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PGD EN ENFERMEDADES MONOGÉNICAS
Dra. Mª Dolores Lozano Arana
UGC de Genética, Reproducción y Medicina Fetal
Hospital Universitario Virgen del Rocío
Sevilla
X CONGRESO NACIONAL DE LABORATORIO CLÍNICO
PGD EN EL SIGLO XXI Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
PGD EN ENFERMEDADES MONOGÉNICAS
RESUMEN:
- Definición de enfermedades monogénicas
- Definición de PGD: tipos
- Programa de PGD para enferm. monogénicas:
evolución desde finales del S.XX hasta
la actualidad
- Futuro
X CONGRESO NACIONAL DE LABORATORIO CLÍNICO
PGD EN EL SIGLO XXI
NONE
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
ENFERMEDADES RARAS
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
ENFERMEDADES RARAS
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
- Prevalencia de 5/10.000
- Existen entre 6.000-8.000 enfermedades raras
- En su conjunto agrupan a un 5% de la población de
países desarrollados
ENFERMEDAD RARA
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
Características:
- Enfermedades hereditarias de inicio temprano
- Carácter crónico, elevada morbimortalidad y
discapacidad
- Complejidad etiológica, diagnóstica y evolutiva
- El 80% tiene un origen genético identificado
(OMIM: Online Mendelian Inheritance in Men)
ENFERMEDAD RARA
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
Problemas:
- Elevado coste social y familiar
- 8% estancias hospitalarias
- 70% niños en UCI
- 20% mortalidad infantil
- Ausencia de terapias
ENFERMEDAD RARA
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ENFERMEDADES GENÉTICAS
Enfermedades monogénicas
Anomalías cromosómicas
Enfermedades multifactoriales (genéticos+ambientales)
Enfermedades de herencia citoplásmica (mitocondriales)
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Atrofia Muscular Espinal
DM Duchenne
DM Steinert
Fibrosis Quística
Talasemias
Síndrome de Opitz
Hemofilia
Enfermedad de Huntington
Síndrome de X frágil
Síndrome de Duncan
Síndrome de Lowe
Poliposis Adenomatosa Familiar
Síndrome de Marfan
Pelizaeus Merzbacher
Enfermedad de Machado Joseph
Distrofia Muscular de Becker
Síndrome de Lowe
Enfermedad de Menkes
Síndrome de Morris
Hidrocefalia ligada a X Síndrome de Alport
ENFERMEDAD RARA
≈
Enfermedades monogénicas
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
Alteraciones causadas por cambios específicos
en la secuencia de ADN, alterando la función de
un único gen, siendo la causa directa de la
enfermedad
Enfermedades monogénicas
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
Alteraciones causadas por cambios específicos
en la secuencia de ADN, alterando la función de
un único gen, siendo la causa directa de la
enfermedad
Patrón de herencia definido (mendeliano):
Enfermedades monogénicas
Incidencia Riesgo
Autosómicas dominantes 1% 50%
Autosómicas recesivas 0.2% 25%
Ligadas a X 0.2% AR: 50% V
AD: 50%
(
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
Alteraciones causadas por cambios específicos
en la secuencia de ADN, alterando la función de
un único gen, siendo la causa directa de la
enfermedad
Enfermedades monogénicas
Ligadas a X A. dominantes
Hemofilias (R) Enf. de Huntington
DM Duchenne (R) DM Steinert
Síndrome X frágil (D)
A. recesivas
Fibrosis quística
Atrofia muscular espinal (
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OBJETIVO = PREVENCIÓN
Consejo genético
Opciones reproductivas en parejas con
enfermedades monogénicas
No tener hijos
TRA con donación de gametos
Adopción
Diagnóstico Prenatal (DP)
PGD
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(Handyside et al. Pregnancies from biopsied human preimplantation
embryos sexed by Y-specific DNA amplification.
Nature1990;344:768-70)
Diagnóstico Genético Preimplantatorio Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
Análisis genético de los preembriones obtenidos
por técnicas de FIV antes de ser transferidos al
útero. Transferimos los no afectos para la
enfermedad de riesgo.
Diagnóstico Genético Preimplantatorio
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
Diagnóstico Genético
Preimplantatorio (PGD)
PGD es una forma precoz de DP Evitar IVE
Diagnóstico Prenatal (DP)
Opción reproductiva para parejas con alto riesgo
de trasmitir una enfermedad de base genética a
su descendencia
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
Opción reproductiva para parejas con alto riesgo
de trasmitir una enfermedad de base genética a
su descendencia
Diagnóstico Genético Preimplantatorio
INDICACIONES:
- Enfermedades monogénicas
- Anomalías cromosómicas
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
PGD de alto riesgo: PGD
PGD de bajo riesgo: PGS o PGD-AS
screening de aneuploidias
TIPOS PGD
MAYOR EFICACIA EN FIV
RIESGO GENÉTICO
AUMENTADO
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
LEY 14/2006, de 26 de mayo, sobre técnicas de
reproducción humana asistida
En España el PGD
está contemplado en la
Legislación vigente
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
Artículo 12.
12.1a- Detectar enfermedad hereditaria grave, de
aparición precoz y no susceptible de tratamiento
postnatal…..
12.1b- Detectar alteraciones que puedan comprometer
la viabilidad del embrión
Comunicarlos a las autoridades sanitarias
12.2. Aplicación del PGD para cualquier otra finalidad
no comprendida en el apartado anterior.…. (PGD-HLA,
mutaciones con penetrancia incompleta….)
Pedir autorización caso a caso
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LEY 14/2006, de 26 de mayo, sobre técnicas de
reproducción humana asistida
En España el PGD
está contemplado en la
Legislación vigente
…….por el que se regula el Diagnóstico Genético Preimplantatorio en el
Sistema Sanitario Público de Andalucía, se crea la Comisión Andaluza
de Genética y Reproducción y se designa a la UGCGRMF del Hospital
Virgen del Rocío de Sevilla como centro de referencia.
SSPA DECRETO 156/2005 de 28 de junio
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El PGD está incluido en la cartera básica de servicios del SNS
El PGS no
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Programa de PGD Genética Reproducción
Genetistas
Ginecólogos
Embriólogos
Programa de PGD para enfermedades monogénicas Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
1. Consulta Conjunta de Genética y Reproducción
- Los pacientes conocen muy bien la enfermedad
para la que consultan (AD, AR, Lig X)
- Se asesora e informa sobre opciones reproductivas
No tener hijos
Donación gametos
Adopción
DP
PGD
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1. Consulta Conjunta de Genética y Reproducción
Informe de Consejo Genético donde se especifique:
- Estatus de la pareja/familia consultante
- Identificación del gen implicado
- Mutación responsable
- Certeza de relación fenotipo/genotipo
Estudios genéticos previos (puesta a punto
para cada familia y enfermedad)
Estudio Básico Esterilidad
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Día + 1
Día + 2
Día +0 Día +0
Mayor respuesta e ICSI
Día + 3
2.Programación y ciclo FIV
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3.-Biopsia embrionaria
Tipos:
- Corpúsculo polar información
materna
- Blastómeras Habitual
- Blastocisto Más células
Poco tiempo
Día+3
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
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4- Diagnóstico genético
Sexado mediante PCR,
amplificando una región Y
Ausencia de banda: - Ausencia de núcleo
- Fallo en la entubación
- Fallo en la amplificación
- Fenómeno ADO
Año 1990
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HIBRIDACION IN SITU FLUORESCENTE (FISH)
Griffin et al; 1992
Fijación
núcleo
citoplasma núcleo
FISH
Verde - Cromosoma X Acqua - Cromosoma 18 Verde – Cromosoma 13 Rojo – Cromosoma 21
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LIMITACIONES DE FISH
- Fijación de un núcleo en un porta
- Fallo de hibridación
- Solapamiento de señales
- 10% de embriones no informativos
- No se pueden estudiar todos los cromosomas
Enf. Ligadas a X
50% de los XY son sanos, y se descartan
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SECUENCIA COMPLETA DEL GENOMA HUMANO (2000)
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
PCR MULTIPLE FLUORESCENTE
(GOLD STANDARD (Thornill et al., 2005))
ESTRATEGIAS METODOLÓGICAS
Limitaciones:
Escasez de ADN
Escasez de tiempo
6 pg
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
PCR múltiple fluorescente
Co-amplificación de diferentes loci en una
reacción de PCR única.
Permite realizar el análisis molecular indirecto y
en ocasiones el directo:
- Estudio indirecto de la enfermedad STR
- Diferenciar los portadores, enfermos y sanos
- Detectar contaminaciones y fenómenos de ADO
- Estudio directo de la mutación
cuando las mutaciones son dinámicas, ya que
afectan al tamaño del producto de la PCR,
siendo por tanto objetivable
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
DISEÑO DE LOS PROTOCOLOS BASADOS EN PCR
APLICADOS A PGD
a) Búsqueda de marcadores STR para estudio indirecto
Herramienta bioinformática: Genome Browser
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HEMOFILIA A
Amplia variedad de
mutaciones en el gen F8
TEST INFORMATIVOS (Estudios de informatividad)
Se eligen los marcadores en función de:
- localización en la región (locus)
- Alta heterocigosidad Informativos para cada familia
- Eficiencia de la amplificación
ESTUDIO INDIRECTO
STR: secuencias de ADN en las que un fragmento se repite de forma
consecutiva. La variación en el nº de repeticiones crea diferentes alelos
Se buscan STR intragénicos y extragénicos flanqueantes de la región
donde se ubica la mutación, con alta heterocigosidad.
F8
Xq28
DSX9901 DSX8087 G16PD
STR22 STR213
DSX1108
TEL
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Caso HEMOFILIA
Mujer portadora y tienen un hijo afecto.
El hijo habrá heredado la copia X mutada
de su madre
Haplotipo distinto
ESTUDIO DE INFORMATIVIDAD: Combinación de marcadores
asociados al alelo mutado Sano, portador o afecto.
X XX
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
DISEÑO Y OPTIMIZACIÓN DE LOS PROTOCOLOS
BASADOS EN PCR APLICADOS A PGD
b) Diseño de primers para PCR múltiples (Primer3)
- Objetivo es amplificar todos los marcadores en una
única reacción de PCR
- Rango de tamaños de cada producto no sea solapante
- Para discriminar cada marcador marcar los primers
con fluorocromos que emitan a diferentes λ
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
DISEÑO Y OPTIMIZACIÓN DE LOS PROTOCOLOS
BASADOS EN PCR APLICADOS A PGD
c) Material utilizado para la puesta a punto
ADN genómico en cantidades decrecientes
100ng/μl 5pg/μl
Posteriormente en célula única: blastómeras
d) Lisis celular: alcalina /enzimática
e) PCR múltiple: Qiagen Multiplex PCR KIT
f) Electroforesis capilar: secuenciador ABI Prism 3730
g) Análisis de los alelos (Genemapper)
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Experiencia de nuestro Centro en DGP aplicado a
Hemofilia A 135 156 174 175 231 306
128/128 158 171
175/177 172/172 229/229 308
311
128 135
156 171
175/177 174/172 229 231 306 311
128 158 172 229 308
175
128
171
177 172
229 311
FATHER
MOTHER
NON-CARRIER FEMALE EMBRYO
AFFECTED MALE EMBRYO
NON-AFFECTED MALE EMBRYO
DXS1073 STR13 STR22 DXS9901 DXS1108 DXS8087
Marcadores subrayados: combinación específica de marcadores ligados a la enfermedad
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
Estudio indirecto de hasta 16 marcadores STR
PGD-HLA Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
PCR múltiple fluorescente
Situaciones donde no es posible el diagnóstico con esta
metodología:
- Enferm. AD causada por mutación
puntual de novo (PAF)
- Casos complejos: No por
*STR no informativos en la familia Indirecto
*No existencia de STR muy polimórficos
en la región (SCA3)
Situaciones mejorables:
Enferm monogénica + HLA: Biopsia de 2 blastómeras
muchos marcadores
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Picogramos Microgramos
WGA (Whole genome amplification)
Generar una nueva muestra igual que no se distingue de la original pero con una alta concentración
de ADN
Técnicas:
- PEP (primer extension preamplification).
(Zhang et al; 1992)
- DOP – PCR (degenerate oligonucleotide primed PCR)
(Telenius et al; 1992)
- Técnica MDA (Multiple displacement amplification)
(Dean et al., 2002)
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MDA (Hellani et al., 2005)
- Se consigue una alta cantidad de ADN a partir de
una blastómera, con una baja tasa de error
- Se puede aplicar posteriormente una amplia
variedad de técnicas (PCRmf, secuenciación,
MLPA…)
se favorecen mayor nº de familias
- No compromete los resultados y permite realizar
repeticiones diagnóstico fiable
1 blastómera
Tranquilidad
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
Técnicas de WGA Mayor cantidad de ADN
Enfermedades
Monogénicas
Técnicas basadas
en PCR
Todo el complemento
cromosómico
aCGH Wells et al., 2008
Fiorentino et al., 2009
1 única célula
Transferir embriones sin la enfermedad y euploides (Obradors et al., 2008, Handyside et al., 2010, Daina et al., 2012)
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
5.Transferencia y congelación de embriones
12 ovocitos (M II)
(J. Harper)
10 fecundados 1 sin resultados
8 biopsiados 4 afectos
1 bloqueado
2 transferidos
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5.Transferencia y congelación de embriones
Método de congelación Vitrificación
- En caso de gestación se recomienda DP
- TG/cp: 21% (ESHRE)
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Enfermedades Autosómicas Dominantes Nº Enfermedades ligadas a X Recesivas Nº
Enfermedad de Steinert 28 Hemofilia A 33
Corea de Huntington 26 Distrofia Muscular de Duchenne 21
Poliposis adenomatosa familiar 11 Distrofia Muscular de Becker 4
Síndrome de Marfan 3 Hemofilia B 4
Enfermedad de Machado Joseph (SCA3) 2 Síndrome de Morris 3
Enfermedades Autosómicas Recesivas Nº Agammaglobulinemia tipo Bruton 3
Fibrosis quística 27 Hidrocefalia ligada a X 1
Atrofia muscular espinal 14 Síndrome de Lowe 1
Enfermedades ligadas a X Dominantes Nº Síndrome de Duncan 1
Síndrome de X-frágil 12 Retinosis Pigmentaria ligada a X 1
Síndrome de Alport ligado a X 4 Inmunodeficiencia Severa Combinada ligada a X 1
Tipaje HLA / PGD + Tipaje HLA Nº Alfa-talasemia ligada a X 1
Beta-talasemia Mayor + HLA 5 Enfermedad de Menkes 1
Tipaje HLA 2 Síndrome de Wiskott Aldrich ligado a X 1
Síndrome de Shwachman-Diamond + HLA 1 Enfermedad de Pelizaeus Merzbacher 1
Inmunodeficiencia por déficit de adenosín-deaminasa
+ HLA 1 Síndrome de Opitz ligado a X 1
Granulomatosis + HLA 1
Tabla R-1: Distribución de nº de pacientes según las distintas enfermedades.
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
Enfermedad Partos
HA y HB 14
DMD y DMB 9
DM Steinert 9
FQ 7
CH 3
AME 3
X- Frágil 3
Sd. Alport lig a X 2
PGD-HLA 2
Sd. de Lowe 1
PAF 1
54 partos y 66 rn
44% partos vaginales
3 DP
No discordancias
Resultados neonatales
Tparto/pareja: 25%
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Enfermedad Partos
HA y HB 14
DMD y DMB 9
DM Steinert 9
FQ 7
CH 3
AME 3
X- Frágil 3
Sd. Alport lig a X 2
PGD-HLA 2
Sd. de Lowe 1
PAF 1
54 partos y 66 rn
44% partos vaginales
3 DP
No discordancias
Resultados neonatales
Tparto/pareja: 25%
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Next-generation sequencing (NGS) Secuenciación masiva
Secuenciación 1º genoma humano
13 años -----100,000,000 dólares
NGS en blastómera
3 días----1,000 dólares
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
Next-generation sequencing (NGS) Secuenciación masiva
Fiorentino et al., 2014
- Permite realizar PGD y PGS en una sola célula
- Abre el futuro a nuevas posibilidades:
- aumento de defectos genéticos que se pueden
diagnosticar (enf monogénicas)
- Mutaciones mitocondriales
- Síndromes microdeleccionales
- menor coste y poco tiempo
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Next-generation sequencing (NGS) Secuenciación masiva
Fiorentino et al., 2014
- Permite realizar PGD y PGS en una sola célula
- Abre el futuro a nuevas posibilidades:
- aumento de defectos genéticos que se pueden
diagnosticar (enf monogénicas)
- Mutaciones mitocondriales
- Síndromes microdeleccionales
- menor coste y poco tiempo
UN MÉTODO PARA TODO
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TEST de COMPATIBILIDAD GENÉTICA
(Programas de donación de gametos)
Donante y receptor
(enfermedades AR)
Compatibles No compatibles
cambio de donante
Matching genético Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
Métodos de diagnóstico genético al
alcance de la población general
Dirigidos a conocer nuestro estado de portador
Prevención enfermedades monogénicas
Queremos saber si
somos portadores
de…………
PGD
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ADN nuclear libre
0.01ml
PGD / PGS
Nuevas fuentes de ADN
- Medios de cultivo (Assou et al,. 2014; Wu et al., 2015)
- Blastocele (Palini et al.,2014, Gianaroli et al.,2014, Tobler et al., 2015,
Magli et al., 2016)
TECNICAS NO INVASIVAS Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
Blastocentesis
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
Tecnología CRISPR/Cas9 E. Charpentier y J. Doudna
Técnica de edición genética
Avance científico del año 2015 – Science
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
Tecnología CRISPR/Cas9 E. Charpentier y J. Doudna
Técnica de edición genética
Avance científico del año 2015 – Science
Bolotin et al., 2005
Mojica et al., 2005
Pourcel et al., 2005
J. Doudna
Terapia génica
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
Vassena et al., 2016 Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
J. Doudna
Tecnología CRISPR/Cas9 E. Charpentier y J. Doudna
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
J. Doudna
Tecnología CRISPR/Cas9 E. Charpentier y J. Doudna
PGD = opción reproductiva
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
mariad.lozano.sspa@juntadeandalucia.es
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