ms/ms espectrometría en tándem: información estructural de pequeñas moléculas

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Espectrometría de masa. MS/MS Espectrometría en Tándem: Información estructural de pequeñas moléculas Secuenciación de péptidos. Espectrometría de masa. MS/MS: Espectrometría en Tándem. Seleccionar uno de los iones de la muestra, fragmentarlo y estudiar la formación de iones “hijos” - PowerPoint PPT Presentation

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1

MS/MS

Espectrometría en Tándem:

Información estructural de pequeñas moléculas

Secuenciación de péptidos

Espectrometría de masa

2

MS/MS: Espectrometría en Tándem

Espectrometría de masa

Seleccionar uno de los iones de la muestra, fragmentarlo y estudiar la formación de iones “hijos”

mp+ md

+ + mn0

Aplicaciones:

Identificación de moléculas

Secuenciación de péptidos “al vuelo”

Modificaciones posttraduccionales

3

MS/MS: Secuenciación peptídica

Espectro MS/MS:masa de los fragmentos

Mezcla de péptidos

MS/MS+

+

+

++

+

1 péptido seleccionado para MS/MS

Espectro MS

Carlos Cerveñansky

Espectrometría de masa

4

Espectrometría de masa

H2N CH C

R1

OHN CH C

R2

OHN CH C

R3

OH

O

b1

y2

b2

y1

N-terminal

C-terminal

MS/MS: Espectrometría en Tandem

Espectrometría de masa

Fragmentación peptídica

Roepstorff & Fohlman, Biomed.Mass Spec., 11,601(1984)

La fragmentación más común se da en el enlace peptídico, generando fragmentos b e y

6

MS/MS: Espectrometría en Tandem

Espectrometría de masa

Fragmentación peptídica

Roepstorff & Fohlman, Biomed.Mass Spec., 11,601(1984)

y ionsb ions

b1

b2

b3

b4

y4

y3

y2

y1

http://db.systemsbiology.net:8080/proteomicsToolkit/FragIonServlet.html

Espectrometría de masa

Las m/z medidas por MS/MS se comparan con tablas de masas teoricas obtenidas con la secuencia del peptido, que puede ser obtenida de bases de datos

b1

b2b3

y1

y2

y3

LF

K

G

G L

K

F

Rela

t ive

Inte

nsit

y

m/z

F L G K++

F L G K++

F L G K++

CID

F L G K++

F L G K++

F L G K++

b1

b2

b3

y3

y2

y1 F L G K++

F L G K+

Espectrometría de masa

Para asignar los iones b/y tenemos que conocer la secuencia de aa.

Se puede hacer secuenciacion “de novo” pero requiere experimentos adicionales e instrumentos de alta resolucion

Fragmentacion de Peptidos por MS/MS

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

395.2

y9

b4

400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400

m/z

887.6

986.6

774.51186.7494.3

1168.71085.7607.4 1243.7

673.5

1006.6 1119.6779.5476.3 589.3 984.6708.4466.3

885.61184.7

772.5

y13

y12

y12*y11

y10

y8

y7

b13

b12b11

b10

b8b7

b6

b5

b6*b5*

a5 a12

His-Gly-Thr-Val-Val-Leu-Thr-Ala-Leu-Gly-Gly-Ile -Leu-Lysb1 b4b3 b5 b6 b7 b8 b9 b10b2 b11 b12 b13

y13 y10y11 y9 y8 y7 y6 y5 y4y12 y3 y2 y1

MS/MS: Espectrometría en Tandem

Espectrometría de masa

Cómo se hace?

12

MS/MS: Espectrometría en Tandem

Espectrometría de masa

ESI-QQ1Q2Q3: Triple Cuadrupolo.

Q1 Selecciona el ion molecular “padre”Q2 sirve de cámara de colisión: Se introduce un gas para que los iones acelerados choquen y se fragmenten (CID)Q3 Analiza los iones “hijo”

Select Parent Fragment Analyse Fragment

Masses

Q1 Q2 Q3

13

MS/MS: Espectrometría en Tandem

Espectrometría de masa

ESI-QQ1Q2Q3: Triple Cuadrupolo.

Q2 sirve de cámara de colisión: Se introduce un gas para que los iones acelerados choquen y se fragmenten

CID: Collision Induced Dissociation

Se usa mucho para realizar cuantificaciones por LC-MS-MS

MassAnalysis

peptides

protein

peptides

++

+

+

++++

IonizationDigestion

m/z

MS

MS/MS: Espectrometría en Tandem

Espectrometría de masa

Ionization Isolation Fragmentation MassAnalysis

proteinpeptide

fragments

Digestion

peptides

+++

+

++

++ ++

+++

++

++++ +

m/zm/z

MS MS/MS

m/z

Isolation

MS/MS: Espectrometría en Tandem

Espectrometría de masa

16

MS/MS: Espectrometría en TandemESI-ITIT: Trampa de IonesLa trampa de iones puede analizar los iones de una muestra MS

También puede seleccionar uno, y concentrarlo en la trampa

Luego se aceleran los iones para que choquen con Helio y se fragmenten

Luego se analizan los iones hijo

CID: Collision Induced Dissociation

Las trampas de iones tienen capacidad de hacer MSn se seleccionan iones hijo se fragmentan, analizan, seleccionan uno fragmentan, analizan, seleccionan uno hasta que les de la sensibilidad

MS2

Espectrometría de masa

Fragment 426.7

Isolate Parent Ion

Intact ions

Intact ion

Daughters

This analysis/isolation/fragmentation can be carried out in an ion trap

Tandem en el tiempo

Espectrometría de masa

18

MS/MS: Espectrometría en Tandem

Espectrometría de masa

MALDI-TOFIones moleculares que se fragmentan durante el vuelo llegan juntos al “reflector” y pueden ser analizados por el mismo. PSD: Post Source Decay

ESQUEMA:

Instrumento de tecnología MALDI-TOF

Camera

Laser

plate

Pumping Pumping

Beam guide

Timed ion selector Reflector

Linear detector

Extractiongrids Reflector

detector

Espectrometría de masa

20

Espectrometría de masa

Identificación de sitios de modificación

Oxidación de citocromo c

Y74

Y67

Y48Y97

Y74

Y67

Y48Y97

Located in mitochondria, plays an important role in apoptosis intrinsic pathway and has been linked to oxidative stress responses

[H2O2]

37°C,1 Hr

aPLPC

TOCL

sh_2025_MM_102010p_alpha_PLPC #3206 RT: 29.05 AV: 1 NL: 6.69E2F: ITMS + c NSI d Full ms2 498.94@cid35.00 [125.00-1510.00]

200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

744.39567.35

638.40

415.40

480.27

631.47

857.32751.40

376.42

358.72 620.49 815.44235.14319.73 684.20484.34

265.93 928.57489.64 1220.79216.16783.42 996.71859.49 1108.26

b10y9

b8

b7

b6

y5

y4

b5y7(2+)

y5(2+)

y6(2+)

b7-CO(2+)

y12 y11 y10 y9 y8 y7 y6 y5 y4 y3 y2 y1T---E---R---E---D---L---I---A---Y*--L---K---Kb1 b2 b3 b4 b5 b6 b7 b8 b9 b10 b11 b12

Y+16

GAPDHReaction withNitro-oleic acid

Batthyany J.Biol.Chem. 2006, p.20450

25

Identificación de proteínasPeptide mass fingerprinting y

proteomica

Espectrometría de masa

26

Identificación de proteínasEspectrometría de masa

Huella peptídica

Cada proteína, cortada con una proteasa de especificidad conocida, da una serie de péptidos de masa determinada que puede ser usada para identificar la proteína (huella peptídica)

En el 2003 se terminó de secuenciar el primer genoma humano.

De la secuencia del ADN se puede determinar la secuencia de aminoácidos de todas las proteínas potencialmente expresables.

Hoy contamos con cerca de 20.000 Genomas secuenciados, y mas por salir.

5000 7000 9000 11000 13000 15000

Mass (m/z)

0

6.0E+4

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

tens

ity

Voyager Spec #1=>BC=>NF0.9[BP = 12364.9, 60367]

12366.46

6187.17

12583.58

12326.17

6292.68

12784.48

Espectro de masa del citocromo c de caballo

A. Molécula entera. Matriz: ácido sinapínico

GDVEKGKKIFVQKCAQCHTVEKGGKHKTGPNLHGLFGRKTGQAPGFTYTDANKNKGITWKEETLMEYLENPKKYIPGTKMIFAGIKKKTEREDLIAYLKKATNE

Secuencia AA citocromo c de caballo

Digestión in silicopor tripsina (corta despues de K o R)

Lista de péptidos teóricos

GDVEK GDVEKGKGK GKKIFVQK IFVQKCAQCHTVEKCAQCHTVEK CAQCHTVEKGGKGGKHKTGPNLHGLFGRKTGQAPGFTYTDANKNKGITWKEETLMEYLENPKKYIPGTKMIFAGIKKKTEREDLIAYLKKATNE

Se calculan las masas teóricas para todos los péptidos posibles y se comparan con los resultados de MS de cytc tratado con tripsina

1000 1160 1320 1480 1640 1800Mass (m/z)

0

2.0E+4

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

tens

ity

Voyager Spec #1=>MC=>BC[BP = 1633.6, 19883]

1168.61

1190.54

1212.53 1433.76

1655.591170.181213.531296.681152.361046.18 1631.621350.70 1478.821124.52 1230.50

1633.82

B. Molécula digerida con tripsina. Matriz: ácido -ciano hidroxicinámico

Masa Teorica (Da)

Masa Medida (Da)

Error (Da) Residuos Secuencia

1168.61 1168.61 0.00 28-38 TGPNLHGLFGR 1296.71 1296.68 0.03 28-39 TGPNLHGLFGRK 1350.72 1350.69 0.03 89-99 TEREDLIAYLK 1433.77 1433.76 0.01 26-38 HKTGPMLHGGLFGR 1470.68 1470.67 0.01 40-53 TGQAPGFTYTDANK 1478.82 1478.82 0.00 89-100 TEREDLIAYLKK 1478.82 1478.82 0.00 88-99 KTEREDLIAYLK 1633.81 1633.82 0.01 9-22 IFVQKCAQCHTVEK

Niveles de información……… en la caracterización de proteínas por MS.

• medida de masa de una molécula entera 1 valor experimental

• medidas de masas en mapeo peptídico 5-20 valores experimentales

• secuenciado de péptidos por MS/MS más de 100 valores experimentales

…mejora en cantidad y calidad de la información

Peptide fragmentation fingerprinting

Enzymaticdigestion

In-silicodigestion

Protein(s) Peptides340.695086676.96063498.8283545.5641171.967066261.107346342.51458456.727405363.268365

MS/MS spectra of peptides

Ions peaklists

…MAIILAGGHSVRFGPKAFAEVNGETFYSRVITLESTNMFNEIIISTNAQLATQFKYPNVVIDDENHNDKGPLAGIYTIMKQHPEEELFFVVSVDTPMITGKAVSTLYQFLV …

- MAIILAGGHSVR- FGPK- AFAEVNGETFYSR- VITLESTNMFNEIIIK- YPNVVIDDENNDK…

Sequence database entry

361.107346338.695086676.96063498.82831045.5641171.967066342.51458457.827405263.268453

Theoretical peaklist

Theoretical proteolytic peptides

Match

Result: ranked list of peptide

and protein

candidates

Theoretical fragmented

peptides

-MAIILAG-MAIILA-MAIIL-MAII-MAI-M-M-AIILAG

In-silicofragmentation

PFF = ion search MS/MS database matching

Proteoma• El término “proteoma” fue acuñado por Marc

Wilkins en 1995, como el complemento de PROTEínas al genOMA

• Es el producto final del genoma más variedad• Es una entidad dinámica Fenotipo• Modificaciones posttraduccionales• No todos los genes se expresan como proteínas en

todos los estadios/tipos celulares

Proteoma• Del gen a la proteína final, pueden ocurrir

muchas modificaciones que no son predecibles por la secuencia de ADN original

• 1 gen ya no equivale a 1 proteína

Sujetos de estudio de la Proteómica

• Identificación de Proteínas (pept mass fingerprint)• Comparación de niveles de expresión de proteinas• Función de Proteinas• Modificaciones posttraduccionales de Proteinas• Localización y Compartimentalización de Proteinas • Interacciones Proteina-Proteina

Quantitative proteomics

Quantitative proteomics

MS-Imaging

MS-Imaging

ConclusionesLa espectrometría de masa es una técnica con muchísimas aplicaciones y aún tiene mucho potencial por desarrollar

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