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Introducción a la espectroscopía vibracional
1. .Conceptos básicos Estados vibracionales y energía Modos normales de vibración frecuencia de vibraciones
2. .Técnicas Espectroscopía infrarroja Regiones del IR
Grupos funcionales "Huellas digitales"
Número de ondas e intensidad Reglas de selección FTIR y sus ventajas
Espectroscopía Raman Dispersión inelástica de
fotones (Stokes y anti-Stokes) Reglas de selección Ventajas sobre el IR Resonanacia Raman
3. .Aplicaciones a proteínas Análisis de estructura
secundaria Cálculos Asignaciones Uso de isótopos Grupos laterales
2
Bibliografía
Campbell, I.D. and Dwek, R.A.; Biological Spectroscopy; Benjamin Cummings (1984)
Cantor, C.R. and Schimmel, P.R.; Biophysical Chemistry; Vol 2, (1984).
Krimm, S and Jagdeesh Bandekar, Vibrational Spectroscopy and Conformation of Peptides, Polypeptides and Proteins; Adv. Prot Chem. 38; (1986), p. 180
Susi, H and Byler, D.M.; Resolution Enhanced Fourier Transform Infrared Spectroscopy of Enzymes; Methods in Enzymology; 130, p 290
Williams, R.W.; Protein Secondary Structure Analysis Using Raman Amide I and Amide III Spectra; Methods in Enzymology; 130, p 311
3
Introducción a la espectroscopía vibracional
Espectro electromagnético
Frecuencia (Hz) Longitud de onda Tipo de radiación Tipos de transición
1020 - 1024 10-12 - 10-16 m Rayos gamma Nuclear1017 - 1020 1 nm - 1 pm Rayos X Electrones internos1015 - 1017 400 - 1 nm Ultravioleta Electrones externos4.3x1014 - 7.5x1014 700 - 400 nm Visible Electrones externos1012-1014 2.5 µm - 700 nm Infrarrojo Vibraciones108 - 1012 1 mm - 2.5 µm Microondas Rotaciones100 - 108 108 - 1 m Radiofrecuencia Inversión de spin
4
23
4
1
0
E
Distancia internuclear
Estados vibracionales y energía
k
21Frecuencia de la vibración
k = constante de fuerza del enlace F = -kx
µ = masa reducida, para un sistema diatómico 21
21
mmmm
5
cm-1 IR RAMAN
estiramiento (sim) 1340 - +
estiramiento (asim) 2349 + -
deformación 667 + -
deformación 667 + -
Modos normales de vibración (3N - 5)
O OC
O OC
O OC
O OC
6
Técnicas: INFRARROJO Reglas de selección:
No todas las vibraciones serán “activas” en IR
Sólo aquellas en las que cambie el momento dipolar permanente durante la vibración
9
FTIREspectrometría IR con
Transformada de Fourier1. Mejor relación señal/ruido ya
que la luz no debe pasar por un monocromador.
2. Se miden todas las frecuencias a la vez lo que da mucha mayor rapidez
3. Puede tener una resolución de menos de 0.01 cm-1
4. Los espectros pasan necesariamente por una computadora lo que facilita el análisis y manejo espectral
10
C N
C
HC
O
C N
C
HC
O
C N
C
HC
O
C N
C
HC
O
C N
C
HC
O
C N
C
HC
OC N
C
HC
O
C N
C
HC
O
C N
C
HC
O
C N
C
HC
O
C N
C
HC
O
C N
C
HC
O
estiramiento NH (3236 F) amida I (1653 F) amida II (1567 F) amida III (1299 M)
amida IV (627 D) amida V (725 F)
estiramiento NC (1096 D)
estiramiento CN y CC (881 D)
deformación CCN (436 D)
deformación CNC(289 D)
amida VI (600 M) amida VII (206 M)
Modos normales de vibración del grupo amida (valores para metilacetamida)
12
antiparalela
hélice
transición
ovillo estadístico
Susi, H., Timasheff, S and Stevens, L. J Biol Chem (1967) 242, 5460-5466
Estructura secundaria
13Goormaghtigh, E; Ruysschaert, J. M. and Raussens, V Biophysical Journal Volume 90 April 2006 2946–2957
Estructura
Estructura
Estructura secundaria
14
Porcentajes de hélice y cadena extendida obtenidas por rayos X y
FTIR
Proteína % Hélice % Cadena extendida
FTIR RX FTIR RXCarboxipeptidasa 40 39 33 30α-Quimotripsina 12 10 50 49Concanavalina A 4 2 60 60Lisozima 41 45 21 19Papaína 27 29 32 29Ribonucleasa A 21 22 50 46
16
C N
C
HC
O
1H2O
2H2O
Efecto de la deuteración de la proteína sobre la posición de la banda amida I
J. Biol. Chem. (1998) 273: 771-777
Uso de isótopos
17
BIAP (A) apo BIAP (B) Asignación tentativa
1682 C=O amida I (hoja )
1660 C=O amida I (giro)
1651–1652 1652 C=O amida I (hélice )
1633 1633 C=O amida I (hoja )
1586–1577 1586–1571 C=O COO– Asp o Glu
1547 1547 N-H amida II
1516–1517 1516–1517 OH anillo Tyr
1443 1455 N-2H amida II y 2HOH
Asignación tentativa de las diferentes bandas en el espectro FTIR de BIAP y apoBIAP en 2H2O, pH 6.6
Uso de isótopos
18
C N
C
HC
O
Efecto del tiempo en la deuteración de tripsina en 2H2O a 25º C, pD = 3.1
Eur. J. Biochem. 48, 339-344 (1974)
1 = 27 min2 = 63 min3 = 180 min4 = 21 h
Uso de isótopos
19
FTIR de monóxido de carbono unido a citocromo c aa3 de T. termophilus.
Referencia: Pinakoulaki, E.; Soulimane, T. and Varotsis, C. (2002) J. Biol. Chem. 277:32867.
Isótopos y posición de las bandas
21
Sir Chandrasekhara Venkata Raman, ( சந்திரசேசகர வெங்கடராமன்)Tiruchirapalli, Tamil Nadu -7/11/1888 Bangalore, Karnataka - 21/11/1970
Premio Nobel de Física 1930
Técnicas: RamanDispersión inelástica de fotones
estados electrónicos virtuales
22
muestra Láser, luz monocromática
Monocromador,
espectrógrafo
Regla de selección:
Para que la vibración sea activa en Raman debe provocar un cambio en la polarizabilidad de la molécula.
Ventajas de Raman con respecto a IR1. Se mide en el visible o el UV donde los detectores son mucho
más sensibles2. El agua produce una dispersión Raman muy débil3. La resonancia Raman permite sondear grupos asociados a
cromóforos con una sensibilidad 102- 104 veces mayor
26
Resonancia Raman
estado electrónico excitado
estado electrónico basal
estado energético virtual
Raman
ResonanciaRaman
La resonancia Raman es más intensa que la dispersión Raman, pero necesita que exista un cromóforo y sólo se intensifican las bandas debidas al cromóforo
30
Espectro IR de BSA sólida (azul) y espectro Raman de BSA en solución en amortiguador de fosfato (rojo).
31
Infrarrojo y Raman• El fenómeno de absorción
es más intenso por lo que se requieren muestras menores
• El equipamiento es más sencillo y de uso más flexible
• No presenta interferencias con otros fenómenos físicos (p. ej. fluorescencia)
• Se mide en el visible o UV donde los detectores son mucho más sensibles
• El agua produce una dispersión Raman muy débil
• El Raman resonante permite sondear grupos asociados a cromóforos con una sensibilidad varios órdenes de magnitud mayor
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Introducción a la espectroscopía vibracional
1. .Conceptos básicos Estados vibracionales y energía Modos normales de vibración frecuencia de vibraciones
2. .Técnicas Espectroscopía infrarroja Regiones del IR
Grupos funcionales "Huellas digitales"
Número de ondas e intensidad Reglas de selección FTIR y sus ventajas
Espectroscopía Raman Dispersión inelástica de
fotones (Stokes y anti-Stokes) Reglas de selección Ventajas sobre el IR Resonanacia Raman
3. .Aplicaciones a proteínas Análisis de estructura
secundaria Cálculos Asignaciones Uso de isótopos Grupos laterales
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