q-pcr y expresión de genes jenny acevedo. se diferencia de la pcr convencional en que permite...

Q-PCR y Expresión de Genes

Jenny Acevedo

Se diferencia de la PCR convencional en que permite monitorizar en cada ciclo la aparición del ADN producto de la reacción mediante el uso de fluoróforos.

Cada vez que se realiza una copia del ADN molde se libera fluorescencia, por lo que ésta es proporcional a la cantidad de ADN generado.

PCR en Tiempo Real

Estudiantes se familiaricen con la Técnica del qPCR

Estudiantes participaran en una investigacion biológica.

Analizaran datos de qPCR y haran conclusiones Participaran en investigacion cientifica en forma

independiente y en colaboración. Desarrollo del pensamiento crítico y solución de

problemas en la investigación biológica. Experimentar los exitos y fracasos del lab en

investigación dirigida.

Objetivos

Entender los conceptos del qPCR y el procedimiento experimental.

Analizar los resultados obtenidos para cada gen amplificado.

Metas

La abeja de miel Apis mellifera es un insecto social y representa un modelo clave para estudios de comportamiento. Primer insecto Hymenoptera que tiene su genoma completo secuenciado.

(The Honey Bee Genome Sequencing Consortium, 2006).

Apis mellifera

El nivel de expresión de los genes está relacionado con las niveles de proteínas. Cuando un organismo requiere determinadas proteínas (una sobre-producción temporal de adrenalina por ejemplo), los genes que intervienen en su síntesis alteran su expresión, pudiendo incrementarla (sobre-expresarse) o reducirla (inhibirse). Estos cambios de expresión también se observan en dependencia del tipo de tejido en que actúan, del tiempo transcurrido, del estado del tejido, etc.

Expresión Génica

Cuantificacion de la Amplificación en Tiempo Real

Analisis de la cinetica de la reacción, lo que permite:

Detección del producto en cada ciclo de la reacción.

Q-RT-PCR

Determinar cambios en la expresión genética en cerebros de abejas relacionados con cambios en el comportamiento de defensa (agresividad).

Grupo Experimental 1: Variación en niveles de Expresión Genetica entre abejas inducidas o tratadas vs abejas naive (sin ningún tipo de manipulación).Expresión genética transitoria: inducida por la

manipulación experimental:

Diseño Experimental

Determinar si, los diferentes niveles de sensibilidad de las abejas (Apis mellifera) expuestas al tratamiento estan correlacionadas con diferentes niveles de expresión.

Grupo Experimental 2 Variación en niveles de Expresion Genetica: Abejas que se les indujo comportamiento agresivo,

mediante aplicación de diferentes voltajes de corriente eléctrica (rangos de variación: 12, 8, 8, 6, 4 volt).

Abejas sensitivas-respuesta tempranaAbejas resistentes –respuesta tardiaAbejas sensibilidad media- respuesta intermediaBuscar correlación de expresión genética de acuerdo al rango de respuesta (sensibilidad)

Diseño Experimental

RNA total, obtenido del cerebro de abejas 5 abejas (tratamiento) 3 abejas (control-

Naive) Conversion del RNA a cDNA. Diseño de Primers de genes candidatos: Gene RPS5- HKG- 5HT-Seratonina, Melatonina TpH, Dopamina, Octopamina ND-20Like, ND-51 PCR plates SYBR Green –Master Mix, agua ultrapura.

Materiales y Metodos

Los genes de referencia pueden mostrar similares niveles de RNA mensajero en diferentes estados del desarrollo de un organismo y no variar en abundancia en respuesta a factores ambientales o tratamientos experimentales. Se usan porque suelen permanecer constantes.RPS5-HKG

Genes de Referencia o

Housekeeping gen

PCR a tiempo real se visualizan en un gráfico de amplificación.Expresa la fluorescencia leída por el equipo en el eje de las ordenadas y el número de ciclos de la PCR en el eje de las abscisas.Mientras mayor cantidad del ADN blanco haya en una muestra, menor el numero de ciclos (Ct) que se requiere para alcanzar este umbral.

Amplificación

Threshold

BasalControl Negativo

Ct

ΔRn

Muestra

Número de ciclos

Línea base

(baseline)

• Nivel basal de la fluorescencia emitida• Definido durante los primeros ciclos de la PCR• Programada en cada software de PCR en

tiempo real

Umbral

(threshold)

• Es el punto de corte de la fluorescencia por encima de la línea base

• A partir de esta línea de corte se calcula los valores de Ct

Ct o CP

(threshold

cycle)

• Refleja el punto en el cual un numero suficiente de amplicones se ha acumulado dentro de la reacción y se presenta un crecimiento exponencial

Los productos mas pequeños se amplifican con mayor eficiencia que los productos grandes

Factores que lo limitan: cantidad de primer disponible, la actividad de la enzima

Eficiencia

CALCULOS•Los valores de Ct tanto del HKG como del gen de interes son normalizadas.•Se obtiene un ∆Ct tanto del HKG como del gen de interes.•Metodo conocido como 2-∆∆Ct

Donde: ∆∆Ct = ∆Ct,sample - ∆Ct,reference

•Fold change (cambio en incremento) = Efficiency-∆∆Ct or 2-∆∆Ct

(obteniendose la expresión relativa del gen)

Analiza los cambios relativos en la cantidad de transcritos se elige como patrón un transcrito de referencia que no varíe su expresión en los tratamientos a analizar, normalmente un gen de mantenimiento (housekeeping). Comparando los Ct del gen de referencia con el gen de interés en muestras tratadas y sin tratar, se pueden determinar cambios relativos en la expresión del gen de interés.

Cuantificación Relativa

Identifica productos específicos de qPCR mediante el análisis de las curvas de la temperatura de fusión (melting curve).

Para discriminar los productos específicos de la PCR es necesario saber que estos se disocian a una temperatura más alta que los artefactos como Dímeros de cebadores (primer dimers).

Análisis de la curva de la temperatura de fusión

Curva de disociación

Example: Presence of Primer Dimers

Melt Curve Analysis

Curva de denaturación

Factores limitantes de la Eficiencia

Problemas

Los cambios en los niveles de expresión de los genes pueden tener profundos efectos en las funciones biológicas en las que participan, pudiendo llegar a ser los principales causantes de alteraciones fisiológicas y procesos patológicos.

Algunos genes se sobre-expresan (sus niveles son mayores de lo normal) y otros se inhiben (niveles menores que lo normal, pero la mayor parteparte de los genes no cambian su expresion

Importancia