

ratones UPII

Espermatozoide Gen UPII

Promotor para tejido específico (urotelio)

Transferenciaembriones

Cultivo embrionario

ICSI

Vaca transgénicaBiorreactor Orina

Vaca adulta 30 litros/día

Aislamiento y purificación de

UPII

Urotelio-Vejiga expresando la UPII

Producto finalUPII

Marcador de cáncer urotelial en

humanos