microscopía ftir: una herramienta valiosa para el … nacional de toxicología madrid, 1 de octubre...

Instituto Nacional de Toxicología

Madrid, 1 de octubre 2013

Fernando Tobalina

Agilent Technologies

Microscopía FTIR: una herramienta valiosa para el

análisis toxicológico y forense

Evolución ….

Cuando los equipos parecían a:

Cuando las muestras se preparaban así::

Y los resultados se analizaban en las bibliotecas!!!!….

Hasta hoy…

En cuanto a los equipos, la Transformada de Fourier revoluciónó la

espectroscopía infrarroja aportando:

• Sensibilidad

• Rapidez

• Precisión

Librerías

El software actual de los equipos

permite el trasvase automático de los

espectros a las librerías de búsqueda

permitiendo la identificación a los pocos

segundos de la muestra estudiada.

Gracias a los programas de

deconvolución y quimiometría se

puede realizar análisis

multicomponente.

5

Plataformas ópticas de altas prestaciones

5

Almacenaje de

divisores de haz

Ajuste

rápido de

accesorios

Intercambio

rápido de

detectores

Fuente refrigerada

por aire con retro-

reflector

6

Alta resolución óptica real: < 0.06 cm-1 no apodizada

Análisis del espectro de CO

Agilent Cary 660 Características

7

Sensibilidad:

Cuantificación de alcohol en agua por ATR.

Application Note: Quantitative Analysis SI-01374/ Ethanol in Water

Agilent Cary 660 Características

LD % v/v Altura Pico

EtOH/H2O 1045 cm-1

Agilent 660-IR 0.08 4.6 x 10-4 abs

Agilent 670/680-IR 0.04 2.5 x 10-4 abs

10-3 10-1 10-2

10-2 10-1 10-3 10-4 10-5

1

Segundos Milisegundos

Milisegundos Microsegundos

10-6 10-7 10-8

Minutos ... Rapid-Scan

KINETICS mode Todos los equipos Cary 660 670 y 680

Step-Scan

TRS mode Cary 680

10-9

Nanosegundos

“Rapid-scan Kinetics” vs. “Step-scan TRS”

Rapid-scan Kinetics: Aplicable a reacciones reversibles o irreversibles.

Step-scan TRS: Aplicable solo a reacciones reversibles.

Escala temporal disponible en los FTIR Agilent

Técnicas de muestreo

Las técnicas de ATR o DRIFTS facilitan enormemente los análisis y eliminan la

necesidad de preparar la muestra.

• Uso más sencillo

• Sin necesidad de manipular la muestra

• Buena resistencia física y química

• Mayor reproducilidad Typic

al R

elat

ive

S/N

(pea

k-p

eak,

5 s

ec)

15,000

5,000

0 Varian

660-IR

Varian

670/680-IR

10,000

Test S/N haz abierto

With ATR

Other

Research

FT-IRs

Determinación de Asbestos/Amianto por DRA

10

Espectro del amianto blanco

SiO---H 3680 cm-1

+

October 3, 2013

Confidentiality Label

11

Amianto azul o Crocidolita

Si---O a 770 cm-1

Amianto marrón o Amosita

Si---O a 1080 cm-1

Muestra de cemento

Resultado:

1.7% de amianto blanco

Determinación de Asbestos/Amianto por DRA

Evolución en el análisis microscópico

12

Diseño único totalmente reflectivo

Optica corregida a infinito

Apertura motorizada transparente

Cámara CCD y binoculares

Objetivo IR de Schwardchild 15x (NA=0.5).

13

Paint chips. Análisis por reflectancia

Multi-Layered Paint-chip Spectra Before Kramers-Kronig

Sistemas de muestreo.

• La máxima resolución espacial está limitada a 10-15 micras

• Hay pocas muestras forenses analizables por reflexión

• El análisis por transmisión puede requerir una dificil preparación

de muestra

• La máxima resolución espacial con ATR está limitada al punto de

contacto (30-40 micras)

Como superar esta limitación?

Linear array

Es necesaria una tipología distinta del detector

respecto de los sistemas clásicos de análisis

puntuales o de mapping.

Focal Plane Arrays

15

•Resuelven solo en parte la limitación en resolución.

•Necesitan habitualmente hacer mapping

•No permiten el uso del ATR

Resuelven casi todas las limitaciones

Detectores Focal Plane Array FPA

16

Los FPA son detectores derivados

de aplicaciones Militares

derivados de telecámaras

sensibles al calor utilizando

elementos de InSb o MCT

Boeing 737

64 x 64 MCT

FPA de 3ª generación. Mayor

sensibilidad, homogeneidad y

frecuencia de lectura, tiempos

de exposición ajustables, menor

susceptibilidad térmica.

Medidas puntuales vs. medidas con FPA

Superficie de análisis: Pixels: Tiempos : Resolución espacial:

2-D FPA Infrared Imaging 350 x 350 um (700 x 700 um)* 64x64=4,096 ~1 sec 5.5 um, (11 um)

Single Point Mapping 350 x 350 micras 35 x 35 = 1,225 > 3 horas > 10 micras

Résolución espacial de 1.1 µm

Mayor campo de visión

FPA Type Number

of pixels

Spatial Resolution, m (Field of View, m)

Ge - ATR Obj. Trans/Ref

15x Obj

15x Obj with “Field

Expanding Optics”

MIR 16x16 256 1.1 (18) 5.5 (88) 11 (175)

MIR 32x32 1,026 1.1 (35) 5.5 (175) 11 (350)

MIR 64x64 4,096 1.1 (70) 5.5 (350) 11 (700)

MIR 128x128 16,384 1.1 (140) 5.5 (700) -

NIR 128x128 16,384 - 4.1 (525) -

FastIR ATR

• Cristal in ZnSe

• Large aire

• Surface analysable de 6.4 x 9.0 mm (avec FPA

128x128 FPA)

•40 x 70 micron/pixel

Ejemplo de análisis sobre chips de pintura Objetivo para muestras grandes

Ejemplo de arañazos de pintura

Bandas a 3696cm-1 y 1055cm-1

Agilent Workshop SPEC 2012

Para el estudio de muestras biológicas es

recomendable la implementación de un

método objetivo Se puede usar una firma biológica para distinguir entre los diferentes

tipos de tejidos y relacionarlo con el diagnóstico deseado, por ejemplo

una alteración del tejido por un tumor, o la presencia de alteraciones

de distinta naturaleza y generar un método objetivo de diagnóstico

Esa firma bioquímica puede

ser obtenida usando la técnica

de Espectroscopía por

transformada de Fourier (FTIR)

Análisis de tejidos procedentes de Biopsias

pacientes Tinción tradicional de H&E seguida

de una evaluación subjetiva bajo un

microscopio

Sección de tejidos adjacente SIN

TINCION NI MARCAJES usada

para análisis por FTIR de imagen

seguida de un algoritmo cluster

objetivo supervisado o no

supervisado

Imagen FTIR de un Micro Array de tejidos

(Procedentes de biopsia tejido por aguja)

Desde la recogida del dato hasta la

clasificación en tan solo 8 min.

Los colores son falsos simulando la

tinción H&E para mantener la familiaridad

para los patólogos

~2 cm

~3

cm

2.2 mm

1.4

mm

Hippocampus section: normal 5 month old mouse, on MirrIR slide (Keveley)

Data kindly provided by Prof. Kathy Gough and Alex Kuzyk, U. Manitoba, Winnipeg, Canada.

64 × 64

64 × 64

64 × 64

64 × 64

64 × 64

64 × 64

64 × 64

64 × 64

64 × 64

64 × 64

64 × 64

64 × 64

64 × 64

64 × 64

64 × 64

64 × 64

64 × 64

64 × 64

64 × 64

64 × 64

64 × 64

64 × 64

64 × 64

64 × 64

2.2 mm

1.4

mm

4 × 6 mosaic of 64 × 64 FPA

= 98,304 spectra!

Large area tissue analysis

Data kindly provided by Prof. Kathy Gough and Alex Kuzyk, U. Manitoba, Winnipeg, Canada.

Tissue visualization options

Area of C=O at 1734 cm-1 Area of C=O at 1734 cm-1 Area of C=O at 1734 cm-1 Area of C=O at 1734 cm-1

4000 3000 2000 1000

0.9

0.6

0.3

0.0

Wavenumber (cm-1)

Ab

sorb

ance

White matter

Significant spectral differences

NH & OH stretch

CH stretch

C=O stretch

Amide I

Amide II

Phospholipids & carbohydrates

Tissue interpretation

4000 3000 2000 1000

0.9

0.6

0.3

0.0

Wavenumber (cm-1)

Ab

sorb

ance

Neuron

4000 3000 2000 1000

0.9

0.6

0.3

0.0

Wavenumber (cm-1)

Ab

sorb

ance

Neuropil

4000 3000 2000 1000

0.9

0.6

0.3

0.0

Ab

sorb

ance

White matter

Neuropil

Neuron

Wavenumber (cm-1)

Changes in CH2 and CH3 peaks illustrate differences in lipid

content between white matter and grey matter.

White matter consists mostly of myelinated axons – myelin is composed largely of lipid tissue veined with capillaries.

Grey matter consists mostly of neural cell bodies, neuropil, glial cells, and capillaries – contains little lipid.

M. Rak, M. R. Del Bigio, S. Mai, D. Westaway, and K. Gough, Biopolymers 87, (2007).

Ejemplo: Detección de huellas digitales

En muchas ocasiones las huellas dactilares son dificiles de identificar por los

métodos tradicionales

Los métodos tradicionales= Productos fluorescentes u otros productos químicos

No son siempre aplicables

Suponen riesgo de contaminación de otras pruebas por los reactivos químicos

Regogida con la ayuda

de un gel comercial

BVDA ™

Medida macro ATR

Imagen Macro ATR de una huella digital

5.0 mm

7.6

mm

3351.670 12.5502927.470 0.116

1643.730 0.159Row = 22 Col = 89

3500 3000 2500 2000 1500 1000

0.15

0.10

0.05

0.00

Wavenumber

Absorb

ance

Imagen creada a partir de la banda de

absorción amida I a 1640 cm-1

correspondiente a absorción por proteínas

SD00223 MILK-PROTEIN HYDROLYSATE PEPTONE

3600 3400 3200 3000 2800 2600 2400 2200 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600

1.0

0.9

0.8

0.7

0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

0.0

Numero d'onda

Assorb

anza

COCAINE HCl in KBr

3600 3400 3200 3000 2800 2600 2400 2200 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600

1.0

0.9

0.8

0.7

0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

0.0

Numero d'onda

Assorb

anza

Ejemplo de detección

October 3, 2013 31

COCAINA

ATR FTIR imaging in forensic science, Agilent

Trazas de explosivos en la huella digital

a: Huella contaminada con

explosivo PETN

b: localización de los píxels tras

comprobación con la librería de

espectros=espectro PETN

¿Preguntas?