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Planta Piloto de FermentacionesDepartamento de Biotecnología
Rompimiento celular
Sergio Huerta OchoaUAM-Iztapalapa
Planta Piloto de FermentacionesDepartamento de Biotecnología
Productos Extracelulares-Antibióticos-Enzimas extracelulares-Muchos polisacáridos-Mayoría de aminoácidos
Biomasa
Productos Intracelulares-Mayoría de proteínas modificadas
genéticamente-Lípidos-Algunos antibióticos
Esteroides(Se extraen sin romper)
Planta Piloto de FermentacionesDepartamento de Biotecnología
Tipo de producto Ejemplos
Proteínas recombinantes Insulina, HC, Proteína A, Proteína G
Enzimas L-Asparaginasa, Invertasa, Glucosinasa
Plásmidos Terapia génica
Vacunas Tétanos, Meningitis
Otros Mitocondrias, Esporas, Toxinas
Productos que requieren de ruptura celular
Tejeda y col. 2011 Bioseparaciones
Planta Piloto de FermentacionesDepartamento de Biotecnología
Procariotes Gram –(E. coli produce la mayoría de las proteínas recombinantes)
Procariotes Gram +
Membrana externa(Proteínas y lipopolisacáridos)
Polipéptidoglucanos
Espacio Periplasmático(Proteínas)
Membrana de plasma
8 nm
8 nm
Polipéptidoglucanos
Espacio Periplasmático(Proteínas)
Membrana de plasma(Fosfolípidos, proteínas dispersas, iones metálicos)
Fuerza mecánica
Permeabilidad
Esquema de la pared celular de células procariotas
Planta Piloto de FermentacionesDepartamento de Biotecnología
Tomado de “Advances in product release strategies and impact on bioprocess design” (2009)Bangaru Balasundaram, Sue Harrison and Daniel G. Bracewell
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Tomado de “Advances in product release strategies and impact on bioprocess design” (2009)Bangaru Balasundaram, Sue Harrison and Daniel G. Bracewell
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Tomado de “Advances in product release strategies and impact on bioprocess design” (2009)Bangaru Balasundaram, Sue Harrison and Daniel G. Bracewell
Planta Piloto de FermentacionesDepartamento de Biotecnología
Fermentación
Cosecha de células
Rompimiento Celular
Remoción de restos celulares
Concentración y/o
fraccionamiento
Operaciones de alta
resolución
Operaciones finales
Producto
Centrifugación, filtración con vacío,
filtración con membranas
Homogenización, molienda, lisis
(enzimática o química)
Centrifugación, filtración con vacío,
filtración con membranas
Precipitación, extracción, filtración
con membranas, evaporación
Cromatografía, cristalización
Etapas primarias de recuperación
Adaptado de: Sanchez-Ruiz, 1989Studies on cell disruption and cell debrisremoval in downstream processing
Planta Piloto de FermentacionesDepartamento de Biotecnología
Ruptura Celular de Saccharomyces cerevisiae
Antes de la ruptura celular
Después de 2 pasos a 1000 bar dandoun rompimiento celular de 95%
Planta Piloto de FermentacionesDepartamento de Biotecnología
Equipo de ruptura
Industria Alimentaria(Homogenización de la leche)
Industria de la Pintura(Reducción de Pigmentos)
Industria BiotecnológicaAplicación en …
Planta Piloto de FermentacionesDepartamento de Biotecnología
Método Técnica Principio Estrés
sobre el
producto
Costo Ejemplo
Químico Choque osmótico Ruptura osmótica de la
membrana
Suave Barato Ruptura de células de sangre
Digestión
enzimática
Rompimiento por digestión de la
pared celular
Suave Caro Micrococcus lysodeikticus tratado con
lisozima de huevo
Solubilización Detergentes solubilizan la
membrana celular
Suave Moderado
- caro
Sales biliares actuando sobre E.coli
Disolución de
lípidos
Solventes orgánicos se disuelven
en la pared celular y la
desestabilizan
Moderado Barato Ruptura de levadura con tolueno
Tratamiento
alcalino
La saponificación de lípidos
solubiliza la membrana
Fuerte Barato
Mecánico Homogenización
(tipo navaja)
Células cortadas en una
licuadora
Moderado Moderado Tejido animal y células
Molido Ruptura celular por molido con
abrasivos
Moderado Barato
Ultrasonicación Células rotas con cavitación
ultrasónica
Fuerte Caro Suspensión de células a pequeña escala
Homogenización
(tipo orificio)
Se hace pasar células por un
pequeño orificio y se rompen
por estrés
Fuerte Moderado Tratamiento a gran escala de suspensión de
células excepto bacterias
Rompimiento en
molino de perlas
Se aplastan las células entre el
vidrio y perlas de acero
Fuerte Barato Tratamiento a gran escala de suspensión de
células y células de plantas
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Dificultad de la ruptura
Esporas
Cocos gram -
Levaduras
Células vegetales
Bacilos gram +
Bacilos gram - y cocos
Micelios
Células animales
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Elección del método de ruptura
�Naturaleza de la fuente de la enzima
�Escala de la operación
�Velocidad del método de extracción
�Estabilidad del enzima
�Pureza requerida
�Costo del proceso
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Factor inactivante Fuente de
enzima
Frecuencia Modo de
contrarrestarlo
Calor Cualquiera Universal Enfriamiento
Frío Cualquiera Raro Calentamiento
Proteasa Mayoría Común Inhibidores de proteasas o
frío
Productos oxidación de
fenoles
Plantas y hongos Bastante común Agentes reductores
Oxidación Cualquiera Común Agentes reductores
Dilución proteína Cualquiera Bastante común Concentración rápida
Pérdida de estabilidad Cualquiera Bastante común Restauración de ese factor
Inhibidores específicos Plantas y
bacterias
Raro Separación del inhibidor
Metales pesados Cualquiera Raro Agentes quelantes
Cambio de fase Cualquiera Común Mínima agitación
Factores que inactivan las enzimas durante su aislamiento
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Choque osmótico1. Suspensión de células en solución tamponada hipertónica (sacarosa 20%)2. Equilibrio osmótico3. Centrifugación: concentración de las células4. Re suspensión en agua (4 ºC)5. Ruptura celular por entrada de agua en el interior
celular
• Mayor sensibilidad en GRAM negativas(GRAM positivas alta presión osmótica interna)
• Ventajas:Extracción de enzimas del espacio periplasmático, simplificación de los procesos de purificación
• NO a gran escala:Grandes volúmenes de medio (400 L/10 kg pasta celular)
Elevado número de pasos de centrifugaciónNecesidad de refrigeración
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Tratamiento con lisozima + EDTA
•Digestión de las paredes celulares por ruptura de los enlances beta-(1.4) glicosídicos entre el ácido N-acetilmurámico (NAM) y la N-acetilglucosamina (NAG) del mucopéptido
•Mayor susceptibilidad GRAM +•Combinación con EDTA: quelante del Ca2+
•Otros policationes: GRAM +: quitosano, hidroglutamato, polilisina, antiobióticos GRAM -: lipasas, fosfolipasas, policationesHongos/levaduras: quitinasa/glucanasas
•Necesidad de choque osmótico•No empleo a gran escala :
Alto precio de la lisozimaEliminación de lisozima tras extracción
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Tratamiento con detergentes
Tipos:1. Iónicos : provoca desnaturalización
proteicaAniónicos: Lauril sulfato sódico,
colato sódico, SDSCatiónicos: Bromuro de cetil-
trimetil-amonio
2. No iónicos : preservan estructuranativa e interacciones de laenzimaTween, Spam, Triton
Permeabilización de células por solubilización de proteínas de membrana, debido a apertura de poros
Inconvenientes :Precipitación de proteínas y necesidad de eliminación (cromatografía, ultrafiltración)
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Tratamiento con álcalis
�Tratamiento de las células con soluciones alcalinas
(KOH, NaOH, pH 11.5-12.5; 20-30 min)� Hidrólisis de la pared celular� Ventajas:
� Simpleza, barato� Fácil aplicación a gran escala
� Desventajas:� Tratamiento fuerte, es un ejemplo extremo de la solubilización (Saponificación de lípidos que se convierten a detergentes)� No selectivo� Aplicación SÓLO si las enzimas a aislar son estables a pH alcalino
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�Método tradicional de ataque ( tolueno).
�No se usan a gran escala.
�Inconvenientes:PrecioToxicidadDesnaturalización de proteínasInflamabilidad
Disolventes orgánicos
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Homogeneización con abrasivos
•Mortero + abrasivo (cristal, albúmina, kieselgurh)•Dispositivos de funcionamiento continuo:
Agitador Mickle (agitador vibratorio)Dyno-mill (agitador de discos giratorios)
•Efectividad depende de:� Tipo y concentración de abrasivo� Tipo, concentración y edad de las células: levaduras >bacterias� Velocidad de agitación� Cantidad y flujo a través de la cámara� Temperatura� Dispositivo de discos
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Sonicación•Aplicación de frecuencia superiores a 20 kHz•Aparición de áreas de compresión/enrarecimiento/cavidades →colapso de cavidades →ondas de choque →daño celular•Aplicación continua o discontinua•Eficacia dependiente de:
Tipo de microorganismo:Gram ->Gram +Bacilos > Cocos
pHTemperaturaFuerza iónica del medioTiempo de exposiciónDensidad de la célula
•Uso a pequeña escala, NO a gran escala:Elevados requerimientos de energíaDificultad de transmisión de la energíaProblemas de disipación del calor producido
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Congelación/Descongelación
•Formación y fusión de cristales de hielo � liberación de proteínas
•Combinación con otros métodos: congelación de sedimentos bacterianos
•Ventajas:SimplicidadBajas temperaturas de trabajo
•NO a gran escala:Elevado tiempo de tratamientoResistencia de algunos microorganismosSensibilidad de las enzimas a congelación/descongelación
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Cizalla líquida
•Paso de la suspensión de células a elevada presión (>55MPa) a través de un orificio estrecho•Homogeneizador de Manton-Gaulin•Mecanismo:
Ruptura celular por caída brusca de presión y choque
•Modos de uso:Paso único, series de reciclaje, reciclaje continuo con eliminación de sustancia
•Efectividad depende de:Tipo de microorganismos: GRAM -> GRAM +Historia de la materia de partida:Condiciones de crecimiento (fase estacionaria > fase exponencial)Congelación/descongelación
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Cizalla sólida
•Paso de células congeladas (-20 ºC) a través de orificio
•Mecanismo:Agitación en presencia de abrasivo
(cristales de hielo) + ruptura por cizalla líquida
Fuerzas de cizalla: paso a través de orificio + desgarro por cristales de hielo
•No produce la desnaturalización de las enzimas
•NO a gran escala:Manejo complicado y costoso
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Tomado de “Advances in product release strategies and impact on bioprocess design” (2009)Bangaru Balasundaram, Sue Harrison and Daniel G. Bracewell
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Tomado de “Advances in product release strategies and impact on bioprocess design” (2009)Bangaru Balasundaram, Sue Harrison and Daniel G. Bracewell
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Ecuaciones utilizadas en rompimiento celular
Choque osmótico: El cálculo del gradiente de presión se basa en el equilibrio químico (Ley de van’t Hoff)
iie TRPP c∑⋅⋅−=−
(Tejeda y col., 1995, Bioseparaciones)
Ejemplo: Las cianobacterias son capaces de acumular sales de bajo peso molecular en respuesta a un medio con alta presión osmótica. Pueden ser cultivadas en medios con 0.11 M NaCl o en medios con 0.49 M NaCl y 0.01 M CaCl2. Cuando las células son crecidas en el medio más salino y transferidas a agua pura se permeabilizan liberando los carbohidratos y aminoácidos intracelulares en 2 min. Estime la diferencia de presión osmótica para permeabilizar las células a 25 ⁰C (donde: R = 82 cm3 atm mol-1 K-1).
( ) ( )[ ] atm38.5cm1000
L1L
mol11.011.0K27325
Kmolatmcm
82 3
3
−=+∑⋅+⋅⋅
−=∆ NaClP o
o
( ) ( ) ( )[ ] atm68.24cm1000
L1L
mol02.001.049.049.0K27325
Kmolatmcm
82 3
3
2−=+++∑⋅+⋅
⋅−=∆ CaClNaClP o
o
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Parámetros operacionales
- Velocidad del agitador
- Velocidad de alimentación de la suspensión celular
- Diseño del agitador
- Tamaño de las perlas de vidrio
- Carga de las perlas de vidrio
- Concentración celular
- Temperatura
Molino de perlas de alta velocidad
Tejeda y col., 2011, Bioseparaciones
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Velocidad del Agitador
La Velocidad Periférica Normalizada de los Anillos agrupa varios parámetros relacionados con la velocidad del agitador
� En impulsores concéntricos, Dm = diámetro del impulsor (mm)
� En impulsores excéntricos, Dm = diámetro promedio (mm)
1000x60
πωmDU =
42
22 d
eDm +=
d : diámetro de los anillos del agitador (mm)
e : diámetro de la flecha del agitador (mm)
ω : velocidad angular del agitador (rpm)Dm : diámetro
Tejeda y col., 2011, Bioseparaciones
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• El flujo permisible en un molino de perlas depende:�Del volumen del molino�De la carga de perlas�Velocidad del agitador
El proceso resulta más económico
Al aumentar el flujo de
alimentación
Disminuye el grado de desintegración
NOTA: Conviene operar con altos flujos de alimentación y
usar varios pasos para obtener el rendimiento requerido
Flujo de alimentación, F
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Diseño del Agitador y Efectos del Mezclado
El comportamiento de un molino de perlas depende del patrón de flujo y mezclado que produce la agitación. La cual es un agitado intermedio a los dos modelos ideales: Flujo tapón (sin mezclado axial) y tanque continuo agitado (100 % agitado)
El tipo de mezclado puede ser determinado por técnicas con trazadores
Tejeda y col., 2011, Bioseparaciones
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Ecuaciones utilizadas en rompimiento celular
Molino de Perlas (operación intermitente): El rompimiento celular con perlas agitadas a altas velocidades sigue una cinética de primer orden. El balance de masa de proteína liberada puede ser expresado mediante la ecuación:
( ) MmM VRRkdt
dRV −=
Integrando y re-arreglando
ktRR
R
m
m =−
ln
RR
R
m
m
−ln
kEjemplo 5.2
(Tejeda y col., 1995, Bioseparaciones)
t
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Ecuaciones utilizadas en rompimiento celular
Grado de mezclado en un Molino de Perlas (operación continua):El grado de desviación del flujo tapón ideal en los molinos de perlas comerciales, ha sido simulado utilizando el modelo de “Tanques en serie perfectamente agitados”. Esto permite realizar experimentos con pulsos de tinta para determinar el número de tanques equivalentes al grado de mezclado que tiene el molino de perlas utilizado y calcular la eficiencia esperada del rompimiento.
1 2 3 N
FFC0 C1 C2 C3 CN
Al aplicar un pulso de tinta en la primera etapa de una serie de tanques perfectamente agitados de igual volumen, el balance de la masa de tinta para cualquier etapa N es:
( )NNNM CCF
dt
dC
N
V −= −1
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Utilizando un tiempo adimensional definido por: RM t
t
V
tF ==θ
El balance de masa de tinta puede expresarse como:
)( 1 NNN CCN
d
dC −= −θIntegrando para cada etapa, se obtiene que para la etapa N la expresión:
( ) ( ) ( )θθθ NN
N
C
CE
NNN −
−==
−
exp!1
1
0
E(θ) es una medida de la distribución de tiempos de residencia del fluido dentro del recipiente. Derivando con respecto θ e igualando el resultado a cero se tiene:
máx
Nθ−
=1
1
Donde θmáx es el tiempo adimensional en el cual E es máxima:
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( )N
VRRkFR
dtdR
N
V mm
m11
1 −+−=
Expresando la ecuación en función de un tiempo adimensional e integrando obtenemos
+=
NF
kVNF
kV
R
R
m
m
m 1
1Eficiencia de la etapa !!!
Re-arreglando y generalizando para N etapas, tenemos:N
m
Nm
m
NF
kV
RR
R
+=−
1 Ejemplo 5.3
Eficiencia de un Molino de Perlas (operación contin ua):Para relacionar el número de etapas con la eficiencia de rompimiento es necesario realizar un balance de proteína liberada (células rotas) considerando que el molino consta de N etapas tipo tanque perfectamente agitado en serie y que el rompimiento sigue una cinética de primer orden.
El balance de proteína liberada en la primera etapa está dada por
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Ecuaciones utilizadas en rompimiento celular
Homogeneizador de alta presión: La desintegración celular en un homogeneizador de alta presión a una presión fija puede ser descrita mediante una cinética de primer orden respecto al número de pasos, de tal manera que:
( )RRkdN
dRm −= '
Integrando obtenemos la ecuación:
NkRR
R
m
m 'ln =−
Se ha determinado experimentalmente que la constante k’ tiene una dependencia con la presión de la siguiente forma: aPkk "'=
a
m
m NPkRR
R"ln =
−
Combinando las ecuaciones anteriores se tiene:
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Ecuaciones utilizadas en rompimiento celular
Microflidizador: En el caso del microfluidizador la cinética de rompimiento presenta una cierta dependencia no lineal con el número de pasos expresada mediante la ecuación:
ab
m
m PNkRR
R"ln =
−
Donde b es un exponente que varía con el tipo de célula y toma valores entre 0.28 y 1
Ejemplo 5.4
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Chang and Su, 2006Kinetic model for simultaneous cell disruption and aqueous two-phase
extraction
A = Am[1 − exp(−kt)]
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La Ruptura celular, cuando se están procesando cientos o miles de litros de material, represanta un reto diferente a la ruptura celular a
nivel laboratorioFactores claves son: Eficiencia y reproducibilidad
A nivel Industrial sólo se emplean los molinos de perlas agitados y los homogeneizadores a alta presión. El diseño de los molinos está basado en ecuaciones empíricas y en experimentos piloto.
GEA Liquid Processing cell rupture skid for biologic cell lysing. The homogenizer feature the high efficiency sharp profile rupture valve type R which enable cell disruption at lower pressures
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