tecnicas moleculares para el dignostico bioquimico
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7/14/2019 Tecnicas Moleculares Para El Dignostico Bioquimico
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TECNICAS MOLECULARES PARA EL
DIGNOSTICO BIOQUIMICO
ALUMNO: JULIO CESAR WALDO SALDAA
UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN
MARTIN - T
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Tcnica de PCR
Desarrollada por el Dr. Kary Mullis en1983.
Tcnica de Biologa Molecular quetiene por objetivo la amplificacin
directa de un gen (o fragmento deDNA) o indirecta de un RNA,presente en mezclas de muydiversas fuentes.
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Requerimientos de la prueba
Agua libre de nucleasas.
Catin divalente (MgCl2).
Desoxinucletidos (dNTPs).
Solucin amortiguadora y sales.
Oligonucletidos (primers).
Enzima (Taq polimerasa).
5-GTTGACTTGATAGGCTA -3
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/5/56/GTP_chemical_structure.png -
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Agua libre de nucleasas
Agua grado PCR libre de RNAsas y DNAsas.
Provee el medio en el cual se llevaran a cabolas reacciones necesarias para la replicacin del
ADN.
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Catin divalente
Los iones de magnesio estimulan a la
enzima Taq polimerasa para queincorpore los dNTPs.
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Desoxinucletidos
Son 4 los dNTPs involucrados en
un PCR tpico; dATP, dCTP, dGTP,
dTTP.Provee de nucletidos (base +azcar + fosfato) a la reaccin
para la sntesis de ADN.
Se incorporan a un ADN molde
de manera complementaria,para realizar una copia exacta
de este.
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Sol. Amortiguadora y sales para PCR.
AmortiguadorMantiene el pHptimo para que la
enzima acte.
Sales
Proporcionan lafuerza inica
adecuada para unamxima actividad dela enzima.
Influye en la Tm ehibridacin.
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Oligonucletidos
Secuencias cortas de ADN (18-25 bases), quesirven como punto de inicio de la replicacin del
ADN.Molculas lineales con un grupo hidroxilo en elextremo 3.Secuencias complementarias al ADN blanco.Se unen al ADN molde deacuerdo a las reglas
de complementariedad de bases.
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Taq polimerasa
Dirige la sntesis de ADN durantela replicacin.
La Taq polimerasa fue aislada de
la bacteria Thermus aquaticus en1976.
Es termoestable y acta en lapresencia de iones de magnesio.
La temperatura ptima de la
enzima son 72C.
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Pasos de la tcnica de PCR
Las cadenas de ADN son separadas
en dos hebras sencillas.
Los primers se unen porcomplementariedad a las cadenas
molde, deacuerdo a su Tm.
La enzima Taq polimerasa, adiciona
los nucletidos correspondientes en
las nuevas cadenas sintetizadas porcomplementariedad de pares de
bases.
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Desnaturalizacin
Es el primer paso en latcnica de PCR, en la cullas cadenascomplementarias de ADN
son separadas porcalentamiento.
Los puentes de hidrgenoentre las dos hebras de
ADN son rotos y estas seseparan.
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Alineacin
3
5
5
3
Alineacin de los primers3
5
5
33 535
Proceso en el que dos secuencias de ADN (primers y cadena
molde) forman puentes de hidrgeno.
La alineacin se lleva a cabo por enfriamiento de la mezcla de
reaccin, despus del paso de desnaturalizacin segn la Tm delos primers empleados.
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Elongacin del ADN
La Taq polimerasa se une al templado de ADN y comienza a adicionar los
nucletidos que son complementarios a la cadena molde.
La temperatura ptima de accin de la enzima Taq polimerasa son 72C.
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Ciclo de replicacin
Desnaturalizacin.Alineacin.
Elongacin.
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Anlisis del producto amplificadopor PCR convencional
Despus de la amplificacin al obtener el ADN de inters, estepuede ser colocado en un gel de agarosa para realizar elcorrimiento electrofortico, teirlo y observarlo con luz ultravioleta(UV).
La electroforesis es el movimiento de
partculas cargadas en un campo elctrico.
Los cidos nucleicos estn cargados de formanegativa debido a su esqueleto de grupos fosfato,
por lo que migrarn hacia el polo positivo o
nodo.
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Gel de agarosa
La agarosa es un polisacrido extrado de algas marinas que tienela propiedad de mantenerse en estado slido a temperaturaambiente pero que a altas temperaturas se torna lquida.Gelifica a temperaturas comprendidas entre 32 a 45C y funde atemperaturas entre 80 a 95C.
La agarosa es un producto natural y no txico, por lo que puede sermanejado libremente y de forma cmoda en el trabajo.La concentracin de agarosa tpicamente utilizada paraelectroforesis est entre el 0.5 % y el 2%, dependiendo del tamaodel poro requerido para la corrida electrofortica y este a su vez deltamao del cido nucleico a analizar.la concentracin de agarosa define el tamao de los poros de lamatriz, a mayor concentracin, menor el tamao de los poros yviceversa.
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Bromuro de etidio
Es un colorante fluorescente que tiene la capacidad de intercalarseentre las bases nitrogenadas de ADN y ARN.
Debido a esta propiedad, es un agente mutagnico y debemanejarse con cuidado, usando equipo de proteccin y las buenasprcticas de laboratorio establecidas.
Bromuro de etidio
Bases nitrogenadas Bases nitrogenadas
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/8/8c/DNA_intercalation2.jpg -
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Radiacin UV
Los efectos biolgicos de esta radiacin se inician por unaabsorcin fotoqumica a nivel de molculas de importanciabiolgica, las ms importantes en este sentido son los cidosnucleicos, seguidos por las protenas.
Es importante tomar las medidas necesarias para no exponerse aeste tipo de radiacin durante la revelacin de los productosamplificados en el gel de agarosa.
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PCR en tiempo real
En esta tcnica de laboratorio, los procesos de amplificacin ydeteccin se producen simultneamente en el mismo vial cerrado,sin necesidad de acciones posteriores.
Los termocicladores para llevarla a cabo, incorporan un lector defluorescencia y estn diseados para poder medir en cualquiermomento de la amplificacin del material gentico, la fluorescenciaemitida en cada uno de los viales donde se realice esta.
Los sistemas de deteccin para la PCR en tiempo real pueden serde 2 tipos: agentes intercalantes o sondas especficas marcadascon fluorocromos.
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Agentes intercalantes
Fluorocromos que aumentan notablemente la emisin defluorescencia cuando se unen a ADN de doble hlice.
El ms empleado en PCR en tiempo real es el SYBR Green I.
El incremento de ADN en cada ciclo, se refleja en un aumentoproporcional de fluorescencia emitida en cada vial donde se realiza
la amplificacin.Uno de los inconvenientes de estos es su baja especificidad, que sepuede mejorar con el empleo de condiciones ptimas de reaccin ycon una seleccin cuidadosa de los primers o cebadores
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Sondas de hibridacin especficas
Sondas marcadas con dos tipos de fluorocromos, un donador y unaceptor.
El proceso se basa en la transferencia de energa fluorescentemediante resonancia (FRET) entre las dos molculas.
Las ms utilizadas son las sondas de hidrlisis, denominadastambin sondas TaqMan, las sondas molecular beacons y lassondas FRET.
En todos estos sistemas, el incremento de ADN en cada ciclose corresponde con un aumento de hibridacin de las
sondas, lo que conlleva un aumento en la misma proporcin
de fluorescencia emitida.
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Sondas de hidrlisisSon oligonucletidos marcados con unfluorocromo donador en el extremo 5que emite fluorescencia al ser excitadoy un aceptor en el extremo 3 queabsorbe la fluorescencia liberada por eldonador.Mientras la sonda este intacta, lafluorescencia emitida por el donador esabsorbida por el aceptor.Durante la sntesis de la nueva cadenapor la Taq polimerasa, que tieneactividad 5 exonucleasa, el extremo 5de la sonda es hidrolizado,producindose la liberacin delfluorocromo donador.Una vez que el donador y aceptor estnespacialmente alejados, la fluorescenciaemitida por el primero es captada por ellector.
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Molecular beacons
Parecidas a las sondas de hidrlisis.
Tienen una molcula donadora en elextremo 5 y una molcula aceptora enel extremo 3, adems tienen unaestructura secundaria en forma de asa,
que se pliega y mantiene unidas ambasmolculas.
Al no estar hibridada con el ADN molde,la fluorescencia emitida por el donadores absorbida por el aceptor y no es
captada por el lector del equipo.Al hibridarse con el ADN diana, la sondase abre, alejndose donador y aceptor,pudiendo detectarse la fluorescenciaemitida por el primero.
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Sondas FRET
El sistema se compone de 2 sondas que se unen a secuenciasadyacentes del ADN diana.
Una de las sondas lleva un donador en el extremo 3 y la otra un
aceptor en el extremo 5.
Cuando las sondas estn hibridadas, los dos fluorocromos estnprximos. Al ser excitado, el donador transfiere su energa alaceptor que, a su vez, emite la fluorescencia que detecta el lectordel equipo.
Lector
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Equipo de amplificacin ydeteccin en PCR de tiempo real
Cada tubo pasa frente lamisma fuente de luz
excitatoria, la cual atraviesalas paredes laterales, y la
fluorescencia emitida retornaal mismo sistema de
deteccin, en este caso untubo fotomultiplicador.
LEDS y filtros quedeterminan rangos
de longitud deonda.
Todos los tubos pasan por el detectorcada 150 milisegundos.
La rotacingarantiza launiformidad
de latemperatura
del aire delsistema.
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Curvas de amplificacin
Constan de 3 partes diferentes:
La fase inicial donde no sepuede medir la acumulacin delproducto de PCR pues haypocos cambios en la seal de
fluorescencia, lo que define lalnea basal.
La fase exponencial, donde lafluorescencia cambia a medidaque se forman ms productos.
La fase de meseta, donde no sedistinguen cambios en lafluorescencia a pesar de que sesiguen acumulando productos.
Lnea basal
Fase exponencial Meseta
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Comparacin de PCR tiempo real yPCR convencional
PCR convencional
Prueba de deteccin de puntofinal.
Deteccin por empleo de geles
de agarosa, aparte de lareaccin de PCR.
Poder de resolucin limitado.
Obtencin de resultados endos pasos (amplificacin y
deteccin).Ms tiempo en obtencin deresultados.
PCR tiempo real
Prueba de deteccin de lacintica de la reaccin.
Deteccin simultanea durante
el proceso de amplificacin.Deteccin de cambiosmnimos en la secuencias ycon cantidades pequeas del
ADN blanco.
Prueba simultanea(amplificacin y deteccin) conmenor tiempo de espera.
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Aplicaciones PCR
Huella digital gentica.Test de paternidad.
Deteccin de enfermedades hereditarias.Comparacin de la expresin gnica.Clonamiento de genes.
Mutagnesis.Anlisis de DNA antiguo.Genotipificacion de polimorfismos
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FISH o hibridacin fluorescente in
situ:
Es una tcnicacitogentica de marcajede cromosomas
mediante la cual estosson hibridados consondas que emitenfluorescencia y permitenla visualizacin,distincin y estudio delos cromosomas.
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FISH
Hibridizacin in situ fluorescente
Sndromes por Micro-deleciones
Retinoblastoma(RB) del13q14
Prader Willi-Angelman del15q12
Di George/VCFacial del22q11
Beckwith Wiedwmann del11p15
Hibridar sondas marcadas
sobre un cromosoma (metafase)
o sobre un fragmento de ADN
(interfase)
http://images.google.com.ar/imgres?imgurl=http://www.consorziogenimed.it/cosa/citogenetica/3fish.jpg&imgrefurl=http://www.consorziogenimed.it/cosa/citogenetica/metodi.htm&h=225&w=300&sz=16&hl=es&start=3&tbnid=InULKFeHbh0TxM:&tbnh=87&tbnw=116&prev=/images%3Fq%3Dcitogen%25C3%25A9tica%2Bfish%26svnum%3D10%26hl%3Des%26lr%3Dhttp://images.google.com.ar/imgres?imgurl=http://www.consorziogenimed.it/cosa/citogenetica/110tuple.jpg&imgrefurl=http://www.consorziogenimed.it/cosa/citogenetica/metodi.htm&h=197&w=224&sz=13&hl=es&start=6&tbnid=Y64ZJ55ARXKiuM:&tbnh=95&tbnw=108&prev=/images%3Fq%3Dcitogen%25C3%25A9tica%2Bfish%26svnum%3D10%26hl%3Des%26lr%3D -
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Ligamiento
Tendencia de los alelos
cercanos en un mismoCromosoma a sertransmitido juntos, comouna unidad intacta en lameiosis.
Anlisis de Ligamiento
Es un mtodo de mapeode genes que utiliza el
estudio de familias paradeterminar los dosgenes estn ligados
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Es un mtodo de biologa molecular que permite detectar la
presencia de una secuencia de ADN en una mezcla compleja de
este cido nucleico. Para ello, emplea la tcnica de electroforesisen gel de agarosa con el fin de separar en base a la longitud de los
fragmentos de ADN y, despus, una transferencia a una membrana
en la cual se efecta la hibridacin de la sonda.
-Inmunodeficiencias,
-Hipoplasia adrenal congnita
-Distrofia miotnica severa
-Deficiencia de glicerol-quinasa-Distrofia muscular de Duchenne
-Anlisis de mutaciones de genes en clulas B de leucemia
-linfoblstica crnica, entre otras enfermedades
Aplicaciones
SOUTHERN BLOT
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LA SECUENCIACIN DEL ADN
La secuenciacin del ADN es un conjunto demtodos y tcnicas bioqumicas cuya finalidades la determinacin del orden de los nucletidos
(A, C, G y T) en un oligonucletido de ADN.
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Gracias..
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