resistencia a hongos fitopatogenos
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AgrobiotecnologíaCurso 2008
Departamento de Fisiología, Biología Molecular y CelularFacultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires
Resistencia a hongos fitopatógenosmediante ingeniería genética
Alejandro Mentaberry
Agrobiotecnología
Resistenciaa hongosmedianteingeniería genética
SumarioPatógenos fúngicos de importanciaagronómica
Referencias
Modulación de la respuesta oxidativa
Inducción de respuestas defensivas
Expresión de proteínas de defensa deorigen vegetal
Transformación con genes de resistencia
Sobrexpresión de genes que regulanrespuestas defensivas
Expresión de proteínas antifúngicasde otros organismos
Interferencia con el proceso de infección
Detoxificación de toxinas fúngicas
Patógenos fúngicos de importancia agronómica
Agrobiotecnología
Resistenciaa hongosmedianteingeniería genética
Estrategiasde patogenia:necrotrofía
Hongos necrotróficos:Invaden agresivamente los tejidos de la planta y matan a lascélulas para obtener nutrientes mediante toxinas o enzimas.
Tomado de: Redepapa
Agrobiotecnología
Resistenciaa hongosmedianteingeniería genética
Infección deSolanumtuberosum porFusarium spp.
Infección deSolanumtuberosum porAlternaria spp.
Erysiphe cichoracearum
Hongos biotróficos:Parásitos obligados que se nutren de células vivas. Crecenen el espacio intercelular, invadiendo sólo unas pocascélulas con estructuras de absorción llamadas haustorios.Las royas, oídios y mildius están comprendidos dentro deeste grupo de hongos.
Infección de trigo por Erysiphe graminis
Estrategiasde patogenia:biotrofía
Agrobiotecnología
Resistenciaa hongosmedianteingeniería genética
Islotes verdes
Tomado de: Redepapa, APSNet
Infección de Solanum commersoniipor Phytophtora infestans.
Infección de frutos de tomatepor Phytophthora infestans.
Hongos hemibiotróficos:
Se comportan como parásitos biotróficos durante los primerosestadios de la infección. Al avanzar la colonización, el tejidomuere y continúan su ciclo como necrotróficos. Entre ellos, elde mayor importancia agronómica es Phytophtora infestans.
Estrategiasde patogenia:hemibiotrofía
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Resistenciaa hongosmedianteingeniería genética
Tomado de: APSNet
Arriba derecha: Síntomas provocadospor Ustilago maydis en mazorcas demaíz
Abajo izquierda: Infección conGibberella zeae en espigas de cebada
Arriba izquierda: Roya producida porPuccinia polysora en hojas de maíz
Daños causados por hongos fitopatógenos
Necrosis ycolapso de lashojas de papaprovocado porPhytophthorainfestans
Dañoscausadospor hongosfitopatógenos
Agrobiotecnología
Resistenciaa hongosmediantetransgénesis
Tizón tardío dela papa
provocado porPhytophthora
infestans
Lesiones concentricas causadas por Colletotricumgloeosporioides (izquierda arriba) y manchas causadas por
Podosphaera leucotricha (izquierda abajo) en frutos dedurazno. Derecha arriba: Manchas necroticas en papayacausadas por Stemphyliun lycopersici. Derecha abajo:pudrición en pepinos causada por Rhizoctonia solani
Daños causados por hongos fitopatógenos
Infecciónprovocada porSigatoka Negraen plátano(Mycosphaerellamusicola)
Distintosestadios deinfección enVitis viniferapor Guignardiabidwellii
Dañoscausadospor hongosfitopatógenos
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Resistenciaa hongosmediantetransgénesis
Los apresorios son estructuras fúngicasespecializadas en atravesar la cutícula.
Los haustorios aumentan elintercambio de sustancias entre elhongo y las células del huesped.
Muchos hongos desarrollan estructuras especialespara penetrar y colonizar los tejidos de la planta
Micelio de Peronspora parasiticadesarrollando haustorios en células
de Arabidopsis thaliana (40x)
Gentileza Dr. A. Vojnov
• Prácticas tradicionales de prevención
- Selección de variedades naturalmente resistentes
- Empleo de técnicas de mejoramiento tradicional (introducción de genes de resistencia)
- Rotación de cultivos
- Uso de condiciones de almacenamiento controladas
- Uso intensivo de fungicidas
Introduce costos de producción.Afecta el medio ambiente.Es riesgoso para los operarios.Puede ser neutralizado por el riego o la lluvia.Puede originar fungoresistencia.
El manejo deenfermedadesfúngicas sebasa en lasprácticaspreventivasy en laaplicación defungicidas
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Resistenciaa hongosmedianteingeniería genética
- Las pérdidas económicas debidas al ataque de los hongos fitopatógenos superan los U$S 200.000 millones anuales.- Se invierten anualmente cerca de U$S 6.000 millones en la protección de cultivos contra enfermedades fúngicas.
Tomado de: FAOSTAT, FAO Database
Las enfermedadesde origen fúngicoocasionanfuertes pérdidasproductivas ygrandes gastosen agroquímicos
Consumo promedio de funguicidas(103 Tm; 1990/1998)
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Resistenciaa hongosmedianteingeniería genética
A: Respuesta hipersensible.Célula de mesófilo de lechuga
penetrada por haustorios deBremia lactucae
B: H2O2 en paredes célulares delechuga infectadas por
Pseudomonas syringae
C: Formación de papilas en hojasde cebada infectadas
por Erysiphe graminis
D) Acumulación de proteínas ricasen hidroxiprolina (HRGP)
en pecíolo de Brassicaeinfectado por Xhantomonas
E: Deposición de calosa en hojasde Arabidopsis infectadas
con Peronospora parasitica
F: Formación de lesiones en hojasde tabaco infectadas por TMV
G: Lignificación en hojasde colza infectadas por
Lethosphaeria maculans
H: Formación de tilosasen xilema de cacao
infectado por Verticillium dahlia
I: Inducción del promotorde glucanasa en hojas
de tomate infectadas porCladosporium fulvum
Distintos tipos de respuestas inducibles
Modelo simplificado de la interacciónentre productos de genes R y Avr
Los productosde los genesR y Avrdesencadenanlas respuestasdefensivas delas plantas
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Los genes Avr codifican factores (elicitores específicos)que interaccionan directa o indirectamente con
los productos de los genes R.
Rutasinvolucradasen reaccionesdefensivas
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Resistenciaa hongosmediantetransgénesis
ACC: ácido 1-aminociclopropano-1-carboxílico; BAG: glucósido del ácido benzoico; BA-2H: ácido benzoico 2-hidroxilasa; CA: ácido cinámico; cGMP: guanosina 5’-monofosfato cíclico; CHS: chalcona sintetasa; EFE: enzimaformadora de etileno; GP: glutatión peroxidasa; GST: glutatión S-transferasa; HMGR: 3’-hidroxi-3-metilglutaril-CoA
reductasa; HO2. : radical hidroxiperoxil; HPDase: hidroxiperóxido dehidrogesa; MAP: proteína activadora de mitosis;
NO: óxido nítrico; OH. : radical hidroxilo; O2.-: radical superóxido; OGA y OGA-R: fragmentos de oligogalacturónido
y receptor; PAL: fenilalanina amonio liasa; Pgases: poligalacturonasas; PM: membrana plasmática; PR: proteínasrelacionadas con patogénesis; SA: ácido salicílico; SA. : radical de ácido salicílico; SAG: glucósido de ácido
salicílico; SIPK: quinasa inducida por ácido salicílico; WIPK proteín-quinasa inducida por heridas.
- Expresión de proteínas de defensa de origen vegetal
- Expresión de proteínas antifúngicas de otros organismos
- Combinación de proteínas antifúngicas
- Sobrexpresión de genes que regulan respuestas defensivas
- Modulación de la respuesta oxidativa
- Inducción de respuestas defensivas
-Transformación con genes de resistencia
- Interferencia con el proceso de infección
Estrategiaspara obtenerresistenciamedianteingenieríagenética
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Resistenciaa hongosmedianteingeniería genética
Estrategias para obtener resistenciaExpresión de proteínas de defensade origen vegetal
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Resistenciaa hongosmedianteingeniería genética
• Proteínas relacionadas a patogénesis (proteínas PR): Proteínas que se inducen frente al ataque de un patógeno. Expresadas individualmente, proveen resistencia parcial. Muestran efectos sinérgicos expresadas en combinación.
• Defensinas: Péptidos pequeños (≅ 5 kDa), ricos en cisteína. Muestran actividad antifúngica in vitro. Extracelulares (PR12).
• Tioninas: Péptidos pequeños (≅ 5 kDa), ricos en cisteína. Antifúngicos y antibacterianos. Son secretadas a vacuolas, cuerpos proteicos y pared celular (PR13).
• Fitoalexinas: Compuestos de bajo peso molecular (no proteicos) con actividad antibacteriana y/o antifúngica. Se sintetizan rápidamente en respuesta a la infección con patógenos o el tratamiento con elicitores.
• RIPs: Proteínas inactivadoras de ribosomas, actúan depurinando el rRNA 28S. Clasificadas en dos tipos (I y II)., El Tipo I suele ser el menos tóxico.
Compuestosqueparticipande lasrespuestasdefensivasde lasplantas
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Resistenciaa hongosmediantetransgénesis
Expresiónde proteínasde defensade origenvegetal
Familias de proteínas relacionadascon la patogénesis (proteínas PR)
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Resistenciaa hongosmedianteingeniería genética
Proteínas de transferencia de lípidos
Tioninas
Defensinas
Quitinasa clase Vde tabaco
PR-1 de perejil
Peroxidasa de tabaco
Quitinasa de pepino
P69 de tomate
Inhibidor I de tomate
S de tabaco
R de tabaco
P, Q de tabaco
PR-2 de tabaco
PR-1a de tabaco
Miembro tipo
Antifúngica, antioomycete
AntifúngicaPR-14
AntifúngicaPR-13
AntifúngicaPR-12
QuitinasaPR-11
Tipo ribonucleasaPR-10
PeroxidasaPR-9
QuitinasaPR-8
EndoproteinasaPR-7
Inhibidor de proteinasasPR-6
Antifúngica, antioomycetePR-5
AntifúngicaPR-4
QuitinasaPR-3
Glucanasa ß 1→3PR-2
PR-1
CaracterísticasFamilia
Proteínas de transferencia de lípidos
Tioninas
Defensinas
Quitinasa clase Vde tabaco
PR-1 de perejil
Peroxidasa de tabaco
Quitinasa de pepino
P69 de tomate
Inhibidor I de tomate
S de tabaco
R de tabaco
P, Q de tabaco
PR-2 de tabaco
PR-1a de tabaco
Miembro tipo
Antifúngica, antioomycete
AntifúngicaPR-14
AntifúngicaPR-13
AntifúngicaPR-12
QuitinasaPR-11
Tipo ribonucleasaPR-10
PeroxidasaPR-9
QuitinasaPR-8
EndoproteinasaPR-7
Inhibidor de proteinasasPR-6
Antifúngica, antioomycetePR-5
AntifúngicaPR-4
QuitinasaPR-3
Glucanasa ß 1→3PR-2
PR-1
CaracterísticasFamilia
Transformaciónde canolacon un gende quitinasade tabaco
A: canola notransgénica (izquierda)y canola transformadascon un gen de quitinasade tabaco bajo elcontrol del promotorp35S de CaMV a los 14días de crecimiento enun suelo inoculado conRhizoctonia solani
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Resistenciaa hongosmediantetransgénesis
B: Tasa de mortalidadde plántulas de canolatransgénica (círculoscerrados) y control(círculos abiertos).Los datoscorrespnden a cuatroexperimentosindependientes con 12plantas cada uno
Tomado de: Nishizawa et al. Plant Mol. Biol., 2003.
El gen Gns-1 de arroz esanálogo a genes de glucanasade otros organismos.Su sobrexpresión acelerala aparición de RespuestaHipersensible frentea Magnaporthe grisea.
Sin embargo,la sobrexpresiónno regulada afecta la fisiologíade la planta y provocala aparición espontáneade puntos necróticos(fenotipo lession-mimic)
Expresióndel gen deglucanasaGns-1en arroz
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Resistenciaa hongosmedianteingeniería genética
WT GNS-1
3 mm
WT GNS-1
Co-transformación de Nicotiana tabacum con un gende quitinasa de arroz y un gen de glucanasa de alfalfa
Protección contra Cercospora nicotianaeen plantas transgénicas de tabaco
A: Resistencia a C. nicotianae en plantas detabaco T2 heterocigotas para los genes de
quitinasa y glucanasa. El desarrollo de laenfermedad se midió por el tamaño de las
lesiones en el sitio de inculación con el hongo.
B: Resistencia a C. nicotianae en plantas detabaco T3 homocigotas para los genes de
quitinasa y glucanasa
C: Análisis cuantitativo del efecto protectorde la combinación de transgenes. Eldesarrollo de la enfermedad se mide
como el porcentaje del área con lesionesa los 2 días de la inoculacion con C. nicotianae
D: Severidad de la enfermedad en ensayos deinvernadero. Se muestra la distribución de
lesiones por hojas en plantas control (barrasabiertas) y de una planta transgénica
homocigota para ambos genes (barras sólidas)
Círculos vacíos: plantas control; círculos llenos: dobles transgénicas;círculos divididos: transgénicas para glucanasa o quitinasa
• RIPs (Ribosome Inactivating Proteins)- Son proteínas inactivadoras de la función ribosomal.- Actúan depurinando el ARNr de 28S.
• Fitoalexinas- Compuestos de bajo peso molecular (no proteicos) con actividad antibacteriana y/o antifúngica.- Se sintetizan rápidamente en respuesta a la infección con patógenos o el tratamiento con elicitores.
Otroscompuestosdefensivosfrente apatógenos
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Resistenciaa hongosmedianteingeniería genética
Letucinina
Kievitona
Expresión combinada de genes antifúngicos
Apariencia de plantas transgénicas y control que co-expresan altos niveles de RIP yquitinasa (CHI) a los 18 d de desarrollo en un ensayo de infección con Rhizoctonia solani
Co-transformación de Nicotiana tabacum con genesde quitinasa, glucanasas y RIP de cebada
Tomado de: Jach et al. The Plant Journal ,1995.
InfectadaCHI / RIP
InfectadaSR1
No infectadaSR1
a % de proteína de fluido apoplástico.b Basados en datos de plantas transgénicas transportando las construcciones de 1 solo gen.c % de proteína foliar total.
Reducción de DI esperada y medida para líneastransgénicas que expresan GLU/CHI y RIP/CHI
Tomado de: Jach et al. The Plant Journal ,1995.
0 %
12 %
30 %
Suma
0 %
20 %
10 %
CHI
0 %
5 %
20 %
GLU
Reducción de DI (esperada)b
60 %1,12,0pGJ40-2
49 %0,35,9pGJ40-1
CHIaGLUa
25 %0,10,25pGJ40-3
Reducción de DI (medida)
Nivel de expresiónPlanta
29 %
40 %
0 %
Suma
7 %
14 %
0 %
CHI
22 %
26 %
0 %
RIP
Reducción de DI (esperada)b
55 %0,50,10pGJ40-2
26 %0,10,005pGJ40-1
CHIcRIPc
50 %0,20,07pGJ40-3
Reducción de DI (medida)
Nivel de expresiónPlanta
0 %
12 %
30 %
Suma
0 %
20 %
10 %
CHI
0 %
5 %
20 %
GLU
Reducción de DI (esperada)b
60 %1,12,0pGJ40-2
49 %0,35,9pGJ40-1
CHIaGLUa
25 %0,10,25pGJ40-3
Reducción de DI (medida)
Nivel de expresiónPlanta
29 %
40 %
0 %
Suma
7 %
14 %
0 %
CHI
22 %
26 %
0 %
RIP
Reducción de DI (esperada)b
55 %0,50,10pGJ40-2
26 %0,10,005pGJ40-1
CHIcRIPc
50 %0,20,07pGJ40-3
Reducción de DI (medida)
Nivel de expresiónPlanta
Secuencia peptídica de dos defensinas de rábano. Las líneas de conexión indican puentes disulfuro.
- La mayoría de las defensinas vegetales presentan actividad antifúngica.- Su actividad estaría dada por la formación de poros en las membranas o por la alteración de la distribución de cargas.- Otras defensinas son capaces de inhibir α-amilasas, sugiriendo un rol en la defensa frente a insectos.
Los péptidos antimicrobianos poseen una estructurasimilar en moluscos, insectos, plantas y mamíferos
Tomado de: Thomma et al. Planta, 2002.
Defensinas
Las defensinas son péptidos pequeños ricos encisteína que se acumulan durante la germinaciónde las semillas y en el transcurso de reacciones
defensivas de planas en crecimiento. Constituyenla versión vegetal de los péptidos líticos
involucrados en la respuesta innata en animales.
Ensayo in vivo para estimar la potencia de la defensinaAFP2 de rabanito. En presencia de la defensina las
hifas no se elongan y aparecen deformes e hinchadas
3 µg/mlRs-AFP2
H2O (control)
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Resistenciaa hongosmedianteIngeniería genética
Liberación de compuestos antifúngicos porsemillas de rabanito en germinación
En la posición 1 se aplicó 1 µg de Rs-AFP1; en la posición2 se aplicaron semillas intactas de rabanito; en la posición
3 se aplicaron semillas con una incisión en su cubierta.Para el ensayo se usó el hongo Pyrenophora triticirepentis
A: Ensayo con agar control; B: Ensayo con agarcomplementado con 50 µg/ml de pronasa E; C: Ensayocomo en A, pero autoclavando la defensina Rs-AFP1y las semillas; D: Ensayo con agar complementado
con 100 µM de ácido abscísico
Inmunolocalización de defensinas Rs-AFP de semillaA: sección teñida con Amido Black para proteínas totales. El haz
vascular se observa en el centro del hipocótilo;B: Inmunolocalización de Rs-AFPs.
Barras: 1 mm. C: cotiledón; E: endosperma; H: hipocótilo;SC: cubierta de la semilla
Las defensinas se sintetizan abundantementedurante la germinación de las semillas
Tomado de: Kawata et al. JARQ, 2003.
Sintransformar
Transgénica Control sininocular
Ensayo de infección con Pyricularia griseaSobrexpresiónde unadefensinade Brassicaoleracea enOryza sativa
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Resistenciaa hongosmedianteingeniería genética
- Las tioninas se encuentran en el endosperma, tallos,raíces y en hojas etioladas o estresadas de muchasespecies vegetales.
-Son tóxicas para las bacterias gram-positivas o gram-negativas, hongos, levaduras y varios tipos de célulasde mamíferos.
-Su efecto tóxico requiere la interacción con fosfolípidosde membrana cargados negativamente, seguido por laformación de poros o la interacción con dominiosespecíficos de la membrana.
-Es posible que la interacción con ciertos fosfolípidosinvolucrados en la transducción de señales altere elmetabolismo en células de mamíferos.
Las tioninasson proteínasde bajo pesomolecularcon actividadantimicrobiana
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Resistenciaa hongosmedianteingeniería genética
α-hordotioninade cebada
Tomado de: RCSB/Protein Data Base Código: 1WUW
Sobrexpresiónde la tioninaThi1.2 enArabidopsisthaliana
Ensayos de infección con Fusarium oxysporium
Ecotipo resistenteUk-4
Ecotipo Col- 2transgénico
Ecotipo Col- 2sin transformar
Tomado de: Epple et al., The Plant Cell, 1997.
Crecimiento normal deFusarium oxysporium
matthiolae en Col-2 sintransformar
Enrollamiento enCol-2 transgénica
Hiperramificaciónen Col-2
transgénica
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Resistenciaa hongosmedianteingeniería genética
Ensayos de resistencia a Peronospora parasítica
Se introdujo el gen pnAMP-h2 de Pharbitis nilen tabaco, bajo el promotor constitutivo 35S. Estegen codifica un péptido de la familia de la heveína.
Tomado de: Koo et al. Plant Mol. Biol., 2002.
Expresiónde un péptidoantimicrobianode Pharbitis nilen tabaco
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Resistenciaa hongosmedianteingeniería genética
Línea transgénica Línea control
Estrategias para obtener resistenciaExpresión de proteínas antifúngicasde otros organismos
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Resistenciaa hongosmedianteingeniería genética
Expresióndel gen deendoquitinasadeTrichodermaharzianum
Resistencia a Alternaria alternata de plantas de tabacotransformadas con un gen de endoquitinasa
de Trichoderma harzianumSíntomas de enfermedad a los 15 días de la inoculación y actividad de
endoquitinasa en extractos de hojas de líneas transgénicasrepresentativas. La actividad endoquitinasa se expresa como pmoles
de 4-metilumbiliferona liberados de 4-metilumbeliferil-β-D-N-N’-N”-triacetilquitotriosa/min/µg de proteína
Agrobiotecnología
Resistenciaa hongosmediantetransgénesis
A) Plántulas cultivadas por 5 díasen agar
1: controles sin patógeno2: controles infectados3: plantas transgénicas sin patógeno4: plantas transgénicas con patógeno
B) Plantas transgénicas y controlescultivadas en suelo infestadocon Rhizoctonia solani. Las plantasmás erguidas son transgénicas (cajasde la derecha). En la esquina inferiorizquierda se muestran plantas controlno infectadas. Las cajas centrales y lasuperior izquierda corresponden acontroles no transgénicos infectados
Tomado de: Lorito et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998.
Expresión de quitinasa de Trichoderma harzianum
Resistencia a Rhizoctonia solani en plantas transgénicas
A
B
1 2
3 4
Resistencia a Rhizoctonia solani de plantas de tabaco transformadas con un gen de endoquitinasade Trichoderma harzianum. Se grafica el crecimiento de las plantas entre 14 y 30 días en un sueloinfectado por R. solani. El crecimiento está expresado como porcentaje de la altura obtenida en
suelo no infectado, el que se tomó como 100%. Las plantas control se indican con flechas.
Expresión del gen de endoquitinasade Trichoderma harzianum
Resistencia de plantas de tabaco y de papa transformadas con el gen de endoquitinasade Trichoderma harzianum a Botrytis cinerea y Alternaria solani, respectivamente
A: tamaño de las lesiones (mm2) producidas en plantas de tabaco control y transgénicasa los 10 y 14 d de la inoculación con B. cinerea. B: número de lesiones observadasen plantas de papa control y transgénicas a los 9 d de la inoculación con A. solani
Expresión del gen de endoquitinasade Trichoderma harzianum
Tomado de: Nakajima et al..Plant Cell Report. 1994.
Ensayo de infección de plantas de tabacocon Erysiphe cichoracearum
- También se ha observado resistencia a Erysiphe heraclei y a Alternaria dauci en plantas de zanahoria transformadas con el mismo gen.- La misma línea transgénica muestra resistencia a. Pseudomonas syringae pv. tabaci.
Transformaciónde plantasde tabacocon el gende la lisozimahumana
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Resistenciaa hongosmedianteingeniería genética
Transgénica WT
Esquema radial de la magainina,péptido obtenido de Xenopus laevis
Tomado de: Matsuzaki, Biochimica et Biophysica Acta,1998.
Modelo de acción de péptidos tipomagainina en asociación con la membrana
Las glándulas dorsales de los anfibiosson una fuente rica en péptidos antimicrobianos
Los péptidoslíticos se uneninicialmente ala membranaplasmática (A),En etapassucesivas,forman porosen la misma (B)ydesestabilizanla estructurade la bicapalipídica (C) .
Tomado de: De Gray et al.,Plant Physiol., 2001.
Ensayo de infección con Colletotrichum destructivum
También se observó actividad in vitro contra Aspergillusflavus, Fusarium moniliforme, y Verticillium dahliae.
Expresióndel péptidoMSI-99, encloroplastosde tabaco
TransgénicaControl
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Resistenciaa hongosmedianteingeniería genética
Halo de inhibicióndel crecimientode Pseudomonassyringae pv tabacialrededor dediscos de hoja.4: Líneatransgénica.WT: planta sintransformar.
Respuestaa Phytophthoranicotianaede plantasde dos semanasde edad,de las mismaslíneas.
Expresióndel gen deesculentinade Ranaesculentaen tabaco
Tomado de: Ponti et al. Biochem. J,. 2003.
wt 4
wt 4
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Resistenciaa hongosmedianteingeniería genética
Actividad antifúngica in vitro de sarcotoxina 1Ade Sarcophaga peregina
(A) Supresión del crecimiento de micelios por sarcotoxina 1A (20 h de incubación a 28ºC).(B) Efecto de sarcotoxina 1A en el crecimiento hifal de Rhizoctonia solani (12 h de
incubacción). (C) Pérdida electrolítica aumentada del micelio de R. solani tratado consarcotoxina 1A (medido en dextrosa de papa tras 1 h de incubación). (D) Pérdida de la
integridad de membrana del micelio el tratamiento con sarcotoxina 1A (16 h de incubación).
Resistencia aumentada contrapatógenos fúngicos en la línea
transgénica PSS41
A: Brotes control (35S::GUS) yPSS41 (derecha) inoculadoscon Rhizoctonia solani (luegode 2 d de inoculación).B: Sección transversal de loscotiledones infectados.C: Acumulación inducida desarcotoxina por inoculaciónfúngica.D: Resistencia aumentadacontra la infección de R. solanien brotes de PSS41.E: Resistencia aumentadacontra la infección de Pythiumaphanidermatum en brotes dePSS41.F: Síntomas suprimidos por lainfección de Pseudomonasnicotianae en plantas PSS41.
Actividad antifúngica in planta de sarcotoxina 1Ade Sarcophaga peregina
Infection assays with Fusarium solani
A: Control no transgénico; B: Transformado con el gen de lisozima; C: transformadocon el gen de dermaseptina; D: transformado con el gen de AP24 y el gen de lisozima;E: transformado con el gen de AP24, el gen de lisozima y el gen de dermaseptina; F:control no transformado no inoculado.
Plantas de Solanum tuberosum transformadas con genesde dermaseptina, AP24 y lisozima
AA B C
D E F
Ensayos de infección con Fusarium solani
3D 12 3D 7 3D 8 Ap 17 Ap 35 Ap 48 Ap 60 Banda55
Banda59
Banda80
Casa23
Casa 8 Wt
Controles H2O
0
100
200
300
400
500
Vol (
mm
)
Lineas
Controles H2O Infectadas
Ensayos de infección con Fusarium solani
Plantas de Solanum tuberosum transformadas con genesde dermaseptina, AP24 y lisozima
Estrategias para obtener resistenciaExpresión de genes relacionados con laregulación de la respuesta frente a patógenos
Agrobiotecnología
Resistenciaa hongosmedianteingeniería genética
Expresiónde genesrelacionadoscon laregulación dela respuestaa patógenos
El gen NPR1 coordina varios tiposde respuesta de defensa
Agrobiotecnología
Resistenciaa hongosmedianteingeniería genética
Adapado de: McDowell and Doffenden, Trends in Biotechnolgy, 2003.
Tomado de: Cao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998.
Sobrexpresión del gen NPR1 en Arabidopsis thalianay ensayos de resistencia a Peronospora parasitica
Línea transgénica 35S-NPR1-H
WTConidióforosConidióforos
Control no transgénico
Transformaciónde arroz conel gen MK1 deCapsicum annum
La transformaciónde Oryza sativa conel gen de la proteínaquinasa activada pormitógenos (MK1)de Capsicum annumincrementa laresistencia aMagnaporthe grisea
La secuencia de laproteína codificadapor el gen MK1 poseeun 92% de identidadcon la proteín-quinasa inducida porheridas (WIPK) detabaco.
Tomado de: Da-Eun et al., Mol. Cells, 2004.
0 6 12 24 48 72 96 0 6 12 24 48 72 96
0 6 12 24 48 72 96 0 6 12 24 48 72 96
Wt M2
M18 M19
PR1a
PR1b
PR10
PR1a
PR1b
PR10
Agrobiotecnología
Resistenciaa hongosmedianteingeniería genética
Wt M2 M18 M19
Estrategias para obtener resistenciaActivación general de las defensas de la planta
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Resistenciaa hongosmedianteingeniería genética
• Elicitores- Son compuestos capaces de promover las respuestas de defensa de las plantas, aún en ausencia de patógenos.- Varios de ellos, como los oligogalacturonatos y las oligo-N-acetil-glucosaminas, son activos
en diversas especies vegetales; otros poseen actividad específica (por ejemplo, β-criptogeína).
• Expresión en plantas transgénicas- La planta transformada debe poseer receptores adecuados para el reconocimineto del elicitor.- Es preferible la expresión bajo promotores inducibles por la presencia o la acción del patógeno.- Si la expresión es regulada por el promotor adecuado, es posible desencadenar una respuesta frente a un patógeno no reconocido habitualmente por la planta.
Expresiónde elicitores
Agrobiotecnología
Resistenciaa hongosmedianteingeniería genética
También se observó resistencia a Thielaviopsis basicola,Erysiphe cichoracearum y Botrytis cinerea
Expresiónen tabaco delelicitor criptogeínade Phytophthoracryptogea bajoel promotorhsr203J induciblepor patógenos
Agrobiotecnología
Resistenciaa hongosmedianteingeniería genética
Fenotipos inducidos en líneas de tabaco transformadas al infiltrar las hojas con Phytophthora parasitica var. nicotianae.
Necrosis local en hojas.
Inoculaciones:a) Phytophthoraparasitica var. nicotianae virulenta.b) Phythophthora cryptogeaavirulenta (HR). c) Tratamientocon criptogeína pura.d) Agua.
Transgénicas XPR24
E8 E6 b12 E10E8 E6 b12 E10Wildtype
Tomado de: Keller et al., The Plant Cell,1999.
ab
c d
ab
cd
ab
c d
ab
cd
WT XPR24
Estrategias para obtener resistenciaTransformación con genes de resistencia
Agrobiotecnología
Resistenciaa hongosmedianteingeniería genética
El ciclo útil de un gen de resistencia dura entre 8 y 12 años
El uso continuado de cultivos portadores de genes Rpuede originar la aparición de patógenos resistentes
Adaptado de Adugna, Asian Journal of Plant Sciences, 2004
¿Cómo evitar la aparición de resistencia?
La introducción de varios genes R en la misma línea simplifica el manejo agronómico.
El uso de múltiples líneas transgénicas permite utilizar un fenotipo homogéneo.
Un cultivo homogéneo favorece la aparición de resistencia.
El uso de variedades con distintas resistencias aumenta la heterogeneidad.
Luego se evaluóla adquisiciónde resistenciaen las líneastransgénicas enensayoscontrolados.
Clonado del gen RB de Solanum bulbocastanum
Se transformaronplantas susceptibles(Solanum tuberosum cv.Katahdin) con distintassecuencias de ADNgenómico provenientesde una especie(Solanumbulbocastanum)resistente al patógenoPhytophthora infestans.
El fenotipo deresistenciapuede utilizarsepara clonarnuevos genesde resistencia
Tomado de: Song et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003.
Agrobiotecnología
Resistenciaa hongosmedianteingeniería genética
1. Variedades de cebada susceptibles (S), medianamenteresistentes (MR) y resistentes (R).
2. El transgen se hereda según patrones mendelianos. A partirde un transgénico heterocigota, se obtienen descendientessusceptibles (S) y resistentes (R).
Tomado de: Horvath et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003.
Latransformaciónde variedadesrelacionadascon genes Rpermite acelerarel proceso demejoramiento
Resistencia a la roya del tallo (Puccinia graminis)en cebada mediante introducción del gen Rpg1
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Resistenciaa hongosmedianteingeniería genética
Gol
den
Prom
ise
Mor
ex
Che
vron
Gol
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Prom
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trans
géni
ca
S MR R S R
Gol
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Mor
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Che
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Gol
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géni
ca
S MR R S R1 2
Estrategias para obtener resistenciaModulación de la respuesta oxidativa
Agrobiotecnología
Resistenciaa hongosmedianteingeniería genética
Modulaciónde larespuestaoxidativa
Las especies reactivas de oxígeno (ROS) cumplenvarios roles de importancia en la defensa de la planta
Agrobiotecnología
Resistenciaa hongosmedianteingeniería genética Adaptado de: Buchanan et al. Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2000.
BA.2H: dehidrogensa delácido benzoico
¿Cómo lograrlo?
- Inhibiendo enzimas detoxificadoras de H2O2 (catalasa, ascorbato peroxidasa).
- Introduciendo enzimas productoras de H2O2
Ejemplo: glucosa oxidasa (GO).
- Es importante considerar que un incremento excesivo de H2O2 puede resultar perjudicial para las células vegetales.
Es posibleaumentarlos nivelesendógenosde H2O2en la planta
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Resistenciaa hongosmedianteingeniería genética
COH
(CHOH)4
CH2OH
+ O2
COOH
(CHOH)4
CH2OH
+ H2O2
GOCOH
(CHOH)4
CH2OH
+ O2
COOH
(CHOH)4
CH2OH
+ H2O2
GOCOH
(CHOH)4
CH2OH
+ O2
COOH
(CHOH)4
CH2OH
+ H2O2
GO
Tomado de: Wu et al., Plant Physiol. 1997.
Transformaciónde Solanumtuberosum conel gen deglucosa oxidasade Aspergillusniger
Ensayo de infección con Verticillium dahliae
El hongo ataca las raíces y el sistema vacular. Las plantas notransformadas (Rus. Bur) o transformadas con el vector vacío(17227-1) exhiben síntomas severos. Las líneas transgénicas
(22587-43 y 22587-9) resultan resistentes. La foto fue tomada alos 40 días de la inoculación
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Resistenciaa hongosmedianteingeniería genética
Hojas de plantas de papa transformadas con el gen GOinoculadas con esporangios de Phythophtora infestans. Lafotografía está tomada a los cuatro días de la inoculación
Transformaciónde papa conglucosa oxidasade Aspergillusniger bajoun promotorconstitutivo
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Resistenciaa hongosmediantetransgénesis
Estrategias para obtener resistenciaInterferencia con la patogénesis
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Resistenciaa hongosmedianteingeniería genética
Los elicitores pueden ser moléculas producidas por el patógenoo productos de degradación de la planta: el modelo PG/PGIP
1: Las poligalaturonasas (PG)secretadas por la hifa del hongointeraccionan con los inhibidoresde poligalacturonasas (PGIP)presentes en la pared celular.
2: Se liberan oligogalacturónidosque interaccionan con un receptorhipotético presente en la membranade la célula vegetal.
3: La transducción de la señalproducida a partir de esta interacciónprovoca la liberación de compuestosde defensa, incluidos los PGIPs.
4: La quitinasas, glucanasasy fitoalexians son secretadaspor la planta.
5: La hifa del hongo invasores atacada por los compuestosdefensivos.
Interferencia con el proceso de infección
Adaptado de: Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2000.
Colonización por Botrytis cinerea en plantas de tomate controly transgénicas. Experimentos por duplicado inoculando conidias
de las cepas de B. cinerea B05.10 (infectiva; mitad izquierda de lashojas) y ∆Bcgp (no infectiva; mitad derecha de las hojas).
Sobrexpresiónde unaproteínainhibidorade poli-galacturonasade peral enplantas detomate
Tomado de: Powell et al., MPMI, 2000.Agrobiotecnología
Resistenciaa hongosmedianteingeniería genética
Planta transgénicaB05.10 ∆Bcpg1
Planta controlB05.10 ∆Bcpg1
• Expresión de oxalato decarboxilasa- Se ha asociado el oxalato a la patogenicidad de Sclerotinia sclerotiorum, Sclerotinia rolfsii, y Sclerotinia ceptivorum.
- Aunque no se conoce exactamente su función, podría actuar quelando el calcio de la pared celular (pectato de calcio) o adecuando el pH para favorecer la acción de enzimas celulolíticas.
- Se ha reportado que la presencia de oxalato decarboxilasas interfiere con el proceso de
infección.
La acumulaciónde oxalatose asocia a lapatogenicidadde varios hongosfitopatógenos delgéneroSclerotinia
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Resistenciaa hongosmedianteingeniería genética
Molécula de oxalato
Los paneles superior e inferior muestran lesiones formadas a los 2 y 5 d de lainoculación con Sclerotinia sclerotiorum. S4 y S6 son líneas transgénicas. Las hojasenfermas muestran crecimiento del micelio, formación de lesiones y amarillamiento.
Expresión del gen de oxalato decarboxilasadel hongo Collybia velutipes en plantas de tomate
Sobrexpresión del gen de la enzima oxalato decarboxilasa (OXDC)en plantas de tomate bajo el promotor 35S de CaMV.
Tomado de: Kesarwami et al., J.Biol. Chemistry, 2000.
Control S4 S6
2 d.
p.i.
5 d.
p.i.
Control S4 S6
2 d.
p.i.
5 d.
p.i.
micelio
- La respuesta hipersensible (HR) se asemeja a la muerte celular programada (PCD) de mamíferos.
- Es posible que algunos hongos necrotróficos operen utilizando los mecanismos de muerte celular de la propia planta.
- Se han investigado en plantas los efectos de genes inhibidores de apoptosis provenientes de especies no vegetales, entre ellos, Bcl-2 y Bcl-xl humanos, CED-9 de nematodos, Op-IAP y p35 de baculovirus.
Existen genesantiapoptóticosque puedeninterferircon el procesode necrotrofía
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Resistenciaa hongosmedianteingeniería genética
Expresión de proteína antiapoptóticap35 de baculovirus en tomate
Respuesta de raíces in vitro de tomate frentea la toxina AAL del hongo necrotrófico
Alternaria alternata (arriba) y de plantasresistentes, susceptibles y transgénicas
frente a la inoculación con el hongo eninvernadero (derecha). Asc: Planta controlresistente; asc: planta control susceptible;
p35: planta transgénicaLincoln et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2002.
asc/asc sin toxina p35 sin toxina
asc/asc con toxina p35 con toxina
asc/asc sin toxina p35 sin toxina
asc/asc con toxina p35 con toxina
Tres frutos de un líneasusceptible (asc-asc,izquierda) y dostransgénicas con distintosniveles de expresión,inoculadas con conidiosde Alternaria alternata(centro y derecha).
Expresióndel gen p35de baculovirusen tomate
Medida del diámetrode las lesionesproducidas en el ensayo.asc/asc: líneasusceptiblep35-9 y p35-62: líneastransgénicas
Tomado de: Lincoln et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002.
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Estrategias para obtener resistenciaDetoxificación de toxinas fúngicas
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Resistenciaa hongosmediantetransgénesis
Detoxificaciónde eutipinamedianteuna enzimareductoraaislada deVigna radiata
• La eutipina [4-hidroxi-3-(3-metil-3-butene-1-inil) becil aldehído] es unatoxina producida por Eutypa lata, agentecausal de una grave enfermedad de lasvides
• Las vides resistentes al hongo tienenla capacidad de reducir eutipina aeutipinol, el cual no es tóxico
• Se aisló una aldehído reductasa-NADPH dependiente de Vigna radiata(VR-ERE) que es capaz de reducireutipina
• Se transformaron callos de Vitisvinifera con este gen y se expresó laenzima en forma constitutiva
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Resistenciaa hongosmediantetransgénesis
Expresión de VR-ERE en callos transgénicos de Vitis viniferaActividad de la enzima reductora de eutipina en callos no transgénicos
(WT) y en tres líneas transformadas con el gen VR-ERE
Detoxificaciónde eutipinamedianteuna enzimareductoraaislada deVigna radiata
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Resistenciaa hongosmediantetransgénesis
Resistencia a eutipina en diferentes líneas de callostransgénicos transformados con el gen VR-ERE
Los callos control y transgénicos se cultivaron en presencia deconcentraciones crecientes de eutipina. El peso del tejido se determinó a las
4 semanas de cultivo. Cada punto representa 40 duplicados
Detoxificaciónde eutipinamedianteuna enzimareductoraaislada deVigna radiata
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Resistenciaa hongosmediantetransgénesis
Referencias 1. McDowell, J.M. and Woffenden, B.J. Plant diseaseresistance genes: recent insights and potential applications.Trends in Biotechnology, 21:178-182, 2003.2. Punja, Z.K. Genetic engineering of plants to enhanceresistance to fungal pathogens - a review of progress andfuture prospects. Canadian Journal of Plant Pathology, 23:216-235, 2001.3. Stuivers, M.H. and Custers, J.H.H.V. Engineering diseaseresistance in plants. Nature, 411:865-868, 2001.4. Ribeiro do Vale, F.X. Concepts in plant disease resistance.Fitopatología Brasileira, 26: 577-589, 2001.5. Melchers, L.S. and Stuiver, M.H. Novel genes for disease-resistance breeding. Current Opinion in Plant Biology, 3:147-152 2000.6. Honée, G. Engineered resistance against fungal plantpathogens.European Journal of Plant Pathology, 105:319–326, 1999.
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