reacción en cadena de la polimerasa (pcr). detección de ácidos nucleicos con hibridación con...
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Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Detección de ácidos nucleicos
Con hibridación
Con amplificación
Southern blot
Northern blot
Western blot
PCR
FISH
Microarray
LCR
NASBA, b-DNA
• Métodos de amplificación de la diana- PCR (y sus variantes)- NASBA (Nucleic Acid Sequence based amplification)
• Métodos de amplificación de la sonda- Reacción en cadena de la ligasa (LCR)
• Métodos de amplificación de la señal- Branched DNA (b-DNA)
Historia de la PCR
Kary Mullis
Diseñó la técnica de PCR en los años 80
Premio Nobel en Química, 1993
¿Qué es la PCR?
PCRTécnica molecular específica, rápida,
sensible y versátil
A partir de una molécula de ADN se obtienen millones de copias de un mismo fragmento
¿Cómo es esto posible? ....
Pensemos en la naturaleza...
¿Cómo hace la célula para replicar su genoma?
SE DESNATURALIZA LA DOBLE HEBRA
SE UNE LA
ENZIMA ADNpol
DOBLE CADENA DE ADN
SE SINTETIZAN 2 COPIAS IDÉNTICAS A LA DOBLE CADENA DE ADN
PCR
Molécula deADN (molde)
dNTPs (A;G;T;C)
ADN polimerasa
termoestable
Cofactor Mg2+
Cebador sentido Cebador Antisentido
¿Cómo podemos lograrlo in vitro?
¿Qué es un primer?
Secuencia de oligonucleótidos complementaria a secuencia de ADN que se desea amplificar
Fragmento de ADN
SECUENCIA QUE DESEO AMPLIFICAR
PRIMER FW
PRIMER REV
• Permite amplificar un fragmento específico a partir del genoma
CACGGCCCTGGGAACAATGCAGCTCCGCGTGCGGGCTGAGAGGACCCTGCCCCACCCCAGGTTCCACGCTCA
GTGCCGGGACCCTTGTTACGTCGAGGCGCACGCCCGACTCTCCTGGGACGGGGTGGGGTCCAAGGTGCGAGT
5´ 3´
5´3´CACGGCCCTGGGAACAATGCA
GGTGGGGTCCAAGGTGCGAGT
3´
3´ 5´
5´
Cebador sentido (Primer Forward )Cebador antisentido (Primer reverse)
GGTGGGGTCCAAGGTGCGAGT3´ 5´
CACGGCCCTGGGAACAATGCA 3´5´
Primers
Características ideales para un primer
• Longitud: entre 18 y 30 nucleótidos• Contenido G+C entre 40-75%• Carecer, en lo posible, de estructuras secundarias y de
complementariedad entre sí• Ambos primers deben tener temperatura de pegado
similar. Cálculo de la temperatura de annealing: [2(AxT ) + 4(CxG)] - 5• Existen programas para diseñar primers y evaluar sus
características
La ADN polimerasa• Debe ser resistente a altas temperaturas: actúan
~72°C• Existen varias: la más usada es la Taq obtenida de la
bacteria Thermophilus aquaticus (enzima termoestable)
• Actividad exonucleasa 5´ 3´• Enzima se une con alta afinidad al ADN• Necesita de primer o cebador para empezar la
reacción• Necesita de cofactores (Mg2+).
Concentración tiene efecto en especificidad y rendimiento de reacción baja concentración: bajo rendimiento, exceso: amplificaciones inespecíficas
Los desoxinucleótidos (dNTPs)
GRUPO FOSFATO
AZÚCAR
BASE NITROGENADA
• Concentración afecta especificidad y fidelidad de reacción
• Concentraciones altas: disminuye fidelidad de polimerasa y puede inhibir su actividad.
Pasos de la PCR
Desnaturalización
Pegado del primer
Extensión
Repetición de ciclos
Amplificación de fragmento determinado
Termocicladores
Tres pasos básicos
Desnaturalización
Apareamiento
Elongación
Primers complementarios
Pasos de la PCR
PCR
• Termociclador • Reacción comienza a 94ºC: puentes de H
que mantienen unidos a la doble hebra se rompen ADN molde se desnaturaliza (moléculas simple cadena)
• La temperatura es reducida a 50-60ºC: primers se hibridan en sus posiciones de pegado (annealing).
• Síntesis de ADN (expansión): a 72ºC (temperatura óptima para Taq pol)
• Primeros ciclos: grupo de productos largos se sintetiza a partir de cada cadena de ADN molde. Estos polinucleótidos tienen extremos 5´ idénticos pero extremos 3´ distintos.
• Ciclos desnaturalización – hibridación (annealing) - expansión: productos largos actúan como molde para la síntesis de ADN dando productos cortos con extremos 5’ y 3’ determinados por los sitios de pegado de los primers.
• Ciclos subsecuentes: productos cortos se acumulan (exponencialmente) hasta que uno de los componentes se agota.
1. DesnaturalizaciónRotura de puentes de H que unen desoxinucleótidos (temperatura depende de contenido de GC)
95ºC
2. AnnealingPegado de primers a secuencia targetTemperatura depende de primers: muy alta poco/nada de producto, muy baja productos inespecíficos
3’ 5’5’ 3’ADN Targetforward
reverse
40-60ºC
3. ExtensiónIncorporación de los dNTPs al extremos 3´ libre
72ºC
TAQ
dNTPs libres
Incorpora 100 nt por segundo
Extensión final 5 min: asegura que productos de amplificación estén completamente terminados
Producto
• Longitud determinada por distancia que separa sitios de pegado de primers
• Productos largos amplifican con < eficiencia (existen enzimas más eficientes para estos)
• Productos cortos pueden confundirse con dímeros de primers en un gel.
PCR
Verificación del producto de PCR en gel de agarosa
Productos de PCRMarcador de tamaño molecular
¿Por qué el número de ciclos no puede ser mayor a 40?
Efecto plateau
• Degradación de reactivos• Inactivación de la enzima• Agotamiento de reactivos
Controles de la PCR
La PCR siempre debe contar con un control positivo y uno negativo. Estos controles son necesarios para:• Comprobar que no exista contaminación en la mix de reacción
(control negativo) • Corroborar que si no existe el producto deseado, no es por un
desperfecto en la reacción (control positivo).
CONTROL NEGATIVO: se utiliza agua como molde CONTROL POSITIVO: se utiliza como molde ADN que se sabe
tiene el sitio de pegado de primers.
Falsos positivos y negativos de la PCR
• Causas de falsos positivos - CONTAMINACIÓN!!- Amplificación inespecífica
• Causas de falsos negativos- Inhibidores de la PCR en la muestra (ej. grupo hemo, heparina)
- Extracción del ADN defectuosa- Mutación en el sitio de hibridación del cebador- Baja concentración o calidad del templado- Concentración incorrecta de Mg2+ o primers
• RT-PCR• PCR anidada (Nested PCR)• Booster PCR• PCR asimétrica• PCR Multiplex• PCR Reversa• SISPA-PCR• PCR competitiva• PCR en tiempo real (Real Time PCR)
Variantes de la PCR
RT-PCR
Técnica usada para amplificar una secuencia de ácido ribonucleico (ARN).
ADN ARNTRANSCRIPCIÓN
RETROTRANSCRIPCIÓN
Pasos de la RT-PCR
ARNm
ARNm (rosa) + ADNc (azul)
Primer cadena de ADN
Síntesis de segunda cadena de ADN
PCR
RT
DEGRADACIÓN ARN
- ADN complementario es producido a partir de ARNm + dNTPs + enzima ADN polimerasa (retrotranscriptasa) + primer de ADN = oligo(dT) (5´TTTTTT3´) que se hibrida con cola poly(A) del ARNm generando ADNc.
- Luego que se completa la reacción de retrotranscripción, se realiza PCR para generar segunda cadena de ADN.
PCR anidada (Nested PCR)
Más sensible y específica. Ideal para muestras con poca
cantidad de templado.
Booster PCR
1° PCR
2° PCR con el mismo set de cebadores
Dos amplificaciones sucesivas con idéntico set de primers.
Más sensible.
PCR asimétrica
Útil para generar sondas
PCR múltiple (Multiplex)
Amplifica múltiples productos incluidos en el mismo templado
PCR reversa
Secuencia conocida
Corte con enzima de restricción
Fragmento cortado
PCR con un par de
cebadores
Sólo se conoce una secuencia de ADN para la hibridación de los 2 cebadores.
Ligació
n
Sequence Independent Single Primer Amplification
(SISPA) PCR
Sirve para amplificar fragmentos de ADN de secuencia desconocida.
Utiliza primers adaptadores.
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