otras tÉcnicas de amplificaciÓn sistema de amplificaciÓn basado en la transcripciÓn, reacciÓn...

OTRAS TÉCNICAS DE AMPLIFICACIÓN

SISTEMA DE AMPLIFICACIÓN BASADO EN LA TRANSCRIPCIÓN, REACCIÓN EN CADENA DE LA LIGASA

SISTEMA DE AMPLIFICACIÓN BASADO EN LA TRANSCRIPCIÓN

• TMA es un sistema de amplificación basado en la transcripción del ARN con dos enzimas para producir la reacción– ARN polimerasa– transcriptasa inversa (o reversa).

• TMA es isotérmica, toda la reacción se lleva a cabo a la misma temperatura en un baño de agua o bloque de calor.

• Esto está en contraste con otras reacciones de amplificación como la PCR o LCR que requieren un instrumento termociclador para cambiar rápidamente la temperatura para producir la reacción.

REACCIÓN EN CADENA DE LA LIGASA

• La técnica de la ligasa no está tan desarrollada y es más compleja que la de la polimerasa, además requiere mínimo 1000 fragmentos para poder amplificar, pero este mínimo es suficiente para su aplicación en el diagnóstico prenatal.

• La técnica se utiliza principalmente para el diagnóstico de enfermedades víricas y genéticas.

PROCESO DE LCR

• Cuatro cebadores se alinean en regiones inmediatamente adyacentes al molde.

• Dos de ellos se alinean con la cadena superior.• El segundo par de cebadores es

complementario del primero y se alinea con la cadena opuesta.

• La hibridación entre los cebadores se evita incluyendo ADN portador y una cola 3' en cebadores opuestos.

• Estos cebadores se mezclan con el molde y la ligasa termoestable, y se incuban a 95 °C durante 1 minuto para la desnaturalización, y a continuación a 65 °C durante 4 minutos, para la alineación del cebador y la ligazón.

• Los pasos de desnaturalización y alineación/ligazón se repiten 10-20 ciclos.

• Cuatro cebadores se alinean en regiones inmediatamente adyacentes al molde.

• Dos de ellos se alinean con la cadena superior.• El segundo par de cebadores es complementario

del primero y se alinea con la cadena opuesta.• La hibridación entre los cebadores se evita

incluyendo ADN portador y una cola 3' en cebadores opuestos.

• Los pasos de desnaturalización y alineación/ligazón se repiten 10-20 ciclos.

Estos cebadores se mezclan con el molde y la ligasa termoestable, y se incuban a 95 °C durante 1 minuto para la desnaturalización, y a continuación a 65 °C durante 4 minutos, para la alineación del cebador y la ligazón.

Proceso de amplificación de la reacción en cadena de la ligasa