pruebas de resistencia bacteriana
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PRUEBAS DE PRUEBAS DE
RESISTENCIA RESISTENCIA
BACTERIANABACTERIANABUSQUEDA Y BUSQUEDA Y
CONFIRMACIONCONFIRMACIONGLORIA D. PACHECO S.
Especialista de Producto BD Diagnosticsgloria_pacheco@bd.com
Cel: 315-7920177
BACILOS GRAM BACILOS GRAM
NEGATIVOSNEGATIVOS
BGNBGN
ESBLsESBLsββ-Lactamasas de Espectro -Lactamasas de Espectro
ExtendidoExtendido Inicialmente se encontraron:Inicialmente se encontraron:
Klebsiella, E. coliKlebsiella, E. coli También se encuentran en:También se encuentran en:
Proteus, SerratiaProteus, Serratia Enterobacter, SalmonellaEnterobacter, Salmonella MorganellaMorganella, etc., etc.
Son inhibidas por el Ácido Clavulanico Son inhibidas por el Ácido Clavulanico y Tazobactam (menos por Sulbactam).y Tazobactam (menos por Sulbactam).
ESBLsESBLsββ-Lactamasas de Espectro -Lactamasas de Espectro
ExtendidoExtendido
Principales Familias de ESBLsPrincipales Familias de ESBLs
TEM-3, 4 …………………. 137TEM-3, 4 …………………. 137 SHV-2, 3 …………………. 54SHV-2, 3 …………………. 54 CTX-M-1, 2 ……………… 37CTX-M-1, 2 ……………… 37 Otras Familias y ESBLs individualesOtras Familias y ESBLs individuales
Por quPor quéé la Prueba de la Prueba de ββ--Lactamasas? Lactamasas?
Terapia CorrectaTerapia Correcta Los puntos de corte no detectan con Los puntos de corte no detectan con
seguridad nuevas seguridad nuevas ββ-Lactamasas-Lactamasas Control de la InfecciónControl de la Infección Identificar las Drogas que causan Identificar las Drogas que causan
ResistenciaResistencia
DETECCION DE ESBLsDETECCION DE ESBLsDOS ENFOQUESDOS ENFOQUES
Pruebas de Screening y Pruebas Pruebas de Screening y Pruebas Confirmatorias para Screen PositivosConfirmatorias para Screen Positivos
Pruebas ConfirmatoriasPruebas Confirmatorias
DETECCION DE ESBLsDETECCION DE ESBLs
PRUEBAS DE SCREENINGPRUEBAS DE SCREENING
Ventajas:Ventajas: Menos TrabajoMenos Trabajo EconómicaEconómica
Desventajas:Desventajas: Sensibilidad < 100%Sensibilidad < 100% Demoran la ConfirmaciónDemoran la Confirmación Se deben reportar Screen positivos?Se deben reportar Screen positivos?
PRUEBA CONFIRMATORIA CLSIPRUEBA CONFIRMATORIA CLSIKlebsiella, E. coli y P. mirabilisKlebsiella, E. coli y P. mirabilis
Prueba MIC:Prueba MIC: Cefotaxime y Ceftazidime +/- 4 Cefotaxime y Ceftazidime +/- 4 μμg/ml g/ml
Clavulanato:Clavulanato: Disminución de Disminución de >> 3 doble diluciones de 3 doble diluciones de
cualquiera de los dos antibióticos.cualquiera de los dos antibióticos. e.j.: Cefotaxime e.j.: Cefotaxime 8 8 μμg/mlg/ml Cefotaxime + Clavulanato Cefotaxime + Clavulanato 1 1 μμg/mlg/ml
Prueba de Disco:Prueba de Disco: Cefotaxime y Ceftazidime +/- 10 Cefotaxime y Ceftazidime +/- 10 μμg Clavulanatog Clavulanato Incremento en el halo de inhibición de Incremento en el halo de inhibición de >> 5 mm. 5 mm.
Método de Disco
Método de Doble Disco
CLSI – RECOMENDACIONES CLSI – RECOMENDACIONES EL REPORTEEL REPORTE
Confirmar ESBLs:Confirmar ESBLs: E. coli, Klebsiella, P. mirabilisE. coli, Klebsiella, P. mirabilis
Reportar Resistente:Reportar Resistente:
Todas las PenicilinasTodas las Penicilinas
CefalosporinasCefalosporinas
Aztreonam Aztreonam
Independiente del resultado “Independiente del resultado “in vitroin vitro””
Excepto Cefamicinas (e.j.: Cefoxitina, Excepto Cefamicinas (e.j.: Cefoxitina, Cefotetan) Cefotetan)
ESBLs en microorganismos diferentes ESBLs en microorganismos diferentes
de: de:
Klebsiella, E. coli y P. mirabilisKlebsiella, E. coli y P. mirabilis
La mayoría de Laboratorios no intentan La mayoría de Laboratorios no intentan detectar ESBLs en microorganismos detectar ESBLs en microorganismos diferentes de diferentes de E. coliE. coli y y KlebsiellaKlebsiella
Dos indicaciones para la prueba de ESBLs en Dos indicaciones para la prueba de ESBLs en otros microorganismos:otros microorganismos: ESBLs detectada en ESBLs detectada en Klebsiella, E. coli y P. mirabilisKlebsiella, E. coli y P. mirabilis Fenotipo sospechosoFenotipo sospechoso
Cual prueba?Cual prueba? Usar una prueba especifica (confirmatoria)Usar una prueba especifica (confirmatoria)
DIFICULTADES EN LA DIFICULTADES EN LA PRUEBA DE ESBLsPRUEBA DE ESBLs
EFECTO DEL INOCULOEFECTO DEL INOCULOMICs en MICs en g/ml: SHV-3 producida por g/ml: SHV-3 producida por Citrobacter freundiiCitrobacter freundiiInocul.Inocul.
CFU/mlCFU/mlCefotaximeCefotaxime CeftazidimeCeftazidime AztreonamAztreonam CefepimeCefepime
5 x 105 x 1055 22 11 0.50.5 0.50.5
(CLSI breakpoint 8 g/ml)
DIFICULTADES EN LA PRUEBA DIFICULTADES EN LA PRUEBA DE ESBLsDE ESBLs
EFECTO DEL INOCULOEFECTO DEL INOCULO
MICs en MICs en g/ml: SHV-3 producida por g/ml: SHV-3 producida por Citrobacter freundiiCitrobacter freundiiInocul.Inocul.
CFU/mlCFU/mlCefotaximeCefotaxime CeftazidimeCeftazidime AztreonamAztreonam CefepimeCefepime
5 x 5 x 101055
22 11 0.50.5 0.50.5
5 x 5 x 101077
256256 3232 3232 >1024>1024
(CLSI breakpoint 8 g/ml)
DIFICULTADES EN LA DIFICULTADES EN LA PRUEBA DE ESBLsPRUEBA DE ESBLs
Recomendación Recomendación ((nono Aprobadas por Aprobadas por CLSICLSI):): Extender la recomendación de Extender la recomendación de reporte del CLSI a todos los reporte del CLSI a todos los microorganismos productores de ESBLsmicroorganismos productores de ESBLs
Reportar todos microorganismos Reportar todos microorganismos productores de ESBLs por la misma vía: productores de ESBLs por la misma vía: resistente a todas las Penicilinas, resistente a todas las Penicilinas, Cefalosporinas y AztreonamCefalosporinas y Aztreonam
DIFICULTADES LA PRUEBA DIFICULTADES LA PRUEBA DE ESBLsDE ESBLs
Alto nivel de expresión of AmpC puede Alto nivel de expresión of AmpC puede impedir el reconocimiento de una ESBLsimpedir el reconocimiento de una ESBLs
Problema in especies que producen Problema in especies que producen ββ--lactamasa AmpC inducible codificada lactamasa AmpC inducible codificada cromosómicamente (e.j. cromosómicamente (e.j. Enterobacter, Enterobacter, Serratia, Providencia, etc.)Serratia, Providencia, etc.)
Problema en Problema en E. coliE. coli y y K. pneumoniaeK. pneumoniae que que adquiere plasmidos de AmpCadquiere plasmidos de AmpC
Clavulanato puede actuar como un inductor de Clavulanato puede actuar como un inductor de alto nivel de AmpC e incrementar resistencia a alto nivel de AmpC e incrementar resistencia a las drogas de screening dando las drogas de screening dando falsos falsos negativosnegativos en la prueba confirmatoria - ESBL en la prueba confirmatoria - ESBL
ββ--Lactamasa AmpC Lactamasa AmpC
SPACE
- Serratia- Providencia/P. aeruginosa- Aeromonas- Citrobacter freundii- Enterobacter, Hafnia
• CefalosporinasaCefalosporinasa
• Hidroliza todos los antibióticos Hidroliza todos los antibióticos ββ--lactlactáámicos micos excepto Carbapenems y Cefepimeexcepto Carbapenems y Cefepime
• No son Inhibidos por Clavulanato y SulbactamNo son Inhibidos por Clavulanato y Sulbactam
• Algunas son induciblesAlgunas son inducibles
• Características de ciertos géneros:Características de ciertos géneros:
AmpCs Mediada por AmpCs Mediada por PlPláásmidossmidos
Klebsiella, E. coli, Salmonella, P. mirabilisKlebsiella, E. coli, Salmonella, P. mirabilisMuchas enzimas, algunas son induciblesMuchas enzimas, algunas son induciblesPrevalencia es baja pero se esta Prevalencia es baja pero se esta incrementandoincrementando Aprox. 1/3 de laboratorios U.S.Aprox. 1/3 de laboratorios U.S. 3.3 – 8.5% 3.3 – 8.5% K. pneumoniae K. pneumoniae en USAen USA
DIFICULTADES EN LA DIFICULTADES EN LA PRUEBA DE ESBLsPRUEBA DE ESBLs
Abordaje en la detección ESBL en Abordaje en la detección ESBL en cepas productoras de AmpCcepas productoras de AmpC Uso Tazobactam o Sulbactam en lugar de Uso Tazobactam o Sulbactam en lugar de
Clavulanato en Prueba Confirmatoria ESBL Clavulanato en Prueba Confirmatoria ESBL porque hay menos probabilidad de inducir porque hay menos probabilidad de inducir producción AmpCproducción AmpC
Incluir Cefepime como antibiótico de screening Incluir Cefepime como antibiótico de screening porque a alto nivel de expresión de AmpC tiene porque a alto nivel de expresión de AmpC tiene un efecto mínimo en la actividad de Cefepimeun efecto mínimo en la actividad de Cefepime
Incluir Cefamicinas (Cefoxitina) como Incluir Cefamicinas (Cefoxitina) como antibiótico de screening porque las Cefamicinas antibiótico de screening porque las Cefamicinas son hidrolizadas por AmpCs pero no por ESBLsson hidrolizadas por AmpCs pero no por ESBLs
Diferencias entre Diferencias entre ββ-- Lactamasas Lactamasas
ESBLs y AmpCESBLs y AmpCResultados Prueba ESBL AmpCInhibida Clavulanato Si No
Hidroliza: -Cefalosporinas Si (R) Si (R)
-Cefamicinas No (S) Si (R)
-Cefepime Si (R) No (S)
Cuando Sospechar AmpC Cuando Sospechar AmpC PlasmídicaPlasmídica
Prueba de Disco para β-lactamasa AmpC debe ser Prueba de Disco para β-lactamasa AmpC debe ser realizada en aislamientos derealizada en aislamientos de E. coli, Klebsiella spp, E. coli, Klebsiella spp, P. mirabilis, SalmonellaP. mirabilis, Salmonella positivos en alguno de los positivos en alguno de los siguientes screens:siguientes screens: Cefoxitina-no susceptible (i.e. I o R)Cefoxitina-no susceptible (i.e. I o R)
Screen ESBL - positivo pero prueba confirmatoria ESBL es Screen ESBL - positivo pero prueba confirmatoria ESBL es
negativa negativa
Ceftazidima y Cefoxitina I o R (e.j. MIC Ceftazidima y Cefoxitina I o R (e.j. MIC >> 16 µg/ml para 16 µg/ml para
ambas drogas) y prueba confirmatoria ESBL negativa ambas drogas) y prueba confirmatoria ESBL negativa
(este Screen puede tener buena especificidad)(este Screen puede tener buena especificidad)
Como determinar si ambas: Como determinar si ambas: AmpC y ESBL están AmpC y ESBL están
presentespresentes
Prueba de Difusión de Doble Prueba de Difusión de Doble DiscoDisco Mirar el tipo de patrón AmpC mMirar el tipo de patrón AmpC máás s
el efecto del Ácido Clavulanicoel efecto del Ácido Clavulanico
E. coli con E. coli con AmpC mediada AmpC mediada por por plasmidosplasmidos
Prueba de Disco - AmpCPrueba de Disco - AmpC
Cultivo :Cultivo : E. coli E. coli ATCC 25922ATCC 25922
Microorganismo a EnsayarMicroorganismo a Ensayar en discoen disco
S. marcescens con S. marcescens con AmpC AmpC CromosomalCromosomal y ESBLy ESBL
Recomendaciones para el LaboratorioRecomendaciones para el Laboratorio• Los Laboratorios deben marcar todos organismos Los Laboratorios deben marcar todos organismos
conocidos que poseen conocidos que poseen ß-ß-lactamasas inducibles (S/IB)lactamasas inducibles (S/IB)• Ejemplo de Pie de nota: Ejemplo de Pie de nota:
“ “Este microorganismo se conoce que poseen Este microorganismo se conoce que poseen ß-ß-
lactamasas inducibles. Estos aislamientos pueden lactamasas inducibles. Estos aislamientos pueden desarrollar resistencia a todas las cefalosporinasdesarrollar resistencia a todas las cefalosporinas después de iniciar la terapia. después de iniciar la terapia. Evitar el uso de antibioticos Evitar el uso de antibioticos ß-lactamicos.”ß-lactamicos.”
Bush Group 1 o AmpCBush Group 1 o AmpC ββ--Lactamasas InduciblesLactamasas Inducibles
Cto. deCto. de: : Enterobacter cloacaeEnterobacter cloacae – – Este Este microorganismo se conoce que posee microorganismo se conoce que posee ß-ß-lactamasas inducibles. Los aislamientos puede lactamasas inducibles. Los aislamientos puede comenzar a presentar resistencia a todas las comenzar a presentar resistencia a todas las CefalosporinasCefalosporinas después de iniciar la terapia. después de iniciar la terapia. Evitar el uso de antibióticos ß-lactamicos.Evitar el uso de antibióticos ß-lactamicos.
AmikacinaAmikacina SS AmpicilinaAmpicilina RR CefazolinaCefazolina RR CeftazidimaCeftazidima SS CefepimeCefepime SS CeftriaxonaCeftriaxona SS GentamicinaGentamicina SS LevofloxacinaLevofloxacina SS
AmpC Cromosomal queAmpC Cromosomal que nono Expresa Alto Nivel de Expresa Alto Nivel de
ResistenciaResistencia
Cto. deCto. de: : Enterobacter cloacaeEnterobacter cloacae - - Este Este microorganismo se conoce que posee microorganismo se conoce que posee ß-ß-lactamasas inducibles. Los aislamientos puede lactamasas inducibles. Los aislamientos puede comenzar a presentar resistencia a todas las comenzar a presentar resistencia a todas las CefalosporinasCefalosporinas después de iniciar la terapia. después de iniciar la terapia. Evitar el uso de antibióticos ß-lactamicos.Evitar el uso de antibióticos ß-lactamicos.
AmikacinaAmikacina SS AmpicilinaAmpicilina RR CefazolinaCefazolina RR CeftazidimaCeftazidima RR CefepimeCefepime SS CeftriaxonaCeftriaxona RR GentamicinaGentamicina SS LevofloxacinaLevofloxacina SS
AmpC Cromosomal queAmpC Cromosomal que sisi Expresa Alto Nivel ResistenciaExpresa Alto Nivel Resistencia
Growth ofGrowth of: : Enterobacter cloacaeEnterobacter cloacae
AmikacinaAmikacina SS AmpicilinaAmpicilina RR CefazolinaCefazolina RR CeftazidimaCeftazidima RR CefepimeCefepime SS CeftriaxonaCeftriaxona RR GentamicinaGentamicina SS Levofloxacina Levofloxacina SS
AmpC Cromosomal queAmpC Cromosomal que sisi Expresa Alto Nivel ResistenciaExpresa Alto Nivel Resistencia
Growth ofGrowth of: : Enterobacter cloacae Enterobacter cloacae
AmikacinaAmikacina SS AmpicillinAmpicillin RR CefazolinCefazolin RR CeftazidimeCeftazidime II CefepimeCefepime SS CeftriaxoneCeftriaxone SS GentamicinGentamicin SS Levofloxacin Levofloxacin SS
AmpC Cromosomal queAmpC Cromosomal que eses Sospechosa de ESBLsSospechosa de ESBLs
E. cloacae con E. cloacae con AmpCAmpC Cromosomal y ESBLCromosomal y ESBL
Cto. deCto. de: : Enterobacter cloacaeEnterobacter cloacae – – Este Este microorganismo posee una ESBL. Se microorganismo posee una ESBL. Se rquiere Aislamiento de Contacto.rquiere Aislamiento de Contacto. AmikacinaAmikacina SS CefazolinCefazolin RR AmpicillinAmpicillin RR CeftazidimeCeftazidime RR CefepimeCefepime RR CeftriaxoneCeftriaxone RR GentamicinGentamicin SS Levofloxacin Levofloxacin SS
AmpC Cromosomal que AmpC Cromosomal que eses Sospechosa de ESBLSospechosa de ESBL
K. pneumoniae con ESBL, AmpC y K. pneumoniae con ESBL, AmpC y CarbapenemasaCarbapenemasa
Microorganismos intrínsicamente Microorganismos intrínsicamente menos susceptiblesmenos susceptibles – – Acinetobacter Acinetobacter spp., P. aeruginosaspp., P. aeruginosa
Alta AmpC + permeabilidad reducidaAlta AmpC + permeabilidad reducidaClase A carbapenemasas (KPC,…)Clase A carbapenemasas (KPC,…)Clase B metalo-β-lactamasas (IMP,…)Clase B metalo-β-lactamasas (IMP,…)
Resistencia a Resistencia a CarbapenemsCarbapenems
COCOS GRAM COCOS GRAM POSITIVOSPOSITIVOS
CGPCGP
Staphylococcus aureusStaphylococcus aureus Meticilina Resistente Meticilina Resistente
(MRSA)(MRSA) Incidencia incrementando en Incidencia incrementando en
hospitales especialmente en ICU o en hospitales especialmente en ICU o en pacientes con quimioterapiapacientes con quimioterapia
Están comenzando a aparecer cepas Están comenzando a aparecer cepas Vancomicina Intermedia y ResistenteVancomicina Intermedia y Resistente
Esta Emergiendo MRSA adquirido en Esta Emergiendo MRSA adquirido en la comunidad (CA-MRSA) que aparece la comunidad (CA-MRSA) que aparece susceptible a muchos agentes oralessusceptible a muchos agentes orales
El nuevo El nuevo Staphylococcus Staphylococcus aureusaureus Meticilino Meticilino
Resistente Adquirido en Resistente Adquirido en la Comunidad la Comunidad
CA-MRSACA-MRSA
Propiedades Distintivas CA-Propiedades Distintivas CA-MRSAMRSA
Resistente solamente a Meticilina Resistente solamente a Meticilina con Resistencia cruzada solamente a con Resistencia cruzada solamente a otros otros ßß-lactamicos-lactamicos
Asoc. con Síndromes semejando a los Asoc. con Síndromes semejando a los causados por MSSAcausados por MSSA
Puede causar Infecciones Serias Puede causar Infecciones Serias (fatales)(fatales)
Mongkolrattanothai K et al. CID 37:1050, 2003 Hiramatsu K, Daum R: ICCAC (48) CA-MRSA: A Worldwide Reality?, 2003
Propiedades del CA-Propiedades del CA-MMRSARSA Susceptibles a mas antibióticos que HA-MRSASusceptibles a mas antibióticos que HA-MRSA SCCmec IV o V (raramente que el I-III)SCCmec IV o V (raramente que el I-III)
PequeñosPequeños Mas móvilMas móvil
Muchos aislamientos expresan Panton-Valentine Muchos aislamientos expresan Panton-Valentine Leukocidin (PVL)Leukocidin (PVL) Potente toxina asociada con furunculosisPotente toxina asociada con furunculosis
No se conocen factores de riesgo en personal de No se conocen factores de riesgo en personal de cuidado de la saludcuidado de la salud
Es mas común las Infecciones de Piel y Tejidos Es mas común las Infecciones de Piel y Tejidos blandos, ocasionalmente neumonía necrotizanteblandos, ocasionalmente neumonía necrotizante
Manifestaciones CA-Manifestaciones CA-MRSAMRSA
Neumonía Necrotizante Neumonía Necrotizante OsteomielitisOsteomielitis AbscesosAbscesos EmpiemaEmpiema Fascitis NecrotizanteFascitis Necrotizante Tromboflebitis SépticaTromboflebitis Séptica Sepsis SeveraSepsis Severa
Clindamicina - Oral es el agente que se ha Clindamicina - Oral es el agente que se ha redescubierto para Infecciones por CA-MRSA redescubierto para Infecciones por CA-MRSA
CA-MRSA la prueba es usualmente susceptible CA-MRSA la prueba es usualmente susceptible a Clindamicinaa Clindamicina
El problema es cuando el microorganismos El problema es cuando el microorganismos tiene una prueba de susceptibilidad: tiene una prueba de susceptibilidad: Eritromicina-R y Clindamicina-SEritromicina-R y Clindamicina-S
Algunas cepas pueden tener Resistencia Algunas cepas pueden tener Resistencia InducibleInducible
CA-MRSA Opciones de CA-MRSA Opciones de TratamientoTratamiento
Eritromicina / Eritromicina / ClindamicinaClindamicina
MecanismoMecanismo DeterminaDeterminantente
EritroEritro ClindaClinda
EflujoEflujo msrmsrAA RR SS
Alteración Alteración RibosomalRibosomal
ermerm RR SS**
Alteración Alteración RibosomalRibosomal
ermerm RR RRconstitutivaconstitutiva
msrA = Resistencia a Macrólidos y Streptograminaerm = Eritromicin-metilasa ribosomal* Exige Inducción para mostrar la resistencia
Staphylococcus spp. Staphylococcus spp. Staphylococcus spp. Staphylococcus spp.
Staphylococcus Staphylococcus aureusaureus
ClindamicinaClindamicina SS
Eritromicina R
OxOxacilinaacilina RR
PenicilinaPenicilina R R
VancomicinaVancomicina S S
Si Clindamicina - S y Eritromicina - R, No se debe reportar Clindamicina - S sin realizar el “Test D”
Estrategia Opcional de Estrategia Opcional de InformeInforme
Staphylococcus aureus
EritromicinaEritromicina R R
OxacilinaOxacilina R R
Penicilina Penicilina R R
Vancomicina Vancomicina SS
““Contactar al Laboratorio si se necesita el resultado de Clindamicina””
““Test D” –Test D” – Reacción Reacción PositivaPositiva
15 - 26 mm
Resistencia Inducible a Clindamicina (mediada-erm)
Antibiograma por Difusión de Disco:
Colocar discos de 2 g Clindamicina y 15 g Eritromicina a una distancia de borde a borde de 15 mm a 26 mm.
““Test D” Positivo -Test D” Positivo - Comentario opcionalComentario opcional
Staphylococcus aureus
Clindamicina R Eritromicina R
Oxacilina R Penicilina R Vancomicina S
“ Este S. aureus se presume ser resistente, basado en la detección de Resistencia Inducible a Clindamicina ”.
““Test D” –Test D” – Reacción Reacción NegativaNegativa
NO hay Inducción
(Resistencia a Eritromicina:
Mediada por gen msrA)
““Test D” Negativo -Test D” Negativo - Comentario opcionalComentario opcional
Staphylococcus aureusClindamicina S
Eritromicina R Oxacilina R Penicilina R Vancomicina S
“Este S. aureus NO demuestra Resistencia Inducible in vitro a Clindamicina.”
Problemas con la Problemas con la Detección de MRSA en el Detección de MRSA en el
LaboratorioLaboratorio Sistemas Automatizados no siempre son confiablesSistemas Automatizados no siempre son confiables Se recomienda la placa de Oxacilina Screening Se recomienda la placa de Oxacilina Screening
para realizar en todos los Staphylococcus aureus para realizar en todos los Staphylococcus aureus identificados en Sistemas Automatizadosidentificados en Sistemas Automatizados
Método de Difusión de Disco pueden aparecer Método de Difusión de Disco pueden aparecer como susceptibles (zona de inhibición alrededor como susceptibles (zona de inhibición alrededor del disco de Oxacilina)del disco de Oxacilina) Se debe examinar muy bien para estar seguros de que Se debe examinar muy bien para estar seguros de que
no hay crecimiento de colonias pequeñas o un no hay crecimiento de colonias pequeñas o un crecimiento tenue dentro del halo de inhibición. crecimiento tenue dentro del halo de inhibición.
Métodos Recomendados Métodos Recomendados para la Detección de para la Detección de
MRSAMRSA
Realizar pruebas de Realizar pruebas de mecmecA o PBP 2a, A o PBP 2a, refiere discrepancias (costosas, refiere discrepancias (costosas, técnicamente difícil) técnicamente difícil)
Realizar Prueba modificada de disco Realizar Prueba modificada de disco de Cefoxitina (2004)de Cefoxitina (2004)
MIC (µg/ml): S I
RS. aureus 2 - 4CoNS 0.25 - 0.5
DD (mm): R I S
S. aureus 10 11-12 13
CoNS 17 - 18
M100-S17(M2, M7); Table 2C
StaphylococcusStaphylococcus spp. - spp. - OxacilinaOxacilina
StaphylococcusStaphylococcus spp. - spp. - OxacilinaOxacilina
RESISTENCIA A RESISTENCIA A
OXACILINAOXACILINA
Método: Oxacillin Screen AgarMétodo: Oxacillin Screen Agar Agar Mueller Hinton con 4% de NaCl y Agar Mueller Hinton con 4% de NaCl y
66g/ml de Oxacilina. g/ml de Oxacilina. Suspensión bacteriana 0.5 McFarland, Suspensión bacteriana 0.5 McFarland,
de esta dilución se toma 10 de esta dilución se toma 10 l para l para sembrar sobre el agar.sembrar sobre el agar.
No se recomienda para Estafilococos No se recomienda para Estafilococos Coagulasa Negativa.Coagulasa Negativa.
STAPHYLOCOCCUS AUREUS
Staphylococcus Staphylococcus spp.spp.
• ““Los resultados de la Prueba de Los resultados de la Prueba de
Difusión de Disco Difusión de Disco concon Cefoxitina de 30 g
debe ser usados para predecir la debe ser usados para predecir la
Resistencia mediada porResistencia mediada por gen mecA
– en – en StaphylococcusStaphylococcus.”.”
M100-S17(M2, M7); Table 2CM100-S17(M2, M7); Table 2C
Disco de Cefoxitina – Detección Disco de Cefoxitina – Detección
de gen mecA de gen mecA - Staphylococcus - Staphylococcus
spp.spp.Mecanismo de R a Mecanismo de R a OxacilinaOxacilina
S. S. aureusaureus
SCoNSCoN
Producción de PBP Producción de PBP 2a (gen mecA)2a (gen mecA)
++ ++
HiperproduciHiperproducióón de n de Beta-LactamasaBeta-Lactamasa
++ --
Alteración de PBPs Alteración de PBPs preexistentespreexistentes
++ --
Screen - Difusión de Disco para Screen - Difusión de Disco para
Resistencia Resistencia
mediada por gen mediada por gen mecmecA en A en
StaphylococcusStaphylococcus:: Reemplazar disco de Oxacilina por disco Reemplazar disco de Oxacilina por disco
de Cefoxitinade Cefoxitina Realizar Método Estándar de Difusión de Realizar Método Estándar de Difusión de
Disco con disco deDisco con disco de Cefoxitina Cefoxitina (30 (30 g).g). Incubar por 24 h. Los resultados pueden Incubar por 24 h. Los resultados pueden
ser reportados después de 18 h, si ser reportados después de 18 h, si sonson resistenteresistentes.s.
Reportar el resultado para Reportar el resultado para OXACILINAOXACILINA, no , no para Cefoxitina.para Cefoxitina.
Screen – Screen – DiluciónDilución (MIC) para (MIC) para
ResistenciaResistencia
mediada por gen mediada por gen mecmecA en A en
StaphylococcusStaphylococcus:: Continuar usando Oxacilina y sus puntos de Continuar usando Oxacilina y sus puntos de corte:corte: S. aureus (S ≤ 2 y R ≥ 4)S. aureus (S ≤ 2 y R ≥ 4) SCoN (S ≤ 0.25 y R ≥ 0.5)SCoN (S ≤ 0.25 y R ≥ 0.5)
En SCoN de Infecciones severas:En SCoN de Infecciones severas: Si MIC =0.5 – 2 Si MIC =0.5 – 2 g/mL – Realizar prueba por g/mL – Realizar prueba por
difusion con Disco Cefoxitina (30 difusion con Disco Cefoxitina (30 g), si la g), si la cepa es sensible a Cefoxitina informar el cepa es sensible a Cefoxitina informar el resultado como S a resultado como S a OXACILINAOXACILINA, no para , no para Cefoxitina.Cefoxitina.
Screen - Difusión de Disco para Resistencia Screen - Difusión de Disco para Resistencia
mediada por gen mediada por gen mecmecA en StaphylococcusA en Staphylococcus::
Cefoxitina zona (mm)
S. aureus y 21* 22**
S. lugdunensis
CoNS 24* 25**
* Reportar como Oxacilina resistente
** Reportar como Oxacilina Susceptible
CoNS: Estafilococos Coagulasa Negativa
M100-S17 (M2, M7); Table 2C
Reporte de Resultados del MIC - Reporte de Resultados del MIC - OxacilinaOxacilina Estafilococos Coagulasa-Estafilococos Coagulasa-
Negativa Negativa **
**Probar con cepas diferentes de Probar con cepas diferentes de S. epidermidisS. epidermidis de sitios estériles de sitios estériles
MIC Oxacilina (g/ml)
0.5 - 2
>=4
ReportarOxacilina Susceptible
RealizarPrueba mecA o PBP 2a
Negativa
Positiva
Reportar Oxacilina Susceptible
ReportarOxacilina Resistente
Reportar Oxacilina Resistente
Reporte de Resultados DD - Reporte de Resultados DD - OxacilinaOxacilina
Estafilococos Coagulasa-Estafilococos Coagulasa-Negativa Negativa **
* Probar con cepas diferentes de S. epidermidis de sitios estériles
Oxacilina zona (mm)
<=17
ReportarOxacilina Susceptible
Realizar La Prueba mecA o PBP 2a
Negativa
Positiva
ReportarOxacilina Susceptible
Reportar Oxacilina Resistente
El Problema - CríticoEl Problema - Crítico
Vancomicina sigue siendo una droga Vancomicina sigue siendo una droga importante por no sólo tratar importante por no sólo tratar Infecciones por Staphylococcus Infecciones por Staphylococcus aureus, Staphylococcus Coagulasa-aureus, Staphylococcus Coagulasa-negativa, Neumococos, y una variedad negativa, Neumococos, y una variedad de otros organismos Gram Positivos.de otros organismos Gram Positivos.
Es Es muy importantemuy importante descubrir la descubrir la Resistencia Emergente a Vancomicina.Resistencia Emergente a Vancomicina.
Criterios de Interpretación de la Criterios de Interpretación de la CLSICLSI Vancomicina y Vancomicina y Staphylococcus sppStaphylococcus spp..
Vancomicina Susceptible Intermedio Resistente
MIC (μg/ml) Disco (30 g)
4
15 mm
8 – 16
ND
32
ND
ND= no definido
VISA VRSA
Criterio 2006 <2 4 - 8 >16
VISA Fenotipo vs. VRSA VISA Fenotipo vs. VRSA GenotipoGenotipo
Las cepasLas cepas VISAVISA representan un frepresentan un fenotipoenotipo que que probablemente resulta de mutaciones en varias vías probablemente resulta de mutaciones en varias vías genéticas, que bajo larga presión con Vancomicina genéticas, que bajo larga presión con Vancomicina produce:produce: Paredes celulares alteradas, Paredes celulares alteradas, Cambios en las vías metabólicas, Cambios en las vías metabólicas, Lento crecimiento.Lento crecimiento.
En las cepasEn las cepas VRSAVRSA hay un cambio en el hay un cambio en el genotipogenotipo donde las cepas adquieren el gen de resistencia donde las cepas adquieren el gen de resistencia vanAvanA, muestra una pequeña perdida de amplitud, y , muestra una pequeña perdida de amplitud, y pueden transferirpueden transferir la resistencia de Vancomicina a la resistencia de Vancomicina a otros organismosotros organismos
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232,000 x Magnificación
Características de la Características de la Pared Celular VISAPared Celular VISA
VISA en Agar SangreVISA en Agar Sangre
Múltiples Tipos de Múltiples Tipos de
ColoniasColonias
Colonias grandes, Colonias pequeñas, que crecen lentamente,
son todas S. aureus mostrando el fenotipo VISA
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Patrón de Crecimiento de Patrón de Crecimiento de VISA –VISA –
Tiras de Etest de Tiras de Etest de VancomicinaVancomicina
Crecimien-to al final de la Elipse
Vanco MIC
(µg/ml) 1.5 8 8 8
Resistencia a Vancomicina – Resistencia a Vancomicina – Enterococcus spp.Enterococcus spp.
Fenotipos más comunes:Fenotipos más comunes: Resistencia AdquiridaResistencia Adquirida
Van A:Van A: Fenotipo de alto nivel de Fenotipo de alto nivel de resistencia a Vancomicina y resistencia a Vancomicina y Teicoplanina.Teicoplanina.
Van B:Van B: Bajo a alto nivel de resistencia Bajo a alto nivel de resistencia solo a Vancomicina.solo a Vancomicina.
Resistencia IntrínsecaResistencia Intrínseca
Van C: Van C: Fenotipo asociado a bajo nivel de Fenotipo asociado a bajo nivel de resistencia a Vancomicina.resistencia a Vancomicina.
Detección VISA en el Detección VISA en el
LaboratorioLaboratorio MICs de Vancomicina de métodos automatizados MICs de Vancomicina de métodos automatizados
están mejorando pero no son perfectos.están mejorando pero no son perfectos. La Prueba de Difusión de Disco de Vancomicina no La Prueba de Difusión de Disco de Vancomicina no
se debe trabajarse debe trabajar Solución:Solución: adicionar Placa de Agar Screen adicionar Placa de Agar Screen
Vancomicina (preferiblemente preparado Vancomicina (preferiblemente preparado comercialmente) por lo menos a Staphylococcus comercialmente) por lo menos a Staphylococcus aureus por métodos manuales o automatizadosaureus por métodos manuales o automatizados
Para Etest, usar un inóculo estándar (0.5 Para Etest, usar un inóculo estándar (0.5 McFarland) y Agar Mueller-Hinton.McFarland) y Agar Mueller-Hinton.
Procedimiento: A. Screen Procedimiento: A. Screen
VancomicinaVancomicina Usar Placas de agar preparado Usar Placas de agar preparado
comercialmentecomercialmente Preparar una suspensión con 4 a 5 colonias Preparar una suspensión con 4 a 5 colonias
en caldo o solución salina a 0.5 McFarland, en caldo o solución salina a 0.5 McFarland, mezclar en vortex.mezclar en vortex.
Usar asa calibrada de 1 o 10-Usar asa calibrada de 1 o 10-µl o pipeta µl o pipeta para inocular en la placa (hasta 6 para inocular en la placa (hasta 6 cepas/placa)cepas/placa)
Procedimiento: A. Screen Procedimiento: A. Screen
VancomicinaVancomicina Dejar que el inóculo se absorba.Dejar que el inóculo se absorba. Invertir las placas e incubar a 35ºC en Invertir las placas e incubar a 35ºC en
ambiente aeróbicoambiente aeróbico Examinar después de 16-18 hrs. de Examinar después de 16-18 hrs. de
incubación; si no hay crecimiento, re-incubación; si no hay crecimiento, re-incubar y examinar 24 horas después.incubar y examinar 24 horas después.
Crecimiento >1 colonia es positivo para Crecimiento >1 colonia es positivo para VISA/VRSAVISA/VRSA
Confirmar identificación; no realizar MIC Confirmar identificación; no realizar MIC automatizadoautomatizado
Función del Lab de Función del Lab de MicrobiologíaMicrobiología
““Cada laboratorio debe tener a un miembro de su Cada laboratorio debe tener a un miembro de su personal con el tiempo, interés, y especialización personal con el tiempo, interés, y especialización para la dirección en las pruebas de susceptibilidad y para la dirección en las pruebas de susceptibilidad y resistencia. resistencia.
Esta persona debe estar leyendo las publicaciones Esta persona debe estar leyendo las publicaciones pertinentes, conectarse una red con otros pertinentes, conectarse una red con otros laboratorios, y evaluar las pruebas potencialmente laboratorios, y evaluar las pruebas potencialmente útiles para descubrir nuevos mecanismos de útiles para descubrir nuevos mecanismos de resistencia antes de que CLSI recomiende nuevas resistencia antes de que CLSI recomiende nuevas pruebas disponiblespruebas disponibles””
Ken Thomson, Emerging Infect. Dis., 2001Ken Thomson, Emerging Infect. Dis., 2001
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