Προιοριμός mic, mbc · 2014. 6. 24. · – tables 2a έως 2l (m100-s18, vol.28, clsi)...

Προσδιορισμός MIC, MBC

Γεωργία Βρυώνη

Έλεγχος ευαισθησίας με τη μέθοδο αραιώσεων των αντιβιοτικών

Αρχή: – Έκθεση μικροβιακού εναιωρήματος σε διαφορετικές συγκεντρώσεις αντιβιοτικού

– Η μικρότερη συγκέντρωση αντιβιοτικού που δεν επιτρέπει την ανάπτυξη του μικροοργανισμού in vitro

Ελάχιστη Ανασταλτική Πυκνότητα του φαρμάκου (ΕΑΠ) Minimun Inhibitory Concentration (MIC)

Ελάχιστη Ανασταλτική Πυκνότητα Minimum Inhibitory Concentration (MIC)

Όχι απόλυτη τιμή – Η αληθινή τιμή μεταξύ της MIC που αναστέλλει τη μικροβιακή ανάπτυξη και της αμέσως υποδιπλάσιας αραίωσης που επιτρέπει τη μικροβιακή ανάπτυξη

Αραιώσεις αντιβιοτικού υποδιπλάσιες (5-7): 1, 2, 4, 8, 16μg/mL

Κρίσιμες συγκεντρώσεις αντιβιοτικού (1 - 3) [ Breakpoint MIC ] :

Π.χ. 4, 6, 8, 12, 16 μg/mL

Ελάχιστη Ανασταλτική Πυκνότητα Minimum Inhibitory Concentration (MIC)

MIC50

– Η ελάχιστη συγκέντρωση του αντιβιοτικού που αναστέλλει την ανάπτυξη 50% των υπό έλεγχο στελεχών (εντός του ίδιου είδους)

MIC90

– Η ελάχιστη συγκέντρωση του αντιβιοτικού που αναστέλλει την ανάπτυξη 90% των

υπό έλεγχο στελεχών (εντός του ίδιου είδους)

Ελάχιστη Ανασταλτική Πυκνότητα Minimum Inhibitory Concentration (MIC)

Ερμηνεία:

3 κατηγορίες ευαισθησίας μικροοργανισμών – Ευαίσθητοι (Susceptible)

– Μέτρια ευαίσθητοι (Intermediate)

– Ανθεκτικοί (Resistant)

Κριτικές συγκεντρώσεις

S I R

c C

δύο συγκεντρώσεις

MIC c c < MIC C MIC > C

c : χαμηλή

C : υψηλή

Έλεγχος ευαισθησίας με τη μέθοδο αραιώσεων των αντιβιοτικών

Είδη: – Μέθοδος αραιώσεων σε ζωμό (broth dilution method)

Μακρο-μέθοδος (macrodilution)

Μικρο-μέθοδος (microdilution)

– Μέθοδος αραιώσεων σε άγαρ (agar dilution method)

Μέθοδοι αναφοράς (Standard Reference Methods) Μέθοδοι προτυποποιημένες

Αντιβιοτικά Πρότυπες ουσίες

– περιεκτικότητα σε δραστική ουσία ή ενεργότητα (μg/mg ή IU/mg)

– ημερομηνία λήξης – διατήρηση: </= -20ο C

Παρασκευή μητρικού διαλύματος (stock solution) – άνοιγμα αφού πάρουν θο C δωματίου (υδρατμοί)

καταστροφή β-λακταμικών αντιβιοτικών αύξηση βάρους υγροσκοπικών ουσιών (αμινογλυκοσίδες)

– προστασία από μεγάλη έκθεση στο φως ριφαμπικίνη, πολυμιξίνη Β σκοτάδι

– συγκέντρωση (1000 μg/mL ή 10 χ μεγαλύτερης συγκέντρωσης)

– γνωστό το ακριβές βάρος της ουσίας – επιλογή / υπολογισμός διαλύτη (Table 4, M7-MIC)

Αντιβιοτικά Πρότυπες ουσίες

– περιεκτικότητα σε δραστική ουσία ή ενεργότητα (μg/mg ή IU/mg)

– ημερομηνία λήξης – διατήρηση: </= -20ο C

Παρασκευή μητρικού διαλύματος (stock solution) – άνοιγμα αφού πάρουν θο C δωματίου (υδρατμοί)

καταστροφή β-λακταμικών αντιβιοτικών αύξηση βάρους υγροσκοπικών ουσιών (αμινογλυκοσίδες)

– προστασία από μεγάλη έκθεση στο φως ριφαμπικίνη, πολυμιξίνη Β σκοτάδι

– συγκέντρωση (1000 μg/mL ή 10 χ μεγαλύτερης συγκέντρωσης)

– γνωστό το ακριβές βάρος της ουσίας – επιλογή / υπολογισμός διαλύτη (Table 4, M7-MIC)

ποσότητα που ζυγίστηκε (mg) X ενεργότητα (μg/mg) Όγκος (mL)= --------------------------------------------- επιθυμητή συγκέντρωση (μg/mL) όγκος (mL) X συγκέντρωση (μg/mL) Βάρος (mg)= ------------------------------- ενεργότητα (μg/mg)

Αντιβιοτικά Διατήρηση μητρικού διαλύματος (stock solution)

– όχι απαραίτητη η αποστείρωση αν ναι: διήθηση με ειδικά φίλτρα

– διαμοίραση σε μικρές ποσότητες σωλην. πολυ-προπυλενίου, -αιθυλενίου, -στυρενίου

– Θερμοκρασία </= -60o C για ~ 6 μήνες ποτέ > -20ο C Ιμιπενέμη, κεφακλόρη, κλαβουλανικό οξύ, ριφαμπικίνη: </= -70o C για 1 μήνα

Αμπικιλλίνη, τριμεθοπρίμη και άλλα σε διαλύματα φωσφορικών: ίζημα (καλή ανάδευση)

– Αποφυγή απόψυξης / ψύξης

Επιλογή αντιβιοτικών Είδος αντιβιοτικού ανάλογα

– μικροβιακού είδους

Μη απαιτητικά

Απαιτητικά

Table 1, M100-S18, Vol.28 No.1

Εντεροβακτηριακά Pseudomonas aeruginosa και άλλα μη-εντεροβακτηριακά Staphylococcus spp. Enterococcus spp. Acinetobacter spp. Burkolderia cepacia, Stenotrophomonas maltophilia

Haemophilus spp. Neisseria gonorrhoeae Streptococcus pneumoniae Streptococcus spp. εκτός από S. pneumoniae

– Εστίας λοίμωξης, αντοχής, αλλεργίας, κλπ Ομάδα Α: υποχρεωτικά (primary testing) Ομάδα Β:

– αντοχή στην ομάδας Α – περιοχή λοίμωξης: SXT και ουρολοίμωξη, 3η γενιάς κεφαλοσπορίνες και CSF

– πολυμικροβιακή λοίμωξη,πολλές εστίες λοίμωξης, αλλεργία, μη απάντηση σε Ομ. Α

– επιδημιολογικοί λόγοι

Ομάδα C: εναλλακτική ή επιπλέον αγωγή Ομάδα U: θεραπεία ουρολοίμωξης Ομάδα Inv. “Investigational”

Επιλογή συγκεντρώσεων αντιβιοτικών

Κριτικές συγκεντρώσεις (Breakpoints) – Tables 2A έως 2L (M100-S18, Vol.28, CLSI)

Συνολικός αριθμός απόφαση του εργαστηρίου – τέτοιος ώστε ένας τουλάχιστον μικροοργανισμός

ποιοτικού ελέγχου να έχει όλες τις διαδοχικές τιμές συγκεντρώσεων

– ασυνήθεις συγκεντρώσεις σε επιλεγμένες περιπτώσεις, όπως υψηλές για Έλεγχος υψηλού επιπέδου αντοχής σε γενταμυκίνη /

στρεπτομυκίνη στους εντεροκόκκους (High-Level Aminoglycoside Resistance, HLAR)

Μικροβιακό εναιώρημα Θολερότητα: 0.5 κλίμακας McFarland

– 1-2 x 108 CFU/mL για E. coli ATCC 25922

Μέθοδος – άμεσο εναιώρημα αποικίας (direct colony suspension m.)

– εναιώρημα λογαριθμικής φάσης ανάπτυξης (growth method)

Μικροβιακό εναιώρημα Θολερότητα: 0.5 κλίμακας McFarland

– 1-2 x 108 CFU/mL για E. coli ATCC 25922

Μέθοδος – άμεσο εναιώρημα αποικίας (direct colony suspension m.)

– εναιώρημα λογαριθμικής φάσης ανάπτυξης (growth method)

•Η πιο κατάλληλη Η μόνη για: Staphylococcus spp., Haemophilus spp., N. gonorrhoeae, N. meningitidis και στρεπτοκόκκους Τρόπος: εναιώρημα σε ζωμό ή φ.ο. τρυβλίο μη εκλεκτικού υλικού (αιματούχο άγαρ) μετά18-24 h επώασης

Μικροβιακό εναιώρημα Θολερότητα: 0.5 κλίμακας McFarland

– 1-2 x 108 CFU/mL για E. coli ATCC 25922

Μέθοδος – άμεσο εναιώρημα αποικίας (direct colony suspension m.)

– εναιώρημα λογαριθμικής φάσης ανάπτυξης (growth method)

•Η πιο κατάλληλη Η μόνη για: Staphylococcus spp., Haemophilus spp., N. gonorrhoeae, N. meningitidis και στρεπτοκόκκους Τρόπος: εναιώρημα σε ζωμό ή φ.ο. τρυβλίο μη εκλεκτικού υλικού (αιματούχο άγαρ) μετά18-24 h επώασης

•Εναλλακτικά, ιδίως αν δεν είναι δυνατή η δημιουργία ομοιόμορφου εναιωρήματος •Σε μη απαιτητικά μικρόβια (εκτός Staphylococcus) όταν δεν υπάρχει πρόσφατο καλλιέργημα

Τρόπος: 3-5 αποικίες σε 4-5mL ζωμού (tryptic soy broth) επώαση 35ο C έως θολερότητα =/>0.5 McFarland (2-6h) θολερότητα 0.5 με ζωμό ή φ.ο.

Παρασκευή μικροβιακού εναιωρήματος (inoculum)

Θολερότητα 0.5 κλίμακας McFarland ( 1-2 Χ 108 CFU/ml E.coli ATCC® 25922 ) ή με φωτόμετρο

0.5McF E.coli ATCC 25922

Μέθοδος αραιώσεων σε ζωμό

Μακρομέθοδος: σωληνάρια

Μικρομέθοδος: πλάκα μικροτιτλοποίησης

Μέθοδος αραιώσεων σε ζωμό

Υλικό: Mueller-Hinton broth (MHΒ) – pH 7.2 – 7.4 σε θο C περιβάλλοντος (25ο C) – Ιόντα: αμινογλυκοσίδες & Pseudomonas, τετρακυκλίνες, δαπτομυσίνη

& gram(+) Ca++: 20-25 mg/L (50 για daptomycin) Mg++: 10-12.5 mg/L

– HTM για Haemophilus spp. – 2% NaCl για οξασιλλίνη, μεθικιλλίνη, ναφκιλλίνη (σταφυλόκοκκοι) – 2.5-5% aίμα (LHB): για S. pneumoniae, N. meningitis

στρεπτοκόκκους

Ενοφθαλμισμός Επώαση: 35±2ο C για 16-20 h

– 20-24h για Acinetobacter spp., B. cepacia, S. maltophilia, Haemophilus spp S. pneumoniae, λοιποί στρεπτόκοκκοι – 24h για oxacillin σε Staphylococcus, βανκομυκίνη σε Enterococcus και

γενταμυκίνη / στρεπτομυκίνη HLAR σε Enterococcus – 5% CO2 για N. meningitis (20-24h)

Μέθοδος αραιώσεων σε ζωμό

Υλικό: Mueller-Hinton broth (MHΒ) – pH 7.2 – 7.4 σε θο C περιβάλλοντος (25ο C) – Ιόντα: αμινογλυκοσίδες & Pseudomonas, τετρακυκλίνες, δαπτομυσίνη

& gram(+) Ca++: 20-25 mg/L (50 για daptomycin) Mg++: 10-12.5 mg/L

– HTM για Haemophilus spp. – 2% NaCl για οξασιλλίνη, μεθικιλλίνη, ναφκιλλίνη (σταφυλόκοκκοι) – 2.5-5% aίμα (LHB): για S. pneumoniae, N. meningitis

στρεπτοκόκκους

Ενοφθαλμισμός Επώαση: 35±2ο C για 16-20 h

– 20-24h για Acinetobacter spp., B. cepacia, S. maltophilia, Haemophilus spp S. pneumoniae, λοιποί στρεπτόκοκκοι – 24h για oxacillin σε Staphylococcus, βανκομυκίνη σε Enterococcus και

γενταμυκίνη / στρεπτομυκίνη HLAR σε Enterococcus – 5% CO2 για N. meningitis (20-24h)

Εμπλουτισμένο ΜΗΒ Caution-adjusted ΜΗΒ (CAMHB)

Μέθοδος αραιώσεων σε ζωμό

Υλικό: Mueller-Hinton broth (MHΒ) – pH 7.2 – 7.4 σε θο C περιβάλλοντος (25ο C) – Ιόντα: αμινογλυκοσίδες & Pseudomonas, τετρακυκλίνες, δαπτομυσίνη

& gram(+) Ca++: 20-25 mg/L (50 για daptomycin) Mg++: 10-12.5 mg/L

– HTM για Haemophilus spp. – 2% NaCl για οξασιλλίνη, μεθικιλλίνη, ναφκιλλίνη (σταφυλόκοκκοι) – 2.5-5% aίμα (LHB): για S. pneumoniae, N. meningitis

στρεπτοκόκκους

Ενοφθαλμισμός Επώαση: 35±2ο C για 16-20 h

– 20-24h για Acinetobacter spp., B. cepacia, S. maltophilia, Haemophilus spp S. pneumoniae, λοιποί στρεπτόκοκκοι – 24h για oxacillin σε Staphylococcus, βανκομυκίνη σε Enterococcus και

γενταμυκίνη / στρεπτομυκίνη HLAR σε Enterococcus – 5% CO2 για N. meningitis (20-24h)

Εμπλουτισμένο ΜΗΒ Caution-adjusted ΜΗΒ (CAMHB)

Διαφορές από Κ-Β:

Υλικό: CAMHB (με 50 μg/mL Ca++ αν δαπτομυσίνη)

Προσθήκη αίματος: αλόγου LHB (όχι προβάτου) σε

N. meningitis, S. pneumoniae

και λοιπούς στρεπτοκόκκους

Χρόνος επώασης έως 20h (όχι 18h)

Περιβάλλον επώασης:

ΌΧΙ 5% CO2 για Haemophilus spp., S. pneumoniae

Mueller

Hinton

Broth

1 ml

1 ml

0 0.5 1 2 4 8 16 µg/ml

108 CFU

35°C για 16 - 20 h

0 0.5 1 2 4 8 16 µg/ml

0 0.5 1 2 4 8 16 µg/ml

Μέθοδος αραιώσεων σε ζωμό Μέθοδος αναφοράς για CLSI

MIC = 4

Μακρομέθοδος: S. aureus και τετρακυκλίνη

Ανάπτυξη φαίνεται στη συγκέντρωση τετρακυκλίνης 0.8 μg/ml αλλά όχι στην 1.6 μg/ml.

Μακρομέθοδος

Ανάγνωση αποτελεσμάτων

Μακρομέθοδος: S. aureus και τετρακυκλίνη

Ανάπτυξη φαίνεται στη συγκέντρωση τετρακυκλίνης 0.8 μg/ml αλλά όχι στην 1.6 μg/ml.

Μακρομέθοδος

Ανάγνωση αποτελεσμάτων

MIC είναι 1.6 μg/ml.

Ανάγνωση αποτελεσμάτων

Μικρομέθοδος

Ceftizoxime (C.III)

Ανάγνωση αποτελεσμάτων

Μικρομέθοδος

Ceftizoxime (C.III)

Ανάγνωση αποτελεσμάτων

Μικρομέθοδος

η ελάχιστη συγκέντρωση του αντιβιοτικού που επιτρέπει την επιβίωση 1/10.000 βακτήρια ή 0.01% του αρχικού εναιωρήματος

Ελάχιστη Βακτηριοκτόνος Πυκνότητα Minimal Bactericidal Concentration MBC

για πολλές σύγχρονες ουσίες είναι πλησίον της MIC κύρια επιδίωξη για τη θεραπευτική επιτυχία σε

βαριές λοιμώξεις: ενδοκαρδίτιδα οστεομυελίτιδα λοιμώξεις σε ανοσοκατεσταλμένους (ουδετεροπενικοί)

Ελάχιστη Βακτηριοκτόνος Πυκνότητα Minimal Bactericidal Concentration MBC

Μέθοδος

Προσδιορισμός MIC (μακρο-/μικρο-μέθοδος) Αραιώσεις αντιβιοτικού από 8χ έως ½ ή ¼ x MIC

128 - 0.06 μg/mL

Ανακαλλιέργεια σε στερεό θρεπτικό υλικό από τα σωληνάρια ή πηγαδάκια χωρίς ορατή μικροβιακή ανάπτυξη

Προσδιορισμός MBC ως την ελάχιστη πυκνότητα του αντιβιοτικού που προκαλεί θάνατο στα 99,9% των μικροβιακών κυττάρων

Μέθοδος όχι προτυποποιημένη Κατάλληλη για την αξιολόγηση νέων αντιβιοτικών και για ερευνητικούς σκοπούς

Μέθοδος προσδιορισμού MBC

10 µl

0 µg/ml

4 µg/ml

8 µg/ml

16 µg/ml

MBC = ?

0 0.5 1 2 MIC = 4 8 16 µg/ml

35 2°C για 24h Gram(-)

βακτηρίδια

48h Staphylococcus Enterococcus

72h άλλα βακτήρια

Καθορισμός του κρίσιμου αριθμού αποικιών για προσδιορισμό MBC

Τελικό εναιώρημα (CFU/mL)

Κρίσιμος αριθμός

αποικιών

Ευαισθησία (%) Ειδικότητα (%)

1 x 105 4 77 97

2 x 105 8 89 99

3 x 105 15 99 99

4 x 105 20 99 99

5 x 105 25 99 99

6 x 105 29 99 99

Μέθοδος προσδιορισμού MBC

Καθορισμός του κρίσιμου αριθμού αποικιών για προσδιορισμό MBC

Τελικό εναιώρημα (CFU/mL)

Κρίσιμος αριθμός

αποικιών

Ευαισθησία (%) Ειδικότητα (%)

1 x 105 4 77 97

2 x 105 8 89 99

3 x 105 15 99 99

4 x 105 20 99 99

5 x 105 25 99 99

6 x 105 29 99 99

Μέθοδος προσδιορισμού MBC

Σωληνάριο Συγκέντρωση αντιβιοτικού

μg/mL

Αριθμός αποικιών

CFU

≥99.9%

Θάνατος

1 128 2 ΝΑΙ

2 64 11 ΝΑΙ

3 32 18 ΝΑΙ

4 16 33 ΌΧΙ

5 8 Μη μετρούμενες ΌΧΙ

MBC = 32 μg/mL

Καθορισμός του κρίσιμου αριθμού αποικιών για προσδιορισμό MBC

Τελικό εναιώρημα (CFU/mL)

Κρίσιμος αριθμός

αποικιών

Ευαισθησία (%) Ειδικότητα (%)

1 x 105 4 77 97

2 x 105 8 89 99

3 x 105 15 99 99

4 x 105 20 99 99

5 x 105 25 99 99

6 x 105 29 99 99

Μέθοδος προσδιορισμού MBC

Σωληνάριο Συγκέντρωση αντιβιοτικού

μg/mL

Αριθμός αποικιών

CFU

≥99.9%

Θάνατος

1 128 2 ΝΑΙ

2 64 11 ΝΑΙ

3 32 18 ΝΑΙ

4 16 33 ΌΧΙ

5 8 Μη μετρούμενες ΌΧΙ

MBC = 32 μg/mL

Υπολογισμός εναιωρήματος (CFU/mL)

του σωληναρίου χωρίς αντιβιοτικό

1.Αραίωση εναιωρήματος 2.Ενοφθαλμισμός συγκεκριμένης ποσότητας σε τρυβλίο 3.Υπολογισμός (CFU/mL): αριθμός αποικιών x ποσότητα ενοφθαλμισμού x αραίωση

Συγκέντρωση αντιβιοτικού σε μg/mL (+) μάρτυρας

ανάπτυξης

Τελευταίο σωληνάριο με ορατή ανάπτυξη

Επώαση για 16-20h

MIC = 0.125μg/mL

Ανακαλλιέργεια σε τρυβλία

CFU / mL Επιβίωση 0.01%

MIC=0.125μg/mL

MBC=0.25μg/mL

MΒC / MΙC=2 < 4

Αντιβιοτικό = βακτηριοκτόνο

Αν MΒC/MΙC < 4 τότε το αντιβιοτικό είναι βακτηριοκτόνο

Δράση βακτηριοκτόνος

Δράση βακτηριοστατική

128 64 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25 μg/mL

128 64 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25 μg/mL

Όχι

αντιβιοτικό

Όχι

αντιβιοτικό

Όχι

μικρόβιο

Όχι

μικρόβιο

MIC - MBC

MIC MBC

Βακτηριοκτόνο – Bactericidal (MBC/MIC < 4)

MIC MBC

Βακτηριοστατικό- Bacteriostatic (MBC/MIC > 4)

1 2 8 16 32 64 128 4

1 2 8 16 32 64 128 4

Η γενταμυκίνη είναι βακτηριοκτόνο αντιβιοτικό γιατί: MIC = 0.8 μg/ml (ανάπτυξη 0.4, όχι 0.8) και MBC = 0.8. Άρα MBC = MIC.

Gentamicin 0.1 0.2 0.4 0.8 1.6 3.1

Η τετρακυκλίνη είναι βακτηριοστατικό αντιβιοτικό γιατί: MIC = 1.6 μg/ml, και ανάπτυξη σε 3.1, 6.3, και ίχνη σε 12.5 μg/ml, Άρα MBC 4 αραιώσεις υψηλότερη στα 25 μg/ml.

Tetracycline 0.1 0.2 0.4 0.8 1.6 3.1 6.3 12.5

Μέθοδος αραιώσεων σε άγαρ

Tρυβλία με αντιβιοτικό (το κάθε ένα με διαφορετική συγκέντρωση) Πολλές κηλίδες από διαφορετικά στελέχη που ελέγχονται ταυτόχρονα (30-35 / τρυβλίο 100 mm) Καταγραφή της MIC

Μέθοδος αραιώσεων σε άγαρ

Υλικό: Mueller-Hinton Agar (MHA) – pH 7.2 – 7.4 σε θο C περιβάλλοντος αφού πήξει – Όχι ιόντα Mg ή Ca – NaCl 2% w/v για οξασιλλίνη, μεθικιλλίνη, ναφκιλλίνη (σταφυλόκοκκοι) – 5% αίμα προβάτου για N. meningitis και στρεπτοκόκκους πλην S.

pneumoniae, ή αλόγου (LHB) για σουλφοναμίδες σε στρεπτοκόκκους και για λιστέρια

Ενοφθαλμισμός – Συγκεκριμένη ποσότητα – Τοποθέτηση ως κηλίδα 5-8 mm στο ΜΗΑ (104 CFU/κηλίδα)

Επώαση: 35±2ο C για 16-20 h – 20-24h για Acinetobacter spp., B. cepacia, S. maltophilia, – 24h για oxacillin σε Staphylococcus, βανκομυκίνη σε Enterococcus και

γενταμυκίνη / στρεπτομυκίνη HLAR σε Enterococcus – 5% CO2 για N. meningitis, N. gonorrhoeae (36±1o C) και στρεπτοκόκκους

(20-24h)

Μέθοδος αραιώσεων σε άγαρ

Υλικό: Mueller-Hinton Agar (MHA) – pH 7.2 – 7.4 σε θο C περιβάλλοντος αφού πήξει – Όχι ιόντα Mg ή Ca – NaCl 2% w/v για οξασιλλίνη, μεθικιλλίνη, ναφκιλλίνη (σταφυλόκοκκοι) – 5% αίμα προβάτου για N. meningitis και στρεπτοκόκκους πλην S.

pneumoniae, ή αλόγου (LHB) για σουλφοναμίδες σε στρεπτοκόκκους και για λιστέρια

Ενοφθαλμισμός – Συγκεκριμένη ποσότητα – Τοποθέτηση ως κηλίδα 5-8 mm στο ΜΗΑ (104 CFU/κηλίδα)

Επώαση: 35±2ο C για 16-20 h – 20-24h για Acinetobacter spp., B. cepacia, S. maltophilia, – 24h για oxacillin σε Staphylococcus, βανκομυκίνη σε Enterococcus και

γενταμυκίνη / στρεπτομυκίνη HLAR σε Enterococcus – 5% CO2 για N. meningitis, N. gonorrhoeae (36±1o C) και στρεπτοκόκκους

(20-24h)

Όχι για δαπτομυσίνη [λιποπεπτίδιο για gram(+)]

Όχι για H. influenzae και H. parainfluenzae

Όχι για S. pneumoniae

N. gonorrhoae: GC άγαρ, 5% CO2, 36±1o C

Έτοιμα συστήματα προσδιορισμού MIC

Χειροκίνητα

Ημιαυτοματοποιημένα

Αυτοματοποιημένα

Etest

MicroScan Autoscan 4 Wider I ATB system

Vitek System Phoenix System MicroScan WalkAway

Σύγκριση αποτελεσμάτων AST panels με μέθοδο αραιώσεων σε ζωμό (μέθοδος αναφοράς) τουλάχιστον 100 κλινικά στελέχη ίδιου γένους ή είδους Πολύ μεγάλα σφάλματα (very major errors) ψευδώς ευαίσθητα: < 1.5% Μεγάλα σφάλματα (major errors) ψευδώς ανθεκτικά: < 3% Συμφωνία με μέθοδο αναφοράς (± 1 αραίωση): ≥ 90%

Μέθοδος κλιμακωτής (gradient) διάχυσης

Ταινίες Εtest (strips): διαβαθμισμένες συγκεντρώσεις αντιβιοτικού

Συγκεκριμένο εναιώρημα σε ΜΗΑ

Μετά επώαση, αναστολή ανάπτυξης σε σχήμα έλλειψης

MIC: σημείο που η έλλειψη

συναντά την ταινία

Μέθοδος κλιμακωτής (gradient) διάχυσης

Ταινίες Εtest (strips): διαβαθμισμένες συγκεντρώσεις αντιβιοτικού

Συγκεκριμένο εναιώρημα σε ΜΗΑ

Μετά επώαση, αναστολή ανάπτυξης σε σχήμα έλλειψης

MIC: σημείο που η έλλειψη

συναντά την ταινία

Πρώτη παρουσίαση: 1988 στο Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemo-therapy (ICAAC)

Food and Drug Administration (FDA) έγκριση

* προσοχή: ανά μικρόβιο ή οικογένεια μικροβίων και αντιβιοτικό

Εtest

Υλικό: ΜΗΑ

Εναιώρημα - ενοφθαλμισμός: όπως Κ-Β

Τοποθέτηση ταινιών Εtest

Επώαση (όπως Κ-Β)

Ανάγνωση αποτελεσμάτων – Οδηγίες κατασκευαστού

– Προσδιορισμός MIC (CLSI κριτήρια)

Μέθοδος (σύμφωνα με οδηγίες κατασκευαστού)

Μέθοδος Etest

5 min στους 35 °C

< 15 min

Εναιώρημα (σε φ.ο.)

35°C

35°C

CO2

Μέτρηση McF

Ενοφθαλμισμός

κλίβανος

Μέθοδος Etest

5 min στους 35 °C

< 15 min

Εναιώρημα (σε φ.ο.)

35°C

35°C

CO2

Μέτρηση McF

Ενοφθαλμισμός

κλίβανος

Εtest

Ανάγνωση αποτελεσμάτων

MIC: όπου η έλλειψη συναντά την ταινία Προσοχή

– στον ερπυσμό,

– στην αιμόλυση

Αν μεταξύ αραιώσεων: MIC η μεγαλύτερη αραίωση

Σύμφωνα με οδηγίες κατασκευαστή

Εtest

Ανάγνωση αποτελεσμάτων

MIC: όπου η έλλειψη συναντά την ταινία Προσοχή

– στον ερπυσμό,

– στην αιμόλυση

Αν μεταξύ αραιώσεων: MIC η μεγαλύτερη αραίωση

Σύμφωνα με οδηγίες κατασκευαστή

Εtest

Ανάγνωση αποτελεσμάτων

MIC: όπου η έλλειψη συναντά την ταινία Προσοχή

– στον ερπυσμό,

– στην αιμόλυση

Αν μεταξύ αραιώσεων: MIC η μεγαλύτερη αραίωση

Σύμφωνα με οδηγίες κατασκευαστή

Εtest

Ανάγνωση αποτελεσμάτων

Στα βακτηριοκτόνα αντιβιοτικά: πλήρης αναστολή ανάπτυξης (όχι μικροαποικίες και

θόλωση (haze))

Στα βακτηριοστατικά αντιβιοτικά: 80% αναστολή ανάπτυξης

Σύμφωνα με οδηγίες κατασκευαστή

Εtest

Ανάγνωση αποτελεσμάτων

Στα βακτηριοκτόνα αντιβιοτικά: πλήρης αναστολή ανάπτυξης (όχι μικροαποικίες και

θόλωση (haze))

Στα βακτηριοστατικά αντιβιοτικά: 80% αναστολή ανάπτυξης

Σύμφωνα με οδηγίες κατασκευαστή

MIC

Linezolid S. aureus ATCC 29213

24 Hrs ATB STRIPS

Αρχή : κάθε αντιβιοτικό

(A,B, Γ, Δ…) ελέγχεται στις 2 διαφορετικές κριτικές συγκεντρώσεις (Breakpoints: c, C)

c C

Γ

B

A

0 Μάρτυρας

ανάπτυξης

S (Susceptible)

R (Resistant)

I (Intermediate)

= όχι μικροβιακή ανάπτυξη

= μικροβιακή ανάπτυξη

Εναιώρημα

Ενοφθαλμισμός του

strip Επώαση

ATB medium (M-H)

ATB 24hrs - Μεθοδολογία

10 µl

50 µl

200 µl

Θολερότητα 0.5 - 4 McF

35°C

ANA 35°C

O2

35°C

CO2

135 µl / πηγαδάκι

Ανάγνωση strips αυτόματα ή manual

MICROSCAN Ημιαυτόματο ή αυτόματο σύστημα για:

1. ταυτοποίηση 2. εύρεση της MIC ή BP των gram ( - ) και gram ( + ) μικροβίων

Το σύστημα: εξασφαλίζει πραγματικές MIC ή ΒΡ τιμές ανεξάρτητες από την

ταυτοποίηση του μικροβίου έχει δυνατότητα ταυτόχρονης ταυτοποίησης και ΜICή BP σε ένα

panel ( COMBO PANEL ) ελαχιστοποιεί την ανάγκη για off – line tests δίνει αποτελέσματα ταυτοποίησης και MIC ή ΒΡ σε 16 – 18 ώρες

για τα gram(-) και gram(+) έχει εύκολο και γρήγορο εμβολιασμός κάθε panel με μία μόνο

κίνηση με τη βοήθεια ειδικού εξαρτήματος ( RENOK ) δίνει δυνατότητα διαβάσματος των panels με το μάτι διαθέτει ένα εξαιρετικά ανεπτυγμένο software για τη διαχείριση

και την αποθήκευση των πληροφοριών (LABPRO-ALERT)

AUTOSCAN – 4 SYSTEM WALKAWAY SI 40/96

MICROSCAN: Prompt Ετοιμασία εναιωρήματος

MICROSCAN: Renok

Ενοφθαλμισμός

πλάκας

Διαδικασία MICROSCAN

1 αποικία

30 ml

διαλύ

ματος

RENOK

Prompt ή

0.5 McF

35°C

Vitek 2 σύστημα

Μέθοδος μικροαραίωσης Κάρτα 64-μικροϋποδοχών

– Μια υποδοχή ελέγχου – Υποδοχές προμετρημένων ποσοτήτων 19-20

αντιμικροβιακών παραγόντων σε συνδυασμό με υλικό καλλιέργειας

Πλήρωση, σφράγισμα της κάρτας και τοποθέτησή της στην μονάδα επώασης/ανάγνωσης του οργάνου

Παρακολούθηση ανάπτυξης σε κάθε υποδοχή της κάρτας ανά 15min (φθορισμός, θολερότητα, χρώμα)

Προσδιορισμός MIC σε 4-18 ώρες Επαγωγή αποτελεσμάτων για 4-10 επιπλέον αντιβ.

– Αποτελέσματα για 23-30 αντιβιοτικά/κάρτα Advanced EXPERT System (AES)

60 & XL

Εναιώρημα σε:

•3mL 0.45-0.50% NaCl

•0.50-0.63 McF

Advanced EXPERT System (AES)

E.coli

Wild

Penicillinase

ESBL

Ampicillin Cephalotin Cefotaxime

Advanced EXPERT System (AES)

E.coli

Wild

Penicillinase

ESBL

Ampicillin Cephalotin Cefotaxime

200 μηχανισμοί αντοχής

Περισσότεροι από 2.400 φαινότυποι

~ 20.000 κατανομές MIC

100,000 βιβλιογραφικές αναφορές

MIC

8

Τυπικό στέλεχος

Οριακή MIC (εντός)

Οριακή MIC (εκτός)

Αναμενόμενη MIC στην Ampicillin για E.coli / Άγριο τύπο

0.25

Advanced EXPERT System (AES)

MIC

8

Τυπικό στέλεχος

Οριακή MIC (εντός)

Οριακή MIC (εκτός)

Αναμενόμενη MIC στην Ampicillin για E.coli / Άγριο τύπο

0.25

Advanced EXPERT System (AES)

E.coli

Wild

Penicillinase

ESBL

Ampicillin Cephalotin Cefotaxime

Observed result

MIC

Αποτελέσματα ευαισθησίας και φαινότυπος αξιολογούνται και επιβεβαιώνονται

Αποτέλεσμα ευαισθησίας

Phoenix σύστημα

Μικρομέθοδος

Panels ταυτοποίησης και αντιβιογράμματος

Τα

υτο

πο

ίησ

η

Αντιβιόγραμμα

84 πηγαδάκια + 1 μάρτυρας ανάπτυξης

– τουλάχιστον 3 αραιώσεις / αντιβιοτικό

Προσδιορισμός MIC

– όχι υπολογιζόμενη MIC

Διπλός τρόπος ανάγνωσης

– Θολερότητα σαν δείκτης ανάπτυξης

– Χρώμα ως αντίδραση μικροβιακού

μεταβολισμού

Μέτρηση ανάπτυξης κινητικής μορφής / 20 min

BDXpertTM-System

MIC

Κανόνες expert

Τελική ερμηνεία και διόρθωση αποτελεσμάτων

SIR Ερμηνεία

(CLSI Standard)

ID

ID

Αραιώσεις αντιβιοτικών

Gram (-) panels VITEK 2 vs

Phoenix

Αραιώσεις αντιβιοτικών

Gram (+) panels VITEK 2 vs

Phoenix

Επιλογή αντιβιοτικών

Προτεινόμενα από την επιτροπή CLSI

Ανάλογα με το είδος του μικροβίου Ανάλογα με τη θέση της λοίμωξης

Επιλογή αντιβιοτικών

– Εστίας λοίμωξης, αντοχής, αλλεργίας, κλπ Ομάδα Α: υποχρεωτικά (primary testing) Ομάδα Β:

– αντοχή στην ομάδας Α – περιοχή λοίμωξης: SXT και ουρολοίμωξη, 3η γενιάς κεφαλοσπορίνες και CSF

– πολυμικροβιακή λοίμωξη,πολλές εστίες λοίμωξης, αλλεργία, μη απάντηση σε Ομ. Α

– επιδημιολογικοί λόγοι

Ομάδα C: εναλλακτική ή επιπλέον αγωγή Ομάδα U: θεραπεία ουρολοίμωξης Ομάδα Inv. “Investigational”

Αντιβιοτικά στον έλεγχο ευαισθησίας Gram αρνητικών

(Α) Έλεγχος και αναφορά

Αμπικιλλίνη

Κεφαζολίνη

Κεφουροξίμη

Γενταμικίνη

(Ο) Επιπλέον για τα ούρα

Ναλιδιξικό οξύ

Νορφλοξασίνη ή

οφλοξασίνη

Νιτροφουράνια

Κο-τριμοξαζόλη

(Β) Έλεγχος και επιλεκτική αναφορά Πιπερακιλλίνη (Εμπορικά δεν υπάρχει) Τικαρκιλλίνη (Εμπορικά δεν υπάρχει) Αμοξυκιλλίνη+κλαβ. ή αμπικιλλίνη+σουλμπ. Πιπερακιλλίνη+ταζομπακτάμη Τικαρκιλλίνη+κλαβουλανικό Κεφοξιτίνη Κεφοταξίμη ή κεφτριαξόνη Κεφταζιδίμη Κεφεπίμη Αζτρεονάμη Ιμιπενέμη ή μεροπενέμη Ερταπενέμη Σιπροφλοξασίνη ή λεβοφλοξασίνη Κο-τριμοξαζόλη Αμικασίνη Νετιλμικίνη Τομπραμυκίνη Τετρακυκλίνη Χλωραμφαινικόλη

Αντιβιοτικά στον έλεγχο ευαισθησίας σταφυλοκόκκων

(Α) Έλεγχος και αναφορά

Κεφοξιτίνη (30μg)

ή Oxacillin (1 μg)

Πενικιλλίνη (10 u)

Ερυθρομυκίνη (15μg)

Κλινδαμυκίνη (2μg)

Φουσιδικό οξύ (10μg)

Σουλφαμεθοξαζόλη-Τριμεθοπρίμη (1,25/23,75μg)

(Ο) Επιπλέον για τα ούρα

Νορφλοξασίνη (10μg)

Νιτροφουραντοΐνη (300μg)

(Β) Έλεγχος και επιλεκτική αναφορά

Γενταμικίνη (10μg)

Καναμυκίνη (30μg)

Νετιλμικίνη (30μg)

[Τομπραμυκίνη] (10μg)

Βανκομυκίνη (30μg)

Τεϊκοπλανίνη (30μg)

Σιπροφλοξασίνη (5μg)

Ριφαμπικίνη (5μg)

Τετρακυκλίνη (30μg)

Λινεζολίδη (30μg)

Κινοπριστίνη/Δαλφοπριστίνη (15μg)