tema 10 y 11 · cromatografía en capa fina (tlc) fase estacionaria fase móvil gel de sílice,...
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Maracaibo, febrero 2018
Análisis Instrumental
Profa. Cristina Uzcátegui Arrieta
TEMA 10 Y 11
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¿QUÉ ES LA CROMATOGRAFÍA?
Agrupa un conjunto importante y diverso de métodos, que permite a los científicos separar componentes estrechamente relacionados en
mezclas complejas
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IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry)
CROMATOGRAFÍA
Método utilizado inicialmente para la separación de los componentes de una muestra, en la cual los componentes se distribuyen en dos fases, una de las cuales es estacionaria, mientras que la otra se mueve. La fase estacionaria puede ser un sólido, un líquido sobre un soporte sólido o un gel. La fase estacionaria puede estar contenida en una columna, extendida en forma de capa o dispuesta en forma de película. La fase móvil puede ser gaseosa o líquida.
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CROMATOGRAFÍA
Mikhail Tswett, 1906
Separación de los pigmentos vegetales
coloreados
Chroma = Color Graphein = escribir
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CROMATOGRAFÍA Martin y Synge (1941) Aplicaron técnicas cromatográficas para estudiar la composición de aminoácidos en lana. Idearon la cromatografía de reparto.
En 1952 recibieron el permio Nóbel en Química. iniciaron los estudios de cromatografía de reparto líquido-gas.
En 1954, Giddings planteó la hipótesis que sería posible aplicar a la cromatografía de líquidos los mismo factores que hacían a la cromatografía de gases una poderosa técnica de separación. Fue el inicio de la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
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EVOLUCIÓN DE LA CROMATOGRAFÍA
Cromatografo de gases con espectrofotómetro de masas
Equipos para HPLC
Desde la columna sencilla de Tswett, se ha evolucionado hasta los modernos equipos que hoy se conocen
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COLUMNA Eluato Eluyente
Fase móvil
Fase estacionaria
Líquido o gas que transporta los analitos a través de una
fase estacionaria.
Sólido o líquido inmovilizado sobre el cual se reparte la
especie de analito durante el paso de una fase móvil.
Las interacciones química cruciales tienen lugar en la superficie de la fase
estacionaria.
En todas las separaciones cromatográficas, la muestra se desplaza con una fase móvil que se hace pasar a través de una
fase estacionaria
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TÉRMINOS BÁSICOS EN CROMATOGRAFÍA
Cromatografo Instrumento empleado para realizar una separación cromatográfica.
Cromatograma Representación gráfica de la composición de los solutos que salen de una columna cromatográfica en función del tiempo.
Eluir Proceso en el que la fase móvil se desplaza a lo largo de la fase estacionaria transportando los componentes a separar.
Eluyente Disolvente aplicado al principio de una columna cromatográfica.
Detector Aparato que registra una propiedad físico-química del material eluido.
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MÉTODOS INSTRUMENTALES
Entrada de la fase móvil
DETECTOR
Cromatograma
a
b
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REPRESENTACIÓN DE UN CROMATOGRAMA
Tiempo de retención (tR): Representa el tiempo transcurrido entre el instante de inyección y el determinado cuando el pico correspondiente en el cromatograma alcanza su máximo.
Res
pu
esta
del
det
ecto
r
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La separación de los componentes de la muestra problema se debe a la acción de dos efectos
contrapuestos
Efecto de retención Efecto de
arrastre
Ejercido por la fase móvil que
los empuja a través del camino recorrido.
Ejercido sobre los componentes de la mezcla
por la fase estacionaria que está situada en el soporte.
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TIPOS DE CROMATOGRAFÍA
Según el dispositivo utilizado para poner en contacto la fase
estacionaria y la fase móvil
Según el mecanismo de interacción del soluto
con la fase estacionaria
Según los estados de las fases implicadas
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FASE MÓVIL
FASE ESTACIONARIA
SOPORTE
NOMBRE
CROMATOGRAFÍA
GAS LÍQUIDO
Líquido Sólido
Adsorbente
Columna Columna
Reparto Adsorción
C.G.L c.gas-líq
C.G.S c.gas-sól
Líquido Sólido
Columna
Reparto
C.L.L c.líq-líq
Plano
Reparto
C.P c. papel
Adsorbente Resina Gel
Columna
Adsorción
C.C. F. c. capa
fina
C.L.S c. liq-sól
Intercambio
iónico
Tamaño
molecular
C.C.I c. cambio
iónico
C.E.M c. exclusión
molecular
Figura tomada de Hernández, L. Introducción al análisis instrumental. 2002
CLASIFICACIÓN DE LOS SISTEMAS CROMATOGRÁFICOS
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Tipos de cromatografía
Según el dispositivo utilizado para conseguir poner en contacto la fase estacionaria y fase móvil:
Cromatografía Plana
Cromatografía en columna
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Tipos de cromatografía
CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
Consiste en columnas huecas de longitud y diámetro variable en cuyo interior encontramos la fase estacionaria. La fase móvil se hace pasar por ellas ya sea por gravedad o por aplicación de presión.
Según el dispositivo utilizado para conseguir poner en contacto la fase estacionaria y fase móvil:
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Diluyente puro
Banda inicial con los solutos
A y B
Empaquetado de la columna (fase estacionaria) suspendida
en el disolvente (fase móvil)
Disco poroso
Emerge B Emerge A
A
B
Representación esquemática de una separación cromatográfica
Figura tomada de Harris, D. Análisis químico cuantitativo. 2007
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CROMATOGRAFÍA PLANA
La fase estacionaria se encuentra sujeta por una placa plana o en papel (cromatografía en capa fina y en papel, respectivamente) y la fase móvil se desplaza por ella mediante capilaridad o influenciada por la gravedad.
Tipos de cromatografía
Según el dispositivo utilizado para conseguir poner en contacto la fase estacionaria y fase móvil:
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CROMATOGRAFÍA PLANA
Tipos de cromatografía
Cromatografía en Capa Fina (TLC)
Fase estacionaria Fase móvil
Gel de sílice, celulosa, alúmina depositado sobre un soporte plano (lámina de aluminio o plástico)
Ácido acético, agua, éter dietílico, metanol, benceno
Cromatografía en Papel
Fase estacionaria Fase móvil
Hoja de papel de celulosa de elevada pureza recubierta de una capa de agua
Agua, etanol.
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Según los estados de las fases implicadas, en especial de la fase móvil
CROMATOGRAFÍA DE GASES
CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS
CROMATOGRAFÍA DE FLUIDOS
SUPERCRÍTICOS
Líquido-sólido, Líquido-líquido,
Intercambio iónico, Exclusión molecular.
Cualquier sustancia que se encuentre en
condiciones de presión y temperatura superiores a su punto
crítico.
Gas-líquido Gas-sólido
Tipos de cromatografía
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MECANISMOS QUE INTERVIENEN EN LA SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICA
Adsorción
Reparto
Intercambio iónico
Exclusión molecular
Afinidad
Tipos de cromatografía
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Cromatografía de adsorción El soluto presente en una fase móvil líquida o gaseosa se adsorbe a las partículas sólidas de la fase estacionaria. La separación de los diferentes solutos se debe al equilibrio entre las fases estacionaria y móvil.
Cromatografía de reparto Los componentes de la fase móvil son retenidos por la fase estacionaria liquida en función de su solubilidad en ella. Si las dos son liquidas se tiene un proceso de extracción en continuo.
MECANISMOS QUE INTERVIENEN EN LA SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICA
LO SIMILAR ES SOLUBLE EN LO SIMILAR
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Cromatografía de intercambio iónico consiste en hacer pasar una fase móvil líquida sobre una fase estacionaria que presenta grupos iónicos en su superficie de modo que los iones de signo opuesto quedarán retenidos por fuerzas electrostáticas.
MECANISMOS QUE INTERVIENEN EN LA SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICA
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Cromatografía de exclusión molecular Las moléculas de cierto tamaño presente en la fase móvil líquida o gaseosa son excluidas por la matriz que presenta poros de un determinado tamaño, impidiendo así su paso por el gel y, por tanto, acortando su tiempo de retención.
MECANISMOS QUE INTERVIENEN EN LA SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICA
Cromatografía de afinidad Se basa en la unión reversible entre el analito de interés y un ligando específico, inmovilizado en un soporte sólido inerte. Ejemplo: Anticuerpo-proteína.
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Instrumentación Cromatográfica
CROMATOGRAFÍA DE GASES (GC)
La cromatografía de gases incluye todos los sistemas cromatográficos en los que la fase móvil es un gas.
La muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatográfica. La elución se produce por el flujo de una fase móvil de un gas inerte.
La fase móvil no interacciona con las moléculas del analito; su única función es la de transportarlo a través de la columna.
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Instrumentación Cromatográfica
CROMATOGRAFÍA DE GASES (GC)
HORNO
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Instrumentación Cromatográfica
Cromatografo de Gases
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CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN
Instrumentación Cromatográfica
Dentro de las cromatografías cuya fase móvil está constituida por un líquido, destaca la Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC, High Performance Liquid Chromatography)
Esta técnica de separación y análisis consiste en hacer pasar una muestra líquida, o sólida disuelta, en un disolvente adecuado junto con una fase líquida móvil por una columna cromatográfica.
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CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC) High Performance Liquid Chromatography
Instrumentación Cromatográfica
Bomba
Detector Reservorio del
solvente
Eluente
Desgasificador
Inyección inyector
Columna
Horno para la columna
Desechos
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Instrumentación Cromatográfica
Cromatografo HPLC
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APLICACIONES
Investigación
Bioquímica
Química Control
de calidad
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APLICACIONES
Farmacia: antibiótico, sedantes, esteroides y analgésicos. Bioquímica: aminoácidos, proteínas, carbohidratos y lípidos. Alimentos: edulcorantes artificiales, antioxidantes, aflatoxinas y aditivos. Compuestos industriales: aromáticos condensados, agentes tensoactivos, agentes propulsores, y colorantes. Contaminantes: plaguicidas, herbicidas, fenoles, bifenilos policlorados. Química forense: drogas, venenos, alcohol en la sangre y narcóticos. Medicina Clínica:. Sales biliares, metabolitos de medicamentos, extractos de orina y estrógenos.
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Cromatografía Gas Líquido: análisis cualitativo y cuantitativo de mezclas complejas de compuestos orgánicos Alimentos: para determinar especies volátiles, que en muchas ocasiones son responsables de olores y sabores característicos, para determinación de lípidos y ácidos grasos mediante procesos de derivatización. Análisis de drogas junto con HPLC Para la determinación de alquitranes, pinturas, películas fibras sintéticas mediante pirolisis. Para el seguimiento y el control de contaminantes en el medio ambiente (polutantes del agua, contaminación atmosférica)
APLICACIONES
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La electroforesis se basa en la migración de iones presentes en una disolución por la acción de un campo eléctrico.
Modificando convenientemente las condiciones de una electroforesis se pueden separar moléculas neutras e iones, así como isómeros ópticos, y disminuir los límites de detección.
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Electroforesis Elektro: Electricidad Phoros: Movimiento
Esta técnica fue introducida por el bioquímico sueco Arne Tiselius. Su interés principal fue la química de las proteínas séricas. Recibió el premio Nobel en el año 1948 por su gran contribución en el desarrollo de la técnica de electroforesis y por la importancia de su hallazgo sobre la naturaleza compleja de las proteínas del suero.
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Método de separación de:
Proteínas
Ácidos nucleicos
Otras biomoléculas
Permite determinar: • Peso molecular de una proteína • Punto isoeléctrico • Distinguir moléculas por su carga neta o su forma
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Electroforesis Separación de especies cargadas, anión (-) y catión (+)
Movimiento al cátodo (-) o al ánodo (+)
Influencia de campo cargado eléctricamente
Cátodo Ánodo
- +
+
+
-
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Técnica de separación que consiste en el transporte de iones a través de una disolución por acción de un campo eléctrico.
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FUNDAMENTO
La electroforesis separa moléculas según su relación carga:masa
Las moléculas disueltas se desplazan o migran en un campo eléctrico a una velocidad determinada por su relación carga:masa.
Por ejemplo: si dos moléculas tienen masa y formas iguales, la de mayor carga neta se desplazará más rápido hacia un electrodo
La movilidad electroforética (μe) depende de:
• La carga de la molécula, su tamaño y su forma. * la carga, a su vez, depende del pH de la disolución.
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LA VELOCIDAD DE MIGRACIÓN (V) DE LA PARTÍCULA es directamente proporcional al producto de su carga efectiva (q) y el gradiente de potencial eléctrico (E) e inversamente proporcional al coeficiente de fricción (f) relativo a la forma de la molécula, o sea, a la resistencia que le ofrece el medio.
V = q E / f
FUNDAMENTO
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El movimiento de las moléculas está gobernado también por dos fuerzas adicionales: inicialmente la fricción con el solvente dificultará este movimiento originando una fuerza que se opone, por otro lado las moléculas poseen energía cinética propia por lo que tienden a moverse en forma aleatoria o movimiento browniano
FUNDAMENTO
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PARÁMETROS QUE INFLUYEN EN LA MOVILIDAD ELECTROFORÉTICA
Parámetros externos
- Campo eléctrico
- Temperatura
Parámetros relacionados con el solvente y con el sistema electroforético
- Viscosidad -Fuerza iónica
-La naturaleza de los iones componentes -El pH
Parámetros relacionados con el soluto
- La carga - La forma y el tamaño de los iones
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Carga: cuanto mayor sea la carga, mayor será la movilidad,
además su carácter catiónicos o aniónicos determinará la dirección del desplazamiento.
Tamaño y forma de las partículas: el tamaño del ión es un
factor decisivo; cuanto menor sea un ión mayor será su movilidad.
Fuerza iónica y pH del solvente: la mayoría de las
biomacromoléculas (proteínas, ácidos nucleicos y polisacáridos) poseen determinada carga eléctrica con grupos aniónicos y catiónicos capaces de disociarse.
La velocidad de migración electroforética depende de los siguientes FACTORES:
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Temperatura: el aumento de la temperatura puede traducirse en destrucción, o en la alteración de sus características (estructura, función, entre otros) de las que depende la movilidad electroforética.
Viscosidad del medio: al disminuir la viscosidad aumenta la
movilidad. Voltaje: no se puede incrementar indiscriminadamente porque se
genera un excesivo calor.
FACTORES:
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DIFUSIÓN Esta provocado por la existencia de gradientes de concentración
que favorecen el transporte hacia las zonas de menor concentración de cada especie.
Afecta tanto a partículas cargadas como no cargadas. Las moléculas tienen a moverse en forma aleatoria (movimiento
browniano) debido a que poseen energía cinética propia
Fenómenos que pueden originarse en el sistema electroforético
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CONVENCIÓN: Se trata de un fenómeno no deseable en electroforesis. Consiste en el transporte de todo tipo de especies, cargadas y no cargadas.
Fenómenos que pueden originarse en el sistema electroforético
MIGRACIÓN: Es el movimiento de las especies producido por una fuerza externa que es impuesta al medio, en este caso, el campo eléctrico y su intensidad.
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FRICCIÓN La fricción con el solvente dificultará el movimiento (es decir, al moverse los solutos chocarán con las moléculas de solvente que están en su camino), lo que genera una fuerza que se opone al movimiento.
FLUJO TÉRMICO Al pasar una corriente eléctrica a través de un sistema que origina una resistencia dada, se produce calor. Por tanto, el sistema electroforético no es isotérmico.
Fenómenos que pueden originarse en el sistema electroforético
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Electroforesis libre (en disolución)
Métodos
Electroforesis Zonal (sobre un medio soporte)
Geles (a través de una matriz porosa)
Sílice En Papel
Agarosa Policramida
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Electroforesis libre: sin la presencia de soporte
Las moléculas cargadas migran hacia los electrodos, aunque no bien separadas por tratarse de una disolución. Actualmente está en desuso, ya que al ser un fluido el medio en el que se desarrolla, tiene poco poder de resolución.
Tiselius
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Electroforesis zonal: presencia de soporte
Es una de las técnicas más utilizadas en bioquímica y biología molecular por su elevada resolución. El campo eléctrico se aplica a un medio o soporte estabilizante (en vez de a un fluido) y la muestra se deposita en una reducida zona del mismo.
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Medios de Soporte
Soportes no restrictivos
• Porosidad del soporte mucho mayor que el tamaño de las moléculas.
• No ofrece restricción al avance de las moléculas.
• Se separan dependiendo de su densidad de carga.
Soportes restrictivos
• Poros de tamaño similar al de las moléculas.
• Efecto de tamizado durante el avance.
• Se separan dependiendo de su tamaño.
Ejemplo: acetato de celulosa (para proteínas), agarosa (para proteínas)
Ejemplo: Agarosa (para ácidos nucleicos), poliacrilamida (para proteínas)
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Medios de Soporte
Papel
Método sencillo y rápido
Separación de: • Proteínas • Oligonucleótidos • Carbohidratos • Lípidos
Desventajas
• Se desgarra fácilmente • Distorsiona las bandas • Se produce interacción entre
las proteínas y los grupos hidroxilo de la celulosa
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Electroforesis en Papel
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Medios de Soporte
Acetato de Celulosa
Se usa en el análisis de fluidos biológicos (proteínas séricas, proteínas urinarias, hemoglobinas).
Tiempo de análisis corto.
Sencillez en la técnica.
Desventaja: débil resolución
Gran parte de los grupos hidroxilo de la celulosa se han esterificado por acetilación, por lo que no hay
interacción con las proteínas
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Medios de Soporte
Gel
Almidón
Poliacrilamida • Soporte más usado en
electroforesis. • Alta resolución. • Componentes tóxicos
Agarosa
• Buena resolución • Separación de moléculas
grandes (virus, ácidos nucleicos).
• Técnica económica, fácil y rápida.
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Electroforesis en Geles de Poliacrilamida (PAGE)
Polimerización de acrilamida
Químicamente inertes
Geles de porosidad controlable
Forma geles transparentes Permiten buena visualización
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Electroforesis en Gel de Agarosa
Polisacárido obtenido de algas
Separa moléculas grandes (20 000 nucleótidos)
Actúa en forma restrictiva frente a las fibras de ADN
Presentan mucha carga negativa (migran hacia el ánodo)
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TIPOS DE ELECTROFORESIS
Electroforesis en gel
Isoelectroenfoque
Electroforesis capilar
Electroforesis bidimensional
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Cubeta vertical u horizontal donde se
coloca el soporte
Buffer
Estándares y muestra
Fuente de poder
2 electrodos
Sistema de revelado y lectura
(Detector)
COMPONENTES DE UN SISTEMA ELECTROFORÉTICO
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Cubeta vertical u horizontal
donde se coloca el soporte
Buffer
Estándares y muestra
Fuente de poder
2 electrodos
Sistema de revelado y lectura
(Detector)
COMPONENTES DE UN SISTEMA ELECTROFORÉTICO
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COMPONENTES DE UN SISTEMA ELECTROFORÉTICO
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ESQUEMA DE EQUIPO DE ELECTROFORESIS CAPILAR
Muestras y Estándares
Electrolitos
Detección UV
Temperatura constante (20 – 30º C)
Capilares de sílica (75 μm x 60 cm)
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Electroforesis capilar
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VENTAJAS DE LA ELECTROFORESIS CAPILAR
Alta resolución.
Requiere pequeño volumen de muestra.
Rápida separación.
Automatización.
Reproducibilidad.
Puede acoplarse a otros equipos, como espectrometría de masa
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Proteínas.
Péptidos.
Amino ácidos.
Ácidos nucleicos.
Iones inorgánicos.
Bases orgánicas.
Ácidos orgánicos.
MOLÉCULAS QUE PUEDEN SER SEPARADAS POR ELECTROFORESIS CAPILAR
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Es posible separar moléculas biológicas en dependencia
fundamentalmente de su carga bajo la influencia de un campo
eléctrico.
Método de separación de mezclas complejas de ácidos nucleicos,
proteínas y otras biomoléculas, donde aportan un potente criterio de
pureza.
Es útil además para determinar otros parámetros como peso
molecular, punto isoeléctrico y número de cadenas polipeptídicas de
las proteínas.
APLICACIONES DE LA ELECTROFORESIS
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