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Estructura tridimensional Estructura tridimensional de de macromolmacromolééculas culas : :
su determinacisu determinacióón usando n usando difraccidifraccióón n de de rayos rayos XX
o se trata de biología estructural…?
mioglobina
Proteína A
Las estructuras secundarias y terciarias de las macromoléculas, conllevan información clave para determinar las funciones bioquímicas y celulares
Sitios activos en 3D
Diagrama 2D
Ecosistemas
Comunidades Ecología
Poblaciones
Organismos
Tejidos
Células
Moléculas
Atomos
Fisiología
Histología
Biología celular
Biología molecular / bioquímicaBiología estructural
In v
ivo
In v
ivo
In v
itro
In v
itro
Biología estructural Técnicas biofísicas :•Cristalografía de rayos X
•Calorimetría
•Microscopía electrónica
• ≠ técnicas espectroscópicas (CD, EPR, …)
•RMN
•Espectroscopía de masa
•Dispersión de luz
•Espectrofluorometría
•………….
Biología estructural
La estructura 3D de moléculas biológicas nos permite contribuir a entender :
•qué moléculas interactúan? cómo?
•rearreglos conformacionales disparados por la interacción
•cómo hacen las enzimas para catalizar reacciones?
…para describir la forma (y la topología) de algo, lo mejor es…
MIRARLO!
Es muy pequeño?…
usá un microscopio …lenteslentes
objetoobjeto
imagenimagen
… pero… el problema del límite de resolución!
Tamaños relativos entre el objeto a estudiar y la longitud de onda
Espectro electromagnético
La longitud de onda de los rayos X usados en cristalografía :1Å - 3Å (Å = 10-10m) ; lo más típico 1.54Å (Cu )
Frecuencia = c/λ =(3x108m/s) /(1.54x10-10m) ≈ 2x1018 s-1
… pero, no podemos (aún?) fabricar un microscopio de rayos X :
•no hay lentes
•aun si las tuviéramos, deberíamos poder pulirlas con una precisión mejor a 0.1Å!!
Necesitamos aprender a interpretar los patrones de difracción de rayos X (no
refocalizados), para reconstruir la distribución de densidad electrónica que
difractó
Proteína purificada
Cristales
Difracción de rayos X
Obtención de fases
Mapa de densidad electrónica
Construcción de modelo
Refinamiento
Validación
Institut Pasteur de Montevideo
X RAY DIFFRACTION FACILITY
Setup experimental para hacer difraccion de cristales unicos
Resultado experimental: estructuras a resolucion atomica
QuQuéé es es un un cristalcristal??
•La materia se clasifica en gases, líquidos y sólidos
•(también hay mezclas homogéneas que están digamos "en el medio"!! coloides, sólidos amorfos, etc)
•Sólidos: volumen fijo, incompresibles, comportamientos anisotrópicos
interaccionesintermoleculares
fuertes orden
OrdenOrden
•Explica el comportamiento anisotrópico(óptico, mecánico, magnético, eléctrico, etc)
•Arreglo ordenado a largas distancias entre moléculas (simetría, capas o planos moleculares)
Estructura cristalina = motivo * red cristalina
OrdenOrden
Estructura cristalina = motivo * red cristalina
molécula celda unidad
cristal
TeorTeorííaa
Los diagramas de fase grafican la solubilidad de las proteínas bajo distintas condiciones
TeorTeorííaa•Saturación las velocidades de pérdida/ganancia de las fases sólida y líquida son iguales, el sistema está en equilibrio•Salting-out región derecha del diagrama, la solubilidad de la proteína se reduce a medida que la concentración de sal aumenta•Salting-in región izquierda del diagrama, la solubilidad de la proteína aumenta con la concentración de sal
Qué es lo que queremos?Agregación ordenada!
La sobresaturación controlada aumenta la probabilidad de nucleación
MMéétodostodos
Experimento de difusión de vapor
pequeños volúmenes de precipitante y de proteína son mezclados en una gota que se deja equilibrar contra un reservorio de mucho más volúmen conteniendo precipitante u otro agente deshidratante
gota colgante
gota sentada
sandwich
Tipico setup de difusión de vaporExperimentos de diálisis
Experimentos en batchSe pueden usar diferents relaciones prot/precipitante
Veamos un experimento de difusión de vapor
Aún sin cristales…
Cristales creciendo!!!
…o un experimento en batch…
Ahora A, B y C son distintos experimentos
…o diálisis
región de salting-in
región de salting-outcambiando buffers
Condiciones Condiciones de screeningde screening
Los parámetros que típicamente son variados:
•Concentración de proteína (comenzar lo más alto posible)
•Precipitante (PEG’s, SA, solventes, sales concentradas, etc)
•Presencia de sales (u otros “aditivos”)
•pH y tipo de buffer
•Temperatura
Condiciones Condiciones de screeningde screening
Estrategias de screening :
•Factorial completa
•Factorial incompleta
•Aleatoria
•Rala ("sparse")
Calidad Calidad de la de la proteproteíínana•Está pura?
•el requisito más importante•hacer (SDS-PAGE, MS) + (SEC, IEC)
•Está plegada correctamente? •testear actividad si se tiene un ensayo •testear el espectro CD (o PAGE nativo)
•Es fresca?
•Es monodispersa? •monodispersión significa que la proteína existe en solución como una única especie de estructura terciaria/cuaternaria determinada (homogeneidad conformacional)•usar una columna de exclusión por tamaño (SEC) como último paso de purificación•usar dispersión de luz (DLS o SLS) como control de calidad
ObservaciObservacióónnHay ± 9 cosas distintas que se pueden llegar a ver, a veces
combinando más de una en la misma gota
1. Gotas claras 2. Materia 3. Precipitado 4. Geles 5. Piel 6. Separación de fases7. Aceites 8. Esferulitas 9. Cristales
Precipitado microcristalino 1D - agujas 2D - placas 3D - gemas
Algunas fotos…
…algunas más…
OptimizaciOptimizacióónn
Cuando se llega a identificar algo "interesante" se procede a
•Rastrear alrededor de la condición ("afinar")
•Usar aditivos
•Sembrar gotas frescas preequilibradas, con el material "interesante" : micro and macro-seeding
un un cristal demasiado observado nunca crececristal demasiado observado nunca crece!!!!
Tomar Tomar la primer la primer fotofoto!!El único requerimiento para considerar un cristal de proteína como 'bueno' es que difracte
La difracción depende de :Tamaño
•La intensidad de dispersión es proporcional al número de celdas unidad en el cristal•El N° de celdas unidad es proporcional al volúmen del cristal (duplicando todas las dimensiones de un cristal cúbico daráreflexiones ~8 veces más intensas) •El N° de celdas unidad de un cristal depende del tamaño de las celdas (tamaño de la proteína, cuan compacto sea el empaquetamiento, N° de proteínas en la unidad asimétrica, simetría)
Orden •La difracción depende de cuan idénticas son las celdas unidad.
•Colectar una imagen con un ángulo de oscilación grande. Si el cristal es de sal, los puntos van a estar bien alejados y podrían
no verse si se toma un ángulo pequeño.
Si lamentablemente es sal, se verán puntos muy intensos difractando aun a muy alta resolución (celdas
unidad muy pequeñas, bien ordenadas)
Tomar Tomar la la primera fotoprimera foto!!
•Encontrar la concentración mínima de crio-protector para el licor madre (criocristalografía)
•Poner el cristal en la solución crioprotectora por x tiempo, y montarlo en un loop
Calidad de la difracción
Fuerza
Calidad
no hay difraccióndébil (anisotrópica) 10 Åprometedora 4.5-6 Åbuena < 3 Å
cristal múltiple / splitcristal único muy mosaicocristal único
Sabemos entonces por qué usamos rayos X …
Pero por qué obtenemos densidad electrónica?
Qué son los rayos X?
Fotones = un campo eléctrico oscilante*
*también un campo magnético oscilante de la misma frecuencia, pero ortogonal y desfasado 90°
Qué son los rayos X?
E
Fotones. Un campo eléctrico oscilante
Amplitud
long. de onda
E(t) = A cos(ωt + α)
αt
ω=2πc/λ
(fase)
Un electrón en un campo eléctrico oscilante
Los electrones e- orbitan a una velocidad aprox 1/100th c (≈2x106m/s),
Por lo que en un ciclo del haz de Rx, e- viajará2x106m s-1 / 2x1018s-1 = 10-12m = 0.01Å (no muchocomparado al tamaño del átomo)
En otras palabras, los Rx ven a los e- como si estuvieran quietos.
e- oscilan en un campo eléctrico...•la oscilación de e- tiene la misma frecuencia que los Rx
•la oscilación de e- es mucho más rápida que el movimiento de orbitado
•la amplitud de la oscilación de e- es grande porque la masa de e- es pequeña. Los núcleos atómicos no oscilan apreciablemente
Ee- e-
e-e-e-
e-e-e-e-
t
…cargas en oscilación crean fotones!
e-
Å
hν
…en todas direcciones
e-
Esto es DISPERSION!
En el fenómeno de dispersión hay al menos 3 efectos :•Fotoeléctrico --->> absorción
•Compton (interacción incoherente)
•Thompson o difracción de Bragg (coherente, elástica)
Dispersión de Thompson
e4
Iθ ≅ I0 (1 + cos2θ)2r2m2c4
Por quPor quéé necesitamos cristales para ver necesitamos cristales para ver difraccidifraccióónn??
•Amplificación de la señal….(efecto de interferencia a tener en cuenta!)
molécula celda unidad
cristal
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