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Planta Piloto de FermentacionesDepartamento de Biotecnología
Ingeniería Enzimática
Sergio Huerta OchoaUAM-Iztapalapa
Planta Piloto de FermentacionesDepartamento de Biotecnología
Naturaleza Industria química
Síntesis de compuestos orgánicos
Planta Piloto de FermentacionesDepartamento de Biotecnología
La naturaleza de las enzimas
1) La reacción química se lleva a cabo bajo condiciones suaves
2) Acción específica de acuerdo a la clase de enzima
3) Tasas de reacción muy rápidas4) Numerosas enzimas para diferentes
objetivosEnzymes at work(www.novozymes.com)
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Clase Enzimas Industriales
1. Oxidoreductasas Peroxidasas, catalasas, glucosa oxidasas, lacasas
2. Transferasas Fructosil-transferasas, glucosil-transferasas
3. Hidrolasas Amilasas, celulasas, lipasas, pectinasas, proteasas, pululanasas
4. Liasas Pectato-liasas, αααα-acetolactatodecarboxilasas
5. Isomerasas Glucosa isomerasa
6. Ligasas No son usadas actualmente
Enzymes at work(www.novozymes.com)
Enzimas típicas usadas en procesos industriales
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El código de cada enzima consiste de las letras "EC" seguida de cuatro númerosseparados por puntos. Esos números representan progresivamente una clsificaciónmás fina de la enzima.
Por ejemplo, la amino peptidasa tripéptida tiene el código"EC 3.4.11.4"
Cuyos componentes indican los siguientes grupos de enzimas:
EC 3 son hidrolasas(enzimas que usan agua para romper otra molécula)EC 3.4 son hidrolasas que actúan sobre enlaces peptídicosEC 3.4.11son aquellas hidrolasas que enlazan el amino-terminal de un
aminoácido de un polipéptidoEC 3.4.11.4son aquellas hidrolasas que enlazan el amino-terminal de un
aminoácido de un tripéptido
Nomenclatura
Planta Piloto de FermentacionesDepartamento de Biotecnología
Algunos ejemplos de enzimas industriales y sus usos
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Algunos ejemplos de enzimas industriales y sus usos
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Technology Prospecting on Enzymes: Application, Marketing and Engineering
Shuang Li, Xiaofeng Yang , Shuai Yang , Muzi Zhu , Xiaoning WangComputational and Structural Biotechnology Journal, Volume No: 2, Issue: 3, September 2012
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Puntos principales de la aplicación comercial de
un catalizador enzimático
• Velocidad de reacción
(actividad catalítica)
• Extensión de la reacción
(constante de equilibrio)
• Duración de la actividad
(estabilidad)
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• Energía de activación es la cantidad de energía necesaria para empujar a los reactantes sobre una barrera de energía.
� En el pico las moléculas
están en un punto inestable, el estado de transición
� ∆G es todavía sólo la diferencia entre sustratos y productos
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Reacciones catalizadas por enzimas
Por lo general, todas las reacciones de enzimas catalizadas se clasifican en dos categorías:
1. Anabolismo - Pequeñas moléculas se unen entre sí para formar moléculas complejas.
2. Catabolismo – Moléculas complejas se dividen en moléculas simples.
Algunas enzimas pueden catalizar ambos tipos de reacción. La enzima actúa en ambos sentidos hasta que encuentra equilibrio.
ABBA Enzima →+
BAAB Enzima + →
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Diseño de biorreactores
reactorroi VvSSF =− )(
ννννr = velocidad de reacción
F, S0
F, Si
donde:
Balance de materia
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Leyes fundamentales de la cinética
• Velocidad de la reacción
• Orden de la reacción
---- = v = k
---- = v = k CA CB
Orden uno
Orden cero
Orden dos
v0
[P]
t
[A] 0
d[P]dt
---- = v = k CAd[P]dt
d[P]dt
A P
A P
A + B P
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Consideraciones al definir el orden de una reacción
• No se puede decir que todas las
reacciones poseen un cierto orden
(Reacciones complejas)
• No se debe intentar deducir el orden de
una reacción de su ecuación
estequiométrica
(Depende del mecanismo de la reacción)
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Sitio activo y formación del complejo: enzima-sustrato
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ES
k 1
k -1
k cat
E
S P
Modelo llave-cerradura
EE
El mecanismo candado-llave de Fischer (1894) sugiere que el sustrato se ajusta a una cavidad en la superficie de la enzima similar a la de una llave que entra en un candado.
Hermann Emil Fischer (1852 -1919)
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Modelo de ajuste inducido
Hexoquinasa
Daniel Koshland (1963) sugirió que la enzima era más flexible de lo que se pensaba. Con un mecanismo de “ajuste inducido” , el centro activo de la enzima sufría cambios en su forma en presencia del sustrato.
Daniel Edward Koshland (1920-2007)
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Diferentes modelos de enlace enzima-sustrato
Efecto de proximidad y efecto de orientación
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Los experimentos cinéticos revelan propiedades enzimáticas
Cinética química
• Los experimentos examinan la cantidad de producto(P) formado por unidad de tiempo (∆∆∆∆[P] / ∆∆∆∆t)
• Velocidad (v) – la tasa de una reacción (varía con la concentración de reactante)
• Constante de la tasa (k) – indica la velocidad o eficiencia de una reacción
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Cinética enzimática
• Cuando [S] >> [E], cada enzima enlaza una molécula de substrato (la enzima está saturada con el substrato)
• Bajo estas condiciones la tasa depende solamente de [E], y la reacción es pseudo-primer orden
• Complejo enzima-substrato (ES) - complejo formado cuando el substrato específico se enlaza al sitio activo de la enzima
E + S ES E + P
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Velocidad inicial (vo)
• La velocidad al inicio de una reacción catalizada enzimáticamente es
vo (velocidad inicial )
• k1 y k-1 representan una rápida asociación /disociación no covalente de substrato del sitio activo de la enzima
• kcat = constante de la tasa para formación de producto de ES
E + S ES E + P k1
kcat
k-1
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Curva de progreso para una reacción catalizada enzimáticamente
• La velocidad inicial (vo) es la pendiente de la porción lineal inicial de la curva
• La tasa de la reacción se duplica cuando se usa el doble de enzima
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Leonor Michaelis1875-1949
Maud Menten1879-1960
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Consideraciones de equilibrio rápido(Ecuación de Henri-Michaelis-Menten)
E + Sk 1k -1
ESk cat E + P
[ ] [ ] [ ]ESEE t +=
[ ]ESkv cat=
[ ][ ]
[ ] [ ]ESE
ESk
E
v cat
t +=
[ ][ ][ ] [ ] [ ] [ ]E
K
SES
ES
SEK
S
S =∴= ,
[ ]
[ ] [ ]
[ ] [ ] [ ]EK
SE
EK
Sk
E
v
S
Scat
t +=
[ ][ ]SK
S
V
v
Smax +=
1. Reacciones involucradas
2. Balance de masa
3. Velocidad limitante
4. Dividir por [E] t
5. Expresión de equilibrio
6. Sustituir en términos de [E]
7. Donde Vmax = kcat [E] t
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Consideraciones de estado estacionario(Ecuación de Briggs-Haldane)
E + Sk 1
k -1ES
k catE + P
[ ] [ ] [ ] ( ) [ ]ESkkSEkdt
ESdcat ⋅+−⋅= −11
[ ]0=
dt
ESd
[ ] [ ][ ] M
cat Kk
kk
ES
SE =+=⋅ −
1
1
[ ]ESkv cat=
[ ][ ]
[ ] [ ]ESE
ESk
E
v cat
t +=
[ ][ ]SK
S
V
v
M +=
max
1. Reacciones involucradas
2. Balance de masa
3. En estado estacionario
4. Constante de Michaelis
6. Dividir por [E] t
8. Donde Vmax = kcat [E] t
5. Velocidad limitante
[ ]
[ ] [ ]
[ ] [ ] [ ]EK
SE
EKS
Ek
v
M
M
tcat +=7. Sustituyendo [ES]
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νννν
[S]
Vmax
KM
Vmax2
νννν = Vmax [S]
KM + [S]
Cinética de Michaelis-Menten
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La ecuación de Michaelis-Menten
• La Velocidad máxima (Vmax) se alcanza cuando una enzima está saturada con el substrato (alta [S])
• A altas [S] la tasa de reacción es independiente de [S] (orden cero con respecto a S)
• A bajas [S] la reacción es de primer orden con resp ecto a S
• La forma de una curva v o versus [S] es una hipérbola rectangular, indicando saturación del sitio activo de la enzima conforme [S] se incrementa
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Gráficas de velocidad inicial (vo) versus [S]
(a) Cada punto v o vs [S] se obtiene de un experimento cinético
(b) La constante de Michaelis (K M) iguala la concentración de substrato necesario para alcanzar ½ de la velocidad máxima
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El significado de KM
• KM = [S] cuando vo = 1/2 Vmax
• KM ≅ k-1 / k1 = Ks (es la constante de disociación enzima-substrato ) cuando kcat << k1 or k-1
• Entre más bajo sea el valor de KM, más ajustado será el enlace del substrato
• KM puede ser una medida de la afinidad de E for S
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KM y concentraciones de substrato fisiológicas
• Los valores de KM paralas enzimas son típicamente arriba de [S], tal que las tasas enzimáticas son sensibles a pequeños cambios en [S]
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• La constante catalítica(kcat) – constante de la tasa de orden uno para la conversión de complejoESaE + P
• kcat es más fácilmente medible cuando la enzima esta saturada con S
• La relaciónkcat /KM , llamada también coeficiente de especificidad, es una constante de segundo orden para
E + S E + P
a bajas concentraciones de [S]
Las constantes cinéticas indican la actividad enzimática y la especificidad
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Ejemplos de constantes catalíticas
Enzyme kcat(s-1)
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Valores of kcat/KM
• kcat/KM puede aproximar la tasa de encuentro de dos moléculas no cargadas en solución (108 to 109 M-1s-1)
• kcat/KM es también una medida de la especificidad de la enzima por diferentes substratos (constante de especificidad )
• Aceleración de la tasa = kcat/KM
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Determinación de parámetros cinéticos
1. Gráfico
2. Linearización de la Ec. M-MA. Lineweaver-BurkB. Hanes-WoolfC. Eadie-Hofstee
3. Integración de la Ec. M-M
4. Sistema de ecuaciones diferenciales
5. Regresión no lineal
Método
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Hans Lineweaver Dean Burk
Lineweaver, H and Burke, D. (1934). "The Determination of Enzyme Dissociation Constants". Journal of the American Chemical Society56 (3): 658–666. doi:10.1021/ja01318a036
Linearización de la Ecuación de Michaelis-Menten
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Cálculo de KM y Vmax
La gráfica doble-recíproca Lineweaver-Burk es una transformación lineal de la gráfica de Michaelis-Menten
(1/vo versus 1/[S])
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[ ] [ ]maxmax
1
V
KS
Vv
S M+=
[ ]S
vKVv M−= max
Hanes-Woolf
Eadie-Hofsteev
v/[S]
Vmax
Vmax/KM
-KM
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Otra opción es utilizar la forma integral de la ecuación de Michaelis-Menten:
[ ] [ ][ ]SK
SV
dt
Sd
M +=− max
dejando del lado izquierdo los términos que contengan [S] y del lado todos los que contengan t e integrando
[ ][ ][ ]
[ ] [ ][ ]
[ ]∫∫∫ =−−
tS
S
S
SM dtVSdS
SdK
0max00
[ ][ ] [ ] [ ]( ) tVSSS
SKM max0
0ln =−+
Resolviendo la integral
[ ] [ ]( )[ ][ ]
[ ][ ]S
St
V
S
SSS
KM0
max0
0
lnln=−+
dividiendo entre[ ][ ]
S
S 0ln
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Formas lineares de la integral de la ecuación de Michaelis-Menten:
[ ] [ ][ ][ ]
[ ][ ]S
St
VK
S
SSS
M0
max0
0
lnln+−=−
[ ] [ ][ ][ ]S
SSS
0
0
ln
−
Vmax
-KM[ ][ ]S
St
0ln
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[ ]tf EkV 2max = [ ]tEkVb 1max −=
1
12
k
kkK
Sm−+=
2
12
−
−+=
k
kkK
pm
Donde:
Reacciones reversibles
[ ] [ ] [ ] [ ] [ ]PEESSEK
K
K
K
+←→
←→
+−− 2
2
1
1
[ ] [ ]
[ ] [ ]PS
Pb
Sf
neta
K
P
K
SK
PV
K
SV
v++
−=
1
maxmax
Glucosa Isomerasa
Consideración de estado estacionario
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