microscop a de fluorescencia de campo de luz por
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Microscopıa de fluorescencia de
campo de luz por iluminacion
estructurada
Nicolas Barbosa Berrıo
Universidad de los Andes
Departamento de fısica
Director: Ph.D. Antonio Manu Forero Shelton
November, 2018
ii
Firma
Director: Antonio Manu Forero Shelton
Indice general
1. Introduccion 1
2. Conceptos de microscopıa 3
2.1. Microscopıa por fluorescencia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
2.2. Microscopıa de hoja de luz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
2.3. Campo de luz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
2.4. Iluminacion estructurada y reconstruccion tridimensional . . . . . . . . 6
2.4.1. Calibracion - Localizar los microlentes . . . . . . . . . . . . . . 6
2.4.2. Calibracion - Profundidad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
2.4.3. Stack - Objeto puntual . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
2.4.4. Light Field - Wide Field . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
2.4.5. Light Field - Light Sheet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
3. Construccion del microscopio de hoja de luz 15
3.1. Galvanometros . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
3.2. Dispositivos DMD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
3.3. Microscopıa de campo de luz - Deteccion . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
4. Resultados 25
4.1. Galvos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
4.2. DMD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
4.3. Comparacion de las resoluciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
4.4. DMD vs Galvos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
4.4.1. Ventajas Galvos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
4.4.2. Desventajas Galvos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
4.4.3. Ventajas DMD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
4.4.4. Desventajas DMD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
iv INDICE GENERAL
4.5. Planes a futuro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
5. Conclusiones 43
A. Imagenes de reconstruccion 45
A.1. Galvos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
A.1.1. LFWF 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
A.1.2. LFWF 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
A.1.3. LFLS 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
A.1.4. LFLS 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
A.2. DMD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
A.2.1. LFWF 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
A.2.2. LFWF 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
A.2.3. LFLS 1 - 8 espejos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
A.2.4. LFLS 2 - 8 espejos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
A.2.5. LFLS 1 - 20 espejos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
A.2.6. LFLS 2 - 20 espejos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
B. Seguridad optica 57
INDICE GENERAL v
Resumen
El objetivo general es poder visualizar especımenes en fluorescencia hasta una escala
del orden de micrometros como primera instancia y poder tener una escala temporal
muy corta para llegar a ver la dinamica de organismos vivos que se dan en el orden de
milisegundos, como por ejemplo los latidos del corazon de un pez cebra [1]. Se llevara a
cabo haciendo uso del microscopio de hoja de luz el cual tiene una resolucion espacial
alta, pero al tener que hacer un escaneo con los planos obtenidos limita un poco la
resolucion temporal. Tambien se usara el microscopio de campo de luz que tiene una
profundidad de campo mayor en comparacion, y una resolucion temporal alta, pero su
resolucion espacial no es suficiente para visualizar celulas. Combinar estos dos metodos
va a permitir aprovechar una buena resolucion espacial y una resolucion temporal aptas
para la obtencion de la escala celular y la visualizacion de la dinamica de sistemas
biologicos [2], respectivamente.
Primero se toman muestras modelo como pequenas esferas fluorescentes tanto indi-
viduales como muestras densas para poder determinar la escala que se ha conseguido
con el montaje, y despues con estas imagenes hacer una reconstruccion tridimensional
de lo que se captura por campo de luz. Las imagenes captadas en la deteccion se rea-
lizan por la fluorescencia emitida por las muestras, y es capturada por una camara de
adquisicion de imagenes a alta velocidad.
Para lograr la iluminacion estructurada existen dos metodos: el uso de galvanometros
y el uso de microespejos DMD. Este proyecto tiene como finalidad principal poder lograr
la iluminacion estructurada con los dispositivos DMD, para luego poder comparar con
la iluminacion estructurada que se logra por medio del uso de galvanometros. De esta
manera, se podra tambien comparar la reconstruccion que se obtiene en cada uno de
estos metodos e identificar las ventajas y desventajas que tienen los DMD respecto a
los galvanometros.
Abstract
The general objective is to be able to visualize specimens by fluorescence in a millili-
ter scale as a first sight and to get a very small temporal resolution to see the dynamics
of living organisms that happens very close to milliseconds, like the heart beat of a ze-
bra fish [1]. This is going to be achieved by using the light sheet microscope which has
vi INDICE GENERAL
a high spatial resolution, but since it must scan the samples with the obtained planes,
the temporal resolution is affected. Also, a light field microscope is going to be used
which has an extended depth of field in comparison and a high temporal resolution but
fail to deliver a decent spatial resolution. These two methods combined allow to get
notable spatial resolution and enough temporal resolution to get both the cellular scale
and to visualize the dynamics of the biological systems [2], respectively.
First, small fluorescent spheres are going to be used as a model in both individual
and dense samples to determine the scale that is achieved with the experimental setup
and then get a three-dimensional reconstruction of the light field images obtained. These
captured images in the detection side were made by the samples emitted fluorescence,
and it had been captured by a high-speed acquisition camera.
To get structured illumination there are two methods: using galvanometers and using
micromirrors DMD. This project is main focused to get the structured illumination
using the DMD devices, then compare it with the structured illumination that can
be get by using galvanometers. Thus, the three-dimensional reconstruction also can
be compared to identify advantages and disadvantages that the DMD devices have in
contrast with the galvanometers.
CAPITULO 1
Introduccion
El interes cientıfico de ver los objetos pequenos fuera del alcance de la resolucion
del ojo humano es lo que ha hecho que la microscopıa haya podido llegar a ser capaz
de visualizar la dinamica de los organismos vivos en el orden de milisegundos [3]. Sin
embargo, los microscopios sufren de limitaciones que en este caso en particular nos
interesa la relacion entre resolucion temporal y espacial [4]. Hay que tener en cuenta
que la difraccion limita el producto de la resolucion espacial y angular. Los objetos se
ven en una proyeccion ortografica, de manera que solo se ve su proyeccion en un plano
y desde una sola direccion. Ademas de esto, los microscopios tambien tienen muy poca
profundidad de campo. Si bien la primera limitacion es por fısica de la luz, las otras
dependen del diseno del microscopio.
La microscopıa de hoja de luz se ha convertido en una tecnica de mucha utilidad ya
que ha permitido obtener imagenes de la dinamica de sistemas biologicos que antes no
eran posibles, como visualizar especımenes en fluorescencia hasta una escala celular y
la toma de imagenes de organismos vivos. Por las contribuciones hechas fue declarado
por Nature Methods como el “Metodo del ano 2014”[2]. En este metodo de hoja de
luz un haz de laser se modifica opticamente y se convierte en un plano que es referido
como un seccionamiento optico, y ası se ilumina un plano a la vez para ir capturando
la fluorescencia que la muestra emite en esa delgada hoja, que se detecta usando una
camara de alta velocidad [5]. Ademas, la microscopıa de hoja de luz cuenta con una muy
buena resolucion espacial, pero no es ası con la resolucion temporal. Con este metodo se
ha logrado visualizar la actividad neuronal del cerebro de un pez cebra capturando mas
del 80 % de todas sus neuronas con la resolucion de una celula [6], ası como tambien la
2 Introduccion
reconstruccion del embrion de un pez cebra en sus primeras 24 horas de desarrollo [7].
Lo que podrıa ser de particular interes serıa lograr la toma de imagenes en hoja de luz
a altas velocidades.
Por otro lado, se encuentra la microscopıa de campo de luz, la cual en comparacion
con la hoja de luz tiene mas resolucion temporal, a costa de menor resolucion espacial.
Este metodo recoge la informacion de la ubicacion espacial en 2D ası como tambien
el angulo de la luz incidente, gracias a que se ubica un arreglo de microlentes en el
plano imagen de manera que los pixeles de la camara capturen el campo de luz de la
muestra [8]. Hay que tener en cuenta ademas que un microscopio de campo de luz por
iluminacion de hoja de luz requiere analizar las imagenes que se capturan para mejorar
la resolucion de estas. En el trabajo hecho por Marc Levoy et. al. [4] usan campo de
luz y logran hacer reconstruccion volumetrica para varias muestras biologicas, como el
pulmon de un embrion de raton, la boca de gusanos de seda, entre otras.
En este proyecto en particular, se combinara el uso de campo de luz con ilumi-
nacion por hoja de luz que ademas utilizara iluminacion estructurada gracias a los
dispositivos DMDs (digital micromirror device), los cuales se han usado por Dan et.
al. [9] para super resolucion sobre nano partıculas de oro (80nm de diametro) para
poder tener franjas definidas, y donde ademas llevaron a cabo la iluminacion por LED
(con baja coherencia); y tambien por Nadya et. al. [10] que iluminaron celulas BPAE
(celulas endoteliales de la arteria pulmonar bovina) usando DMDs y luego haciendo la
reconstruccion digitalmente.
Este proyecto ademas da la posibilidad de hacer a largo plazo reconstrucciones de
sistemas mas complejos. En el artıculo de Mickoleit et. al. [11] ellos logran crear un
fantoma de corazon “phantom heart”en el sentido en que replica los datos originales
de un corazon tales como la geometrıa, la dinamica temporal y el ruido que este tiene.
Allı modelaron este corazon como un cilindro conico, cuyas medidas fueron 225µm de
longitud, con 50µm de radio de entrada y 29µm de radio de salida. Ellos mismos lograron
hacer la reconstruccion del corazon de un pez cebra con el mismo tipo de iluminacion,
pero sus reconstrucciones, aunque con alta resolucion, fueron estaticas ya que usaron
optogenetica para detener brevemente el corazon y poder adquirir las imagenes.
CAPITULO 2
Conceptos de microscopıa
Para entender lo que se quiere lograr con este proyecto, hay algunos conceptos que se
abarcaran en este capıtulo. Esto va desde los conceptos de microscopıa por fluorescencia,
microscopıa por hoja de luz, por campo de luz y tambien algunas de las diferencias mas
importantes con otros metodos de hacer microscopıa comparados con los que se estan
usando en este proyecto.
2.1. Microscopıa por fluorescencia
La fluorescencia ocurre como resultado de un proceso de respuesta a un estımulo a
un fluoroforo en una determinada region de un objeto o especimen biologico. El estımulo
esta dado por un foton que puede provenir de alguna fuente lumınica como un laser, una
lampara incandescente, entre otros; y este foton hace que la energıa de los electrones
del estados base del elemento en el que estan incidiendo suban a un estado excitado
en el que duran entre 1 y 10 nanosegundos, para luego emitir la energıa de ese estado
excitado en forma de otro foton [12, 13, 14]. Este foton emitido tiene una energıa menor
que el foton original, y esto es algo clave para la microscopıa ya que se busca separar
la luz de excitacion de la fluorescencia emitida, y al ser una energıa menor la longitud
de onda es distinta y se puede conseguir entonces la separacion con el uso de un espejo
dicroico.
4 Conceptos de microscopıa
Figura 2.1: Formacion de la hoja de luz desde una vista superior (plano xz) en la quese ve la convergencia del haz a una lınea delgada. Imagen tomada y adaptada de [15]
2.2. Microscopıa de hoja de luz
La hoja de luz es la iluminacion de un plano que se obtiene a partir de modificar
opticamente un haz de luz para que la luz se colime en el plano xy (generalmente es
la vista lateral) pero converja en el plano xz (vista superior). En la figura 2.1 se puede
ver esta situacion desde la vista superior, que vendrıa siendo el plano xz. Aquı se nos
muestra que el haz converge y llega a tener una seccion muy delgada con la que se
ilumina la muestra por secciones. Esto es un seccionamiento optico que permite que
solo un plano de la muestra a la vez sea el que se esta iluminando. El hecho de que
solo un plano se este iluminando en la microscopıa de hoja de luz tiene una ventaja
inmediata respecto a la microscopıa confocal, o en general la microscopıa convencional,
puesto que en estas se ilumina toda la muestra y los fluoroforos de la muestra estan
en constante exposicion a la luz, lo que genera dano por exposicion o blanqueamiento
de las muestras (en ingles, photodamage y bleaching), en cambio en hoja de luz los
fluoroforos de la muestra fuera del plano focal de deteccion estan tambien fuera del
plano iluminado, por lo que no seran danados o blanqueados [15].
2.3. CAMPO DE LUZ 5
2.3. Campo de luz
En la microscopıa tradicional se tiene la muestra, un objetivo y un sensor o camara
para capturar la luz que emite la muestra. En campo de luz en cambio, entre el objetivo
y el sensor deben ir ubicados unos microlentes, justamente en el plano imagen del
objetivo. Estos microlentes son un arreglo de lentes diminutos, de 100 × 100µm de
dimension cada uno, en los cuales al proyectarse el plano imagen del objetivo se tendra
mas informacion de la que se podrıa obtener con una proyeccion ortografica como se
verıa en un microscopio tradicional. Cuando la muestra es un objeto puntual, la luz
emitida por esta va a llegar sobre un solo microlente. Sin embargo, si la muestra es
un objeto con una dimension y volumen mas estructurado entonces varios microlentes
van a recibir la luz que la muestra esta emitiendo, de manera que los rayos que llegan
a cada microlente tienen informacion de intensidad y de la direccion en la que esta
siendo emitida esta luz. Esto esta directamente relacionado con lo que se conoce como
la funcion plenoptica:
P (θ, φ, λ, t, Vx, Vy, Vz) (2.1)
Esta funcion describe por cada variable un parametro de los rayos de la luz que
puede dar informacion completa del objeto que los esta emitiendo. θ, φ son parametros
de intensidad de la luz vistos desde un mismo punto, al mismo tiempo y promediados
sobre las longitudes de onda del espectro visible. λ hace referencia a la longitud de onda
recibida. La variable t indica que la funcion depende del tiempo. Las variables Vx, Vy y
Vz nos dan la informacion sobre diferentes puntos de perspectiva. En otras palabras, la
funcion plenoptica reconstruye cada posible perspectiva o punto de vista en cualquier
momento, sobre cualquier posicion y con cualquier longitud de onda [16].
Gracias a la cantidad de informacion que podemos obtener de la ecuacion 2.1 y
a un software que fue desarrollado en otro proyecto, es que se logra obtener una re-
construccion tridimensional de los objetos que se estan viendo con una camara y que
aparentemente solo se ven en dos dimensiones. El detalle de la reconstruccion y todos los
parametros necesarios para llevar a cabo una reconstruccion se describe en la siguiente
seccion.
6 Conceptos de microscopıa
Figura 2.2: Celda llena de agua con marcador fluorescente, usado para la calibracion dela ubicacion de los microlentes
2.4. Iluminacion estructurada y reconstruccion tri-
dimensional
Para poder llegar a obtener una reconstruccion tridimensional de la muestra que
se este analizando, es necesario seguir ciertas pautas que vamos a ordenar en esta
seccion de manera que sean pasos metodicos de seguir y ası lograr la obtencion de
la imagen reconstruida tridimensionalmente. Se usara el programa de reconstruccion
desarrollado por Diego Castro en su proyecto de maestrıa que usa Matlab para realizar
las reconstrucciones.
2.4.1. Calibracion - Localizar los microlentes
El programa necesita saber la ubicacion exacta de los microlentes. Es por esto que
cada vez que se van a tomar imagenes es necesaria una imagen de calibracion que se
realiza llenando la celda con agua y luego dejando caer un poco de marcador fluores-
cente, el cual permite que el haz del laser se vea sobre el agua como se puede ver en la
figura 2.2.
2.4. ILUMINACION ESTRUCTURADA Y RECONSTRUCCION TRIDIMENSIONAL 7
Figura 2.3: Imagen de calibracion de los microlentes tomada con la camara Orca Flash4.0 Hamamatsu
Esta imagen, como se esta iluminando con un laser de 480nm, el espejo dicroico que
se esta usando refleja por debajo de 540nm, y la reflexion es justamente el camino del
campo de luz, que es donde estan ubicados los microlentes, hacia donde esta ubicada la
camara Orca Flash 4.0 Hamamatsu, y precisamente esta imagen solo se toma con esta
camara, y la imagen obtenida se puede ver en la figura 2.3.
Con la imagen obtenida podemos analizar si los microlentes son correctamente de-
tectados por el software. Esta imagen de calibracion es muy importante para la recons-
truccion tridimensional. Los microlentes que fueron correctamente detectados estan
marcados en rojo en la figura 2.4. Como podemos ver en esta, hay una region hacia el
lado derecho que no esta siendo detectada correctamente, pero por la forma en que fue
montada la camara en realidad esta seccion corresponde a la parte baja de los micro-
lentes. Esto puede deberse a una parte de la alineacion en la deteccion en la que los
microlentes o el lente de relevo no estan correctamente ubicados a la altura que deberıa
ser o con una pequena inclinacion indeseada, o incluso que el haz de iluminacion en esta
parte de la deteccion no esta llegando como deberıa a alguno de los elementos opticos.
8 Conceptos de microscopıa
Figura 2.4: Cırculos rojos representan los microlentes detectados correctamente por elsoftware de reconstruccion.
2.4.2. Calibracion - Profundidad
Otro tipo de calibracion necesaria para el software de reconstruccion es la calibracion
de profundidad. Esta es necesaria para que al programa se le facilite el reenfoque digital
de imagenes al saber como se ven los objetos a cierta profundidad, que es una distancia
determinada medida desde el plano focal para el objeto. En el trabajo realizado por
Edmund Y. Lam en su artıculo Computational photography with plenoptic camera and
light field capture: tutorial [17], se explica que entre dos planos (x) y (u) que estan
separados a una distancia Z, se puede encontrar un plano entre ellos llamado (x′) que
esta a una distancia αZ, como se puede ver en la figura 2.5. Esta calibracion entonces
sera util para poder determinar el factor α descrito, el cual permite entonces determinar
a partir de diferentes profundidades cual deberıa ser el mejor factor de reenfoque.
Para realizar este tipo de calibracion, basta con tener 3 imagenes (aunque entre mas
imagenes se tenga se determina mejor el factor de reenfoque) de la siguiente manera:
para una micro esfera de poliestireno fluorescente de 1µm de diametro se busca el foco,
de manera que se vea lo mas pequena e intensa posible, y se toma la imagen en campo
de luz (con la camara Hamamatsu). Despues de esto, la muestra se debe mover una
2.4. ILUMINACION ESTRUCTURADA Y RECONSTRUCCION TRIDIMENSIONAL 9
Figura 2.5: Imagen de los planos (x) y (u), en los que se quiere reenfocar en un plano(x′) por un factor α. Imagen tomada de [17]
distancia especifica hacia adelante del foco y otra distancia hacia atras del foco; esto se
hace con el uso del micromanipulador, que permite mover las muestras conectadas al
capilar y el paso mınimo que puede dar el micromanipulador es de 250nm. En la figura
2.6 se ve la representacion de esta situacion, donde la imagen de la mitad es la imagen
tomada en el foco del objeto puntual, y las otras dos imagenes son los planos a dos
distancias escogidas fuera del plano focal.
Las distancias escogidas para hacer esta calibracion fueron de 10µm, de manera que
si tomamos como referencia cuando la micro esfera esta totalmente enfocada, estamos
tomando una imagen a −10µm y a +10µm.
2.4.3. Stack - Objeto puntual
La captura de imagenes haciendo un stack no es algo que se tenga que hacer cada
vez que se van a utilizar muestras, o cada vez que se va a comenzar un experimento,
por lo tanto no hace parte de las calibraciones de rutina pero sı se logra calibrar algo
con esto y es el tamano de la hoja de luz. Sin embargo, esta solo se modifica si se hace
algun cambio en el camino de iluminacion, y es por esto que no se hace tan seguido.
Para realizar un stack se deben seguir pasos similares a los de la calibracion de
profundidad que se mencionaron anteriormente, pues para la micro esfera fluorescente
se tomaron 3 imagenes: −30µm, 0 (en foco) y +30µm. En este caso se necesita hacer
toma de imagenes en la proyeccion ortografica, es decir con la camara Blackfly, pero las
imagenes tomadas se hacen cada distancia mınima que puede dar el micromanipulador,
que corresponde a 250nm. Por supuesto, un recorrido cada esa distancia en nanometros
10 Conceptos de microscopıa
-x +x 0
Figura 2.6: Tres planos en los que se toma una imagen para obtener una calibracion yel factor de reenfoque. 0 corresponde al plano focal.
es un recorrido amplio en micrometros, de manera que en general al hacer un stack se
obtienen alrededor de 100 imagenes en las que se ve claramente todo el recorrido de la
micro esfera fluorescente, desde un punto donde se ve muy grande que es cuando esta
desenfocada (por ejemplo, cuando esta en −30µm), para ir enfocandose y llegar a verse
como un objeto puntual (0µm), hasta cuando nuevamente se desenfoca y vuelve a verse
un objeto grande (+30µm). Se puede imaginar esto como un cono, y justamente es lo
que se obtiene, como se vera en seguida.
Con las imagenes obtenidas, y con ayuda de FIJI, el programa de codigo abierto que
se usa para el analisis de imagenes cientıficas, podemos enfocarnos en una seccion de
las imagenes en donde se encuentra la micro esfera para luego unir todas las imagenes
que se obtuvieron en dicha region y ası ver que se forma una especie de cono, como se
puede ver en la figura 2.7. Para esta imagen se puede realizar una grafica del perfil de
intensidad y aquı mirar el ancho de esta grafica en su punto medio, lo que se conoce
en ingles como Full Width at Half Maximum (FWHM). Esto nos da el rango de niveles
por encima de la mitad del maximo de la intensidad, lo que nos indica el intervalo en
donde la micro esfera recibio mayor cantidad de luz, que va a ser justo en la region
donde se ubicaba la hoja de luz.
2.4. ILUMINACION ESTRUCTURADA Y RECONSTRUCCION TRIDIMENSIONAL 11
Figura 2.7: Stack de 1 micro esfera de poliestireno fluorescente uniendo las imagenescon FIJI
2.4.4. Light Field - Wide Field
En esta seccion, a diferencia de todas las demas, se necesita tomar unicamente una
sola imagen. El concepto de Light Field - Wide Field hace referencia la iluminacion por
hoja de luz en un campo amplio, es decir que la hoja de luz no va a estar iluminando
solamente un plano sino todo el rango del que dispone que depende de los galvos. Estos
galvos son unos espejos que gracias a un voltaje aplicado por medio de una FPGA giran
un cierto angulo y se mantienen en este hasta que se aplique un voltaje diferente. La
FPGA se controla desde el computador por un software desarrollado en LabView que
permite que los galvos se muevan en un intervalo de 40◦ variando entre los angulos desde
−20◦ hasta 20◦. Tambien permite ajustar el paso que se quiere hacer entre angulos y el
intervalo de tiempo de espera entre un angulo y el siguiente.
Como se menciono anteriormente, las imagenes que se toman aca deben ser con
todo el rango disponible. La forma de lograrlo es configurar el programa que mueve los
galvos para que haga pasos grandes (permite maximo de a 5◦) y que el intervalo de
tiempo sea muy corto (por ejemplo 10ms). Se configura tambien para que haga unas
200 repeticiones para ası mantener los galvos moviendose de un lado al otro muy rapido
en todo el rango que les es posible, de manera que las muestras que vayan a estar en
las celdas van a tener una iluminacion en un campo amplio y completa, para que ası
la camara vea como si se estuviera iluminando completamente la celda con un haz que
12 Conceptos de microscopıa
llene en la totalidad la pupila de los objetivos.
Si la toma de estas imagenes se realiza con el DMD, lo unico que hay que hacer
es poner todos los espejos encendidos para que toda la luz que les esta llegando a
estos dispositivos se refleje sobre la muestra, y como estos dispositivos tienen unas
dimensiones de 15mm por 21mm, lo que es suficiente para llenar la pupila trasera del
objetivo e iluminar la muestra en su totalidad.
2.4.5. Light Field - Light Sheet
L
Figura 2.8: Iluminacion estructurada por franjas. ` corresponde al tamano de la hojade luz, y L al rango total en el que se va a analizar la imagen.
Finalmente, se obtienen imagenes de iluminacion estructurada por franjas. La idea
general es iluminar diferentes secciones en un rango amplio de la imagen con franjas del
grosor de la hoja de luz. En la imagen 2.8 se puede ver la representacion esquematica
de esta iluminacion, pues para un objeto (o varios) que tiene una profundidad L, se
puede iluminar en diferentes secciones con franjas determinadas, las cuales van a tener
un grosor ` que corresponde al tamano de la hoja de luz. La obtencion de una imagen
con la iluminacion de esta primera seccion de la muestra nos brinda informacion de las
franjas que fueron iluminadas en esta, y por supuesto la informacion faltante es necesaria
conseguirla desplazando las franjas y capturando una nueva imagen con las franjas en
esta siguiente posicion. En la figura 2.9 se puede ver la representacion esquematica de lo
que se acaba de describir, en donde las franjas se deben ir desplazando hasta completar
toda la imagen para poder obtener informacion completa para la muestra que se este
analizando.
2.4. ILUMINACION ESTRUCTURADA Y RECONSTRUCCION TRIDIMENSIONAL 13
Para este tipo de imagenes es donde tiene sentido haber conseguido una calibracion
de la profundidad que se menciono anteriormente en este capıtulo. Recordemos que
la muestra que se esta viendo en las figuras 2.8 y 2.9 en realidad es una muestra
tridimensional y estas figuras estan representando su profundidad, ası que el software
que va a hacer la reconstruccion necesita saber a que distancia se estan tomando las
franjas pero previamente necesita conocer cual es el factor de reenfoque que se va a
usar dependiendo de las diferentes profundidades que tiene cada una de las franjas en
las imagenes.
Figura 2.9: Iluminacion estructurada por franjas
14 Conceptos de microscopıa
Conseguir esta iluminacion con el uso de galvos es gracias al software de LabView
que permite mover estos dispositivos. Una calibracion previa es necesaria para saber
cuanto es 1◦ de los galvos y su equivalencia en desplazamiento dado en micras sobre la
muestra. Ası, se puede ajustar que el galvo de saltos e ilumine solo ciertas regiones para
poder hacer las franjas descritas y que oscile entre estas para que sean solo esas regiones
las que tienen una mayor intensidad de iluminacion. Con la camara, se debe ajustar una
exposicion suficientemente larga para que se vea que se iluminaron diferentes secciones
y a diferentes profundidades. Toda esta informacion debe ser captada por la camara
para luego configurar las siguientes franjas y repetir el proceso.
Figura 2.10: Modelo de imagen para cargar al DMD y tener la iluminacion estructuradapor franjas
Si se realiza esta iluminacion estructurada por franjas con el uso de los dispositivos
DMD, es mucho mas sencillo en el sentido de que solo es cargar una imagen al DMD
que tenga franjas definidas. En la figura 2.10 se puede ver que tipo de imagen es la que
se necesita, que son lıneas blancas y negras de cierto grosor definido en donde lo blanco
seran los espejos encendidos y lo negro los espejos apagados. Por supuesto, la imagen
que se carga no tiene el grosor que se esta viendo en la figura 2.10 puesto que 1 pixel
corresponde a 1 micro espejo y estos miden 7, 56µm. La imagen que se usa para cargar
es entonces con franjas blancas de un grosor mucho menor al que se esta visualizando
en este documento.
CAPITULO 3
Construccion del microscopio de hoja de
luz
En este capıtulo se quiere dar a conocer los metodos de construir un microscopio
de hoja de luz que se usaron para el proyecto. Ademas se quiere tambien dar una
explicacion acerca del campo de luz, que es el metodo que se usara para detectar
imagenes y ası lograr reconstruirlas.
Microscopıa de hoja de luz
En este proyecto se trabajaron dos metodos para crear la hoja de luz. El primero
es haciendo uso de galvanometros, los cuales por medio de un voltaje, hacıan girar
unos espejos pequenos, y estos permitıan tener una funcion de voltaje contra angulo. El
segundo metodo es haciendo uso de los dispositivos DMD, los cuales son un arreglo de
espejos que permiten encenderse independientemente con tan solo cargar una imagen
a estos por medio de un programa que el mismo fabricante facilita para su respectivo
uso.
3.1. Galvanometros
En el montaje experimental se uso un Laser Oxxius de 488nm de longitud de onda.
Este laser tiene un diametro de 2mm, lo cual es un diametro demasiado pequeno para la
iluminacion de las muestras que se usaran. Primero que todo el haz debe estar alineado
16 Construccion del microscopio de hoja de luz
en todo el camino de la iluminacion hasta donde se deberıan ubicar las muestras. En la
figura 3.1 se puede ver esquematicamente que es el camino que se desea seguir con el
laser.
Figura 3.1: Esquema del montaje experimental de la iluminacion
Para la alineacion del laser primero se deben cuadrar las alturas de algunos iris a
la deseada, que para este montaje esta determinada por la base en que se monta el
laser, la cual le otorga una altura al haz de 91,4mm. Los iris son elementos opticos que
permiten ajustar su apertura desde 1,3mm hasta 36mm, dependiendo del fabricante y
del tipo de iris que se use. El intervalo de apertura mencionada corresponde a los tipos
de iris que se usaron en el laboratorio para este proyecto.
Se deben poner entre uno y dos iris para lograr trazar la lınea que se desea, y la
cantidad necesaria va a depender de si el camino del haz es muy amplio. Con estos se
logra hacer que el laser no se desvıe en ninguna direccion sino que siga una lınea recta
guiada por los huecos de la mesa; en especial, se quiere evitar que se desvıe cuando
se hace pasar por elementos opticos como lente y espejos. Esto se logra viendo que el
haz esta pasando de manera satisfactoria por los dos iris que se ubicaron a distancias
considerables. Si es necesario, un medidor de potencia optica puede ser requerido para
optimizar y conseguir el maximo de intensidad al cuadrar los espejos.
Se debe hacer que el haz del laser viaje desde su fuente hasta el punto de iluminacion
de la muestra, que estara ubicado despues del objetivo de 10X que esta en la figura ??,
3.1. GALVANOMETROS 17
en la que se puede ademas observar que hay varios espejos montados. La lınea recta
del haz desde el laser hasta despues del objetivo 10X se debe lograr solamente con
los espejos. Una parte complicada de esta alineacion fue el uso de los galvanometros.
Estos son unos espejos conectados a un motor que permiten darle un cierto angulo
dependiendo del voltaje que se les aplique. Ademas, por la forma en que estan hechos,
estos galvos le dan un poco de altura al haz original, con lo que de 91,4cm pasamos
a tener 95,1cm. Buscar el voltaje necesario para que el haz siguiera en lınea recta a
pesar de haber cambiado de altura fue lo que mas trabajo costaba en esta parte de la
alineacion. Una vez lograda la alineacion de esta manera, se dejan los iris que se usaron
en cada lınea y se procede a montar los lentes que se van a usar, uno por uno, esto con
el fin de que al montar un lente se mantenga la alineacion ya que podrıan desviar el
haz por estar mal posicionados o rotados ligeramente. Ası se controla que el haz no se
este desviando y en dado caso se puede ir haciendo las correcciones pertinentes.
Especıficamente, lo primero que se hizo despues de tener la alineacion de solo espejos
fue que se procedio a aumentar el tamano del haz de manera que toco recurrir a lo que
se conoce como un expansor de haz, Beam expander en ingles. El Beam expander se
construye a partir de la teorıa de optica geometrica de un telescopio [18]:
M =f2f1. (3.1)
Se usaron dos lentes plano convexos posicionados con sus caras planas enfrentadas,
como se puede ver en la figura 3.2. Para lograr la magnificacion, primero debe estar el
lente con la distancia focal corta, que en este caso se uso un lente de f = 8mm. Y el
segundo lente tiene que ser de una distancia focal mayor, que en este caso se uso una
distancia focal de f = 40mm; esto con el fin de que la ecuacion de magnificacion ((3.1))
sea de aumento (mayor a 1). Ası que, de acuerdo con esta ecuacion, la magnificacion
obtenida para este caso deberıa ser de 5, y ademas el haz sale colimado (ver figura
3.2) Por supuesto, se iba verificando que al montar este Beam Expander no se hubiera
danado la alineacion inicial, y en dado caso corregirla.
Para la obtencion de una hoja de luz, el elemento esencial en el montaje es el lente
cilındrico. Este tipo de lentes tiene una cara similar a la forma de un cilindro, de manera
que si se mira desde una perspectiva es convexo, mientras que si se gira 90◦ se ve recto.
Este lente debe estar montado como se ve en la figura 3.3 que muestra esquemati-
camente la optica geometrica que se cumple aquı. La idea del montaje es que desde la
18 Construccion del microscopio de hoja de luz
Figura 3.2: El haz entra por el lado A., y sale magnificado por el lado C. El punto B.es donde coincide el plano focal de ambos lentes.
Figura 3.3: Esquema de la optica geometrica con los elementos usados en este montajeexperimental. a) Vista desde arriba en la que el lente cilındrico permite que la colimaciondel haz continue. b) Vista lateral en donde el lente cilındrico hace que el haz converja.
3.2. DISPOSITIVOS DMD 19
Figura 3.4: Imagen de hoja de luz. Iluminacion: camino azul. Deteccion: camino verde.Tomada de [19]
perspectiva de arriba (3.3 a)) el haz que llega al lente siga colimado como venıa, luego
pase por el fθ y el lente de tubo de 250mm consiguiendo una magnificacion de 4,15, y
por ultimo converja despues de haber pasado por el objetivo 10X.
Cambiando la perspectiva por la vista lateral (3.3 b)), el lente cilındrico se va a
ver convexo, de manera que va a hacer que el haz converja y tenga una magnificacion
de 1,206, para luego formar otro telescopio con el lente de tubo y el objetivo 10X,
cuya magnificacion es 0,08, para que finalmente despues de por el objetivo 10X salga
colimado de este. Como se dijo inicialmente, el objetivo de construir un microscopio de
hoja de luz requiere que visto desde arriba se vea que el haz converge, ya que esto estarıa
determinando el grosor de lo que ahora llamaremos nuestra hoja de luz, mientras que si
se colima en la vista lateral se obtiene un plano. Para ilustrar mejor esta situacion, nos
remitimos a la figura 3.4, que es una de las imagenes que usan Huisken y Stainier [19]. En
esta podemos observar la hoja que ilumina una muestra en un capilar, y se ve claro que
las muestras estarıan siendo iluminadas en un solo plano y que el objetivo de deteccion
verıa justamente la parte mas delgada. Esto tambien se conoce como seccionamiento
optico.
3.2. Dispositivos DMD
Una diferencia fundamental de la iluminacion realizada con los DMD respecto a
los galvanometros es que estos ultimos permiten la iluminacion de un solo plano a la
vez como se vio en la figura 3.4, pero si se quieren iluminar varios planos los galvos se
deben poner a mover mediante software para lograr lo que se conoce como iluminacion
estructurada. Sumado a esto, la camara debe tener un tiempo de exposicion mayor para
poder captar todos los planos iluminados que se consiguen con el movimiento de los
20 Construccion del microscopio de hoja de luz
galvos.
La idea fundamental de esta seccion es buscar la iluminacion estructurada de varios
planos a la vez sin necesidad de tener una mayor exposicion ni de tener que desarrollar
un software complejo para tal fin. Aquı es donde entran en juego los microespejos DMD
(Digital Micromirror Device). Estos dispositivos son un arreglo de microespejos que se
pueden orientar individualmente para que la luz que les incide se refleje solo con los
espejos que se hayan escogido. En otras palabras, si con los espejos se escoge formar
cualquier figura (cuadrado, lınea, cırculo), la luz reflejada deberıa formar en principio
exactamente la misma figura. En particular, se usa el DMD formando franjas de lıneas
verticales.
Los dispositivos DMD se han usado por Dan et. al. [9] en super resolucion sobre
nano partıculas de oro (80nm de diametro) para poder tener franjas definidas, y don-
de ademas llevaron a cabo la iluminacion por LED (con baja coherencia); y tambien
por Nadya et. al. [10] que iluminaron celulas BPAE (celulas endoteliales de la arteria
pulmonar bovina) usando DMDs y luego hicieron la reconstruccion digitalmente.
DMD
Lente de tubo
f = 400mmObjetivo 10X
NA = 0.25
LED
Filtro pasa bandas
H
h
Objetivo 60X
NA = 1.1
Muestra
Figura 3.5: Vista lateral del esquema del montaje experimental con alturas de H =118,5mm y h = 95,5mm.
Para usar los DMD, el esquema del montaje experimental implementado se puede
ver en las figuras 3.5 y 3.6, que es la forma en que el microscopio de hoja de luz debe ser
montado. Se comienza con un LED que ilumina en un intervalo amplio (comparado con
un laser) desde 405nm hasta 505nm aproximadamente. Al frente de este debe ir un filtro
3.2. DISPOSITIVOS DMD 21
pasa bandas que hace que el intervalo de iluminacion se reduzca considerablemente, de
manera que solo ilumina entre 483nm y 493nm. Despues el haz va a ir hacia un espejo
que hara reducir la altura a la que estaba originalmente, y de este espejo llegara al
dispositivo DMD. Como se puede ver en la figura 3.5, hasta el espejo todo corresponde
a una altura H = 118,5mm.
Objetivo 10X
NA = 0.25
Lente de tubo
f=400mm
Muestra
LED
Filtro pasa bandasDMD
Espejo
Figura 3.6: Vista superior del esquema del montaje experimental de la iluminacion conlos DMD
Con respecto al DMD, este debe estar montado en un soporte que se solicito fabricar
en el taller de mecanica de la universidad, y ademas debe estar totalmente vertical. La
luz incidente que llega a este dispositivo debe estar a un angulo de ϕ = 45◦ respecto
a la vertical del DMD como se ve en la figura 3.7a), y esta a su vez debe estar a un
angulo de θ = 24◦ respecto a la normal de los microespejos como se puede ver en la
figura 3.7b); esto para que la luz que se refleja vaya justamente en la direccion de la
normal [20], ya que estas son las condiciones que el fabricante impone para asegurar la
maxima reflexion posible en estos dispositivos, que corresponde a un 88 % de reflexion
de la luz incidente. Como se menciono antes, el haz consigue una nueva altura y esa
nueva altura h es igual a 95,5mm que no cambia mas en todo el montaje y que ademas
corresponde a una altura muy cercana a la conseguida gracias a los galvanometros, en la
que su diferencia no va a ser apreciable pues los DMD iluminan una region mas amplia
y la altura mencionada es solo la altura de su centro.
22 Construccion del microscopio de hoja de luz
a)
DMD
b)
Espejoφ
h
θφ
Figura 3.7: a) Vista frontal del DMD en el que se incide la luz a un angulo de ϕ = 45◦
respecto a la vertical b) Vista diagonal del DMD en el que se evidencia que ademasdebe haber un angulo θ = 24◦ respecto a la normal del DMD
3.3. Microscopıa de campo de luz - Deteccion
Para la parte de la deteccion se puede ver esquematicamente el montaje que se llevo
a cabo en la figura 3.8. Como se puede ver, se hace uso de dos camaras: Hamamatsu y
BlackFly (BF), esto para poder ver secciones de campo de luz y ortograficas, respecti-
vamente. La forma en que se separan los caminos es usando un espejo dicroico, el cual
permite transmitir parte de la fluorescencia de la muestra hacia la camara BlackFly
cuya longitud de onda λ > 560nm es apenas la cola del espectro de emision de la
fluorescencia verde que emiten las muestras, mientras que la gran mayorıa de la fluo-
rescencia se emite en λ < 560nm y esta es la longitud de onda que se refleja y que es
util para la deteccion por campo de luz (usando la camara Hamamatsu).
En la deteccion, los otros elementos que no se habıan usado eran los microlentes y
el lente de relevo. Los microlentes son un arreglo de lentes con una distancia focal de
2000µm, que es bastante pequena, y que lo ideal es que el lente de f = 150mm que esta
antes de ellos, logren hacer imagen sobre estos para que se iluminen diferentes secciones
de ellos para que tengamos una informacion extra que con otros lentes no tendrıamos,
como el angulo que da cierta perspectiva para la imagen dos dimensional que se esta
transmitiendo al camino de deteccion. Al ser una distancia tan corta, los microlentes
3.3. MICROSCOPIA DE CAMPO DE LUZ - DETECCION 23
Figura 3.8: Esquema del montaje experimental de la deteccion
idealmente deberıan tener su plano imagen en el sensor de la camara Hamamatsu,
pero estos sensores generalmente estan mas adentro que la distancia focal tan corta
que manejan los microlentes. La solucion es el lente de relevo, que logra transportar el
plano imagen de los microlentes al sensor de la camara y que ademas no tiene ninguna
magnificacion ni nada por el estilo.
El lente de relevo esta montado con un tubo sobre la camara, de manera que no es
probable que la altura no sea la adecuada, aunque no se descarta que tenga una ligera
inclinacion sobre el tubo en el que esta montado. Por otro lado, los microlentes estan
ubicados sobre una montura 6-Axis Locking Kinematic Optic Mount de ThorLabs la
cual cuenta con 6 grados de libertad para ser ajustado, por lo que los microlentes son
bastante susceptibles a orientacion, inclinacion y posicion.
24 Construccion del microscopio de hoja de luz
CAPITULO 4
Resultados
Las imagenes obtenidas tanto por galvos como por DMD se analizan para ver si es
posible llevar a cabo su reconstruccion y tambien ver lo fiable que resultan las recons-
trucciones hechas en esta seccion.
Los problemas presentados durante este proyecto estan relacionados con el montaje
optico que se requerıa. La alineacion del haz de iluminacion es de vital importancia para
evitar cualquier desviacion del haz o incluso aberracion sobre las imagenes ya que esto
afecta demasiado en el momento en que las reconstrucciones se van a llevar a cabo. Si
se tenıa aberracion, se veıa en la camara en el momento de capturar las imagenes, que
estas no eran las mejores imagenes, pues solamente con una micro esfera fluorescente se
podıa observar que la iluminacion no era uniforme o que cuando salıan del plano focal
no salıan viendose isotropicas, lo que indicaba que algo estaba mal.
Las muestras utilizadas como objetos modelo eran micro esferas de poliestireno fluo-
rescentes de 1µm de diametro, las cuales fluorescen cuando se iluminan con luz verde
(aproximadamente 480nm de longitud de onda). Estas eran diluidas en una concentra-
cion de agarosa preparada al 1 % (por 10mg de agar, se usa 1mL de agua destilada).
La concentracion usada de micro esferas fluorescentes correspondıa a 2µL por 1,5mL
de agar si se querıa una muestra en la que se pueda encontrar una sola microesfera en
un plano, o a 20µL por 1,5mL de agar si se querıa una muestra muy densa de micro
esferas, de manera que en practicamente cualquier region del agar que se analizara se
verıan siempre al menos 3 micro esferas fluoresciendo, aunque no necesariamente en
los mismos planos. Para preparar el agar con las micro esferas ademas era necesario
calentarlo hasta los 80◦C que corresponden a la temperatura de su punto de fusion, que
26 Resultados
cuando se enfrıa se “gelifica” de manera que va a tener una consistencia suficientemente
dura para que pueda mantenerse dentro de un tubo capilar. En esta parte habıa que
tener especial cuidado con la preparacion del agar pues la concentracion al 1 % es muy
importante para que no quede muy aguado ni muy solido, sino que se logre la consis-
tencia gelatinosa con la que es adecuado trabajar. El tubo capilar se montaba luego en
uno de los soportes del micromanipulador y ası es que las muestras se podıan mover
con la precision otorgada por el micromanipulador.
Para realizar las reconstrucciones retomamos entonces lo que se describio en el
capıtulo 2 que son los siguientes requisitos:
1. Calibracion para localizar los microlentes
2. Calibracion para profundidad
3. Stack de un objeto puntual
4. Imagenes en Light Field - Wide Field
5. Imagenes en Light Field - Light Sheet
4.1. Galvos
Calibracion - Equivalencia entre micras y grados
Sabiendo que los galvos se ajustan mediante un voltaje, fue necesario encontrar el
voltaje para alinear el haz de luz de manera que la luz siguiera una lınea recta como se
describio en el capıtulo 3. Sin embargo, tambien era necesario saber que tanta distancia
se podrıa mover el haz para cuando se deseara iluminar alguna otra region. Para esto,
fue necesario ubicar una camara directamente al frente del objetivo 10X montada sobre
un tornillo micrometrico de manera que se pudiera desplazar en el eje de propagacion
del haz y de manera fina para localizar el punto donde se veıa la hoja de luz (una lınea)
sobre la camara. Fue necesario un filtro de densidad neutra para disminuir la intensidad
del haz y que no fuera nocivo para el sensor de la camara.
Una vez obtenida la lınea, se procedıa a capturar la imagen. Despues se podıa mover
los galvos cierta cantidad de grados con el software necesario para tal fin capturando
siempre las imagenes para ver la nueva posicion de la lınea, y para tener un mejor valor
se tomaron imagenes de lıneas en 5 posiciones. Por ultimo, un programa sencillo de
matlab ubicaba las posiciones en pixeles de las imagenes en donde habıa un maximo
4.1. GALVOS 27
de intensidad, y despues realizaba una regresion lineal para ası, con los parametros
adecuados de los tamanos de los pixeles (3,45µm para la BlackFly que se uso ahı),
obtener la equivalencia entre micras y grados. Este valor obtenido fue:
1◦ = 50, 98µm (4.1)
Calibracion para localizar los microlentes
Como se menciono en el capıtulo 2, se requerıa una imagen para que el programa de
reconstruccion tuviera la ubicacion de los microlentes. En la figura 4.1 se puede ver las
imagenes obtenidas para esta parte de la calibracion, donde a la derecha es la imagen
obtenida por la camara Hamamatsu y a la izquierda en rojo se indican los microlentes
que han sido detectados satisfactoriamente por el software de reconstruccion que si bien
no detecto todos los microlentes correctamente, es de las imagenes de calibracion que
mejor los ha detectado a pesar de que en un extremo se ve que no hay color rojo, lo
que indica que no fueron detectados los microlentes de esa region. Esta limitacion no
es tan grave pues las muestras generalmente se tratan de ubicar en el centro del campo
de vision, de manera que el software puede ajustar el tamano de la imagen para que
la region en la que los microlentes que no fueron detectados sea ignorada. Como estas
imagenes de calibracion son solo para la ubicacion de los microlentes, se toman una vez
por experimento y sirven para la calibracion tanto de Galvos como de DMD.
Cuadro 4.1: Imagenes de calibracion. Imagen izquierda es la imagen capturada con lacamara Hamamatsu. Imagen derecha es el reconocimiento por software de los micro-lentes.
28 Resultados
Calibracion de profundidad
Con este tipo de calibracion se lograban obtener los valores mınimos y maximos
del factor de reenfoque α que se describio en el capıtulo 2 2.5, ası como el paso que
habıa entre estos valores (∆α), los cuales nos eran utiles despues para realizar las
reconstrucciones. En los galvos en particular, se obtuvieron los siguientes valores:
αmin = 1,1
αmax = 3,76 (4.2)
∆α = 0,11
Stack de un objeto puntual - Tamano de la hoja de luz
Al realizar el Stack para la micro esfera fluorescente, se tomaron alrededor de 100
imagenes las cuales se unieron con el programa FIJI para obtener algo como se ve en
la figura 4.1. Con esto ademas se podıa obtener un perfil de intensidades que es lo que
grafico en la figura 4.2. En esta se puede ver que la intensidad maxima corresponde a
255, cuya mitad es de 127,5. FIJI permite hacer un acercamiento suficiente como para
ver cual es el intervalo de distancia en el que se tiene la mitad de la maxima intensidad,
ya que aquı nos interesa el Full width at half maximum (FWHM), y en este nos da que
es exactamente 1, 75µm que es entonces el grosor que se obtiene de la hoja de luz.
Figura 4.1: Stack de 1 micro esfera de poliestireno fluorescente uniendo las imagenescon FIJI
4.1. GALVOS 29
Figura 4.2: Grafica del perfil de la hoja de luz, de intensidad contra distancia (µm). Seuso FIJI para realizar esta grafica.
LFWF
Se procuro que las regiones escogidas para hacer la toma de datos en “Wide Field”
y en “Light Sheet” (LS) fueran siempre las mismas para poder comparar tanto la ilu-
minacion como la reconstruccion llevada a cabo sobre la misma imagen. Las muestras
usadas para estas imagenes debıan tener una densidad tal que en una misma imagen
se lograran ver mas de 5 micro esferas, que no necesariamente debıan estar en el mis-
mo plano, de manera que si habıa una micro esfera en foco, las demas podıan estar
desenfocadas adelante o atras de la que inicialmente enfocada.
En el apendice A se pueden ver las mejores imagenes reconstruidas por recuadros.
Esto se muestra ası ya que la reconstruccion da como resultado un archivo de stack,
el cual se compone de varias imagenes por las cuales es posible desplazarse para lograr
percibir la profundidad que tienen.
LFLS
La calibracion realizada en los galvos permitıa saber que 1◦ ≈ 50µm, lo cual nos
permitıa realizar simples reglas de 3 para saber las distancias y el angulo que se deseaba
mover los galvos para que se iluminaran en las regiones deseadas. En un intervalo de
50µm y con 3 franjas de iluminacion fue que se realizo la iluminacion estructurada por
hoja de luz. Tomando la micro esfera en foco como el origen (0 µm), se ilumino en
−25µm, en −8µm y en 9µm a lo largo del eje de deteccion. Como se vio en el capıtulo
30 Resultados
2, la idea de esta iluminacion estructurada es ir complementando la imagen de manera
que en las capturas que se realicen siempre se este iluminando una region distinta.
Cabe mencionar que los galvos mientras se estan moviendo mueven el haz consigo
y aunque en las posiciones en las que se desea que la iluminacion se lleve a cabo es
mas intensa, la regiones “oscuras” no van a ser del todo oscuras precisamente por el
movimiento continuo que tienen que hacer los galvos mientras oscilan.
Ver el apendice A para ver algunas de las imagenes que se lograron reconstruir.
4.2. DMD
Inicialmente se trato de hacer el montaje descrito en el capıtulo 3 3.2, el cual usaba
un led en vez Sin embargo, el led es necesario que sea colimado, que de hecho no es para
nada sencillo de hacer pues hasta el mismo fabricante advierte que por la naturaleza
de la luz del LED no es posible obtener una colimacion muy buena, sino que hay que
obtener la iluminacion no convergente y menos divergente posible, que de por sı ya
nos asegura que va a diverger por mas que tratemos de colimarlo. En la figura 4.3 se
puede ver la iluminacion al espejo mas cercano a los DMD. A pesar de verse bastante
iluminada la imagen, el haz diverge como nos lo advierten y fue la mejor “colimacion”
que se obtuvo, y al reflejarse tanto en este espejo como en los DMD, la intensidad de la
luz se reduce bastante. Esto no permitio que la iluminacion con DMD se lleve a cabo
con exito, pues a las muestras les llegaba una intensidad de luz insignificante que a
simple vista no era posible ver en la celda como la iluminacion por laser como se veıa
en la figura 2.2.
Las camaras no detectaban suficiente fluorescencia emitida debido a la poca intensi-
dad de luz que les llegaba a las muestras bajo estas condiciones, ya que como se puede
ver en la figura 4.4 la camara contrasta demasiado el ruido sobre la muestra iluminada
detectada, que se puede ver difıcilmente que hay dos micro esferas fluorescentes en la
parte de arriba de la imagen capturada, pero la senal detectada debe tener una inten-
sidad superior para poder tener un mayor contraste y ası que el ruido no se vea como
se esta viendo en esta imagen, ya que practicamente toda la imagen capturada esta
iluminada uniformemente. Es por esto que se decidio optar por una forma alternativa
de iluminar los DMD.
A partir del montaje de los galvos, dos espejos nos permiten desviar el haz de
manera que el DMD tambien sea iluminado con el laser. En la figura 4.5 se puede ver
4.2. DMD 31
Figura 4.3: Imagen de la iluminacion con LED en el espejo mas cercano a los DMD
Figura 4.4: Imagen de una micro esfera fluorescente iluminada con LED con la maximaintensidad del LED.
32 Resultados
Figura 4.5: Esquema del montaje para la iluminacion dual para Galvos y DMD. Laslıneas verdes coinciden con las alturas de la iluminacion usada en el montaje de losGalvos. Las lıneas moradas significan un cambio de altura, necesaria para cumplir quela luz incidente al DMD sea diagonalmente desde arriba.
esquematicamente la modificacion que se hizo al montaje de los galvos para que la
iluminacion por laser se pudiera hacer de las dos maneras sin afectar un montaje del
otro. Como se puede ver en esta figura, se monto un espejo despues del Beam expander
en una montura abatible de manera que si el espejo esta abajo, el montaje va a ser
iluminado con galvos, y si esta arriba, la iluminacion sera con los DMD. De esta forma
se logro desviar el haz para que llegara a un espejo que esta un poco alejado del montaje
y que este sea el que va a subir el haz para ası poder iluminar el camino marcado en
la figura 4.5 en morado, pues era muy importante recordar que la iluminacion al DMD
debe realizarse con una luz incidente formando un angulo de 45◦ respecto a la diagonal
y de 24◦ respecto a la normal, como se explico en el capıtulo 3 (3.2). En esta figura
ademas, se marcaron lıneas verdes indicando que esas alturas coinciden con el montaje
de los galvos que se uso, de manera que la luz va a llegar a la misma altura al objetivo
10X que es el que va a iluminar la muestra. Por supuesto, era necesario una montura
abatible mas que se indica en la figura que fue montada cerca al objetivo 10X de manera
que cuando se baje funcionan los DMD, y cuando se sube funcionan los galvos.
En la figura 4.6 se puede ver como se ve en el laboratorio el espejo que sube el haz
y lo lleva al DMD y ademas se puede observar como se ve la iluminacion de los DMD.
4.2. DMD 33
Figura 4.6: Montaje de la iluminacion en donde el DMD esta en funcionamiento. Ref:Apendice B, seguridad optica.
Calibracion de profundidad
Se llevo a cabo la calibracion de los DMD en profundidad teniendo todos los espejos
encendidos, despues una sola lınea de 20 espejos y una lınea de 8 espejos. La intensidad
utilizada del laser tuvo que aumentarse debido a que entre menos espejos la muestra
era iluminada con una intensidad menor, lo que aumentaba el ruido en la imagen de las
muestras. Ası, si todos los espejos estaban encendidos era posible obtener una imagen
con poco ruido con la misma intensidad del laser que se utilizaba con los galvos, que
rondaba los 3mW . Al usar la lınea de 20 espejos era necesario subir la intensidad hasta
15mW , mientras que una lınea de 8 espejos necesitaba mas de 30mW para que el ruido
no fuera importante.
Para los DMD, se obtuvieron los siguientes valores:
αmin = 1,03
αmax = 2,95 (4.3)
∆α = 0,09
34 Resultados
Stack de un objeto puntual - Tamano de la hoja de luz
Los micro espejos del DMD al tener un tamano de 7,56µm × 7,56µm, podemos
hacer un calculo sencillo para saber que tamano de hoja de luz estarıamos esperando
al elegir cierta cantidad de espejos. Para obtener algo que sea facil para la iluminacion,
consideremos 8 espejos:
8 ∗ 7, 56µm = 60,48µm,
y considerando la demagnificacion hecha por el objetivo de iluminacion, se tiene:
60,48µm
20= 3,024µm, (4.4)
lo cual nos indica que para 8 espejos se debe tener una hoja de luz de ≈ 3µm de grosor.
Figura 4.7: Stack de 1 micro esfera iluminada con 8 espejos del DMD, haciendo reduc-cion de ruido con un filtro gaussiano
Se realizo entonces el stack para una micro esfera fluorescente y a la union de las
imagenes se le redujo el ruido usando un filtro gaussiano del programa FIJI, esto con
el fin de tener un mejor suavizado y que el perfil de intensidad se vea mejor definido.
En la figura 4.7 se puede ver la union de estas imagenes y en la figura 4.8 se puede ver
el perfil de intensidad que se obtuvo para este caso, y un detalle importante a destacar
es que el FWHM de este perfil de intensidad es de 3,25µm, lo que da un valor muy
cercano con el calculo que se realizo al considerar la demagnificacion que el objetivo
provocarıa sobre la iluminacion de las muestras en la ecuacion (4.4).
4.3. COMPARACION DE LAS RESOLUCIONES 35
Figura 4.8: Perfil de intensidad de 8 espejos iluminados con el laser
LFWF
Las regiones de las muestras densas en donde se tomaron imagenes para los galvos,
tambien se usaron para los DMD. Gracias al montaje que se realizo, bastaba con girar
las monturas abatibles en las que se habıan montado los espejos para que el laser sirviera
para ambos montajes.
Ver apendice A para ver las imagenes de reconstruccion.
LFLS
En la iluminacion estructurada por franjas se escogieron tambien las mismas posi-
ciones que para los galvos, solo que en los DMD se esta mas seguro que las regiones
oscuras son realmente oscuras, pues nada tiene que oscilar sino que se encienden solo
los espejos escogidos y el haz se refleja en estos para formar una iluminacion con el
patron de espejos encendidos. En este caso, 8 espejos se escogıan como encendidos y 43
como apagados, de manera que sea comparable con lo que se realizo con los galvos para
ası tambien obtener una region oscura de aproximadamente 17µm entre las regiones
iluminadas.
En la tabla 4.2 se pueden ver una de las mejores reconstrucciones realizadas, la cual
se llevo a cabo con DMD escogiendo franjas de 8 espejos encendidos.
36 Resultados
Cuadro 4.2: Frames de la reconstruccion tridimensional por iluminacion estructuradautilizando DMD.
4.3. COMPARACION DE LAS RESOLUCIONES 37
Cuadro 4.3: Stacks de las reconstrucciones tridimensionales para imagenes obtenidascon los Galvos (izquierda) y el DMD (derecha).
4.3. Comparacion de las resoluciones
Las reconstrucciones llevadas a cabo permiten comparar la resolucion obtenida para
“Wide Field” y para “Light Sheet”. Este ultimo es en el que queremos hacer enfasis, ya
que la iluminacion estructurada es un metodo que no ha sido usado y que esperamos
obtener una mejor resolucion que la reconstruccion usando iluminacion “Wide field”.
Para esto se realiza un perfil de intensidad cerca del plano focal (lo que definimos como
el origen 0µm) y con un ajuste gaussiano logramos obtener los parametros de esta
funcion ası como tambien su desviacion estandar σ.
En la figura 4.3 podemos ver unos de los stacks obtenidos en las reconstrucciones
hechas con imagenes obtenidas tanto por los galvos como por el DMD en iluminacion
estructurada. Se esperarıa entonces que se viera un stack por franjas ya que ası fue
como la muestra se ilumino, pero en los galvos esto no se ve claro. Para la imagen del
DMD es facilmente reconocible las franjas de iluminacion, mientras que en los galvos
no hay diferencia alguna con una imagen tomada por “Wide Field”. El hecho de poder
escoger las franjas en el DMD nos da una mejor precision de los planos que se han
escogido para iluminar, mientras que los galvos al tener que oscilar para ir de un plano
al otro implica que las regiones que deberıan ser oscuras no siempre lo son.
38 Resultados
Cuadro 4.4: Ajuste Gaussiano para el perfil de intensidad de las reconstrucciones en“Wide Field” (derecha) y “Light sheet” (izquierda) para el DMD.
De manera que el resultado del ajuste gaussiano se realiza para las imagenes obte-
nidas por DMD, y estos se pueden ver en la tabla 4.4.
Gracias a los ajustes gaussianos, el parametro σ es de mucha utilidad pues permite
calcular el FWHM siguiendo la relacion que podemos encontrar en WolframMathWorld
[21], la cual nos dice que para una funcion gaussiana, el FWHM se puede calcular como:
FWHM = 2√
2 ln 2 · σ ≈ 2,3548σ, (4.5)
de manera que, segun los parametros dados por FIJI que se pueden ver en la figura 4.4
para el modelo de la funcion gaussiana, d corresponde a la desviacion estandar σ. Ası,
para los stacks obtenidos por DMD se obtiene:
σ(µm) FWHM (µm)Wide Field 88.32 207.97Light Sheet 60.83 143.24
Estos resultados nos muestras que la resolucion en “Light sheet” o iluminacion
estructurada por franjas es mejor que la resolucion de la iluminacion completa. En la
misma region, el perfil de intensidad tiene un valor menor. En la figura 4.5 podemos
ver a simple vista que para las mismas regiones de los stacks de la reconstruccion, el
FWHM de las imagenes de la izquierda (correspondientes a “Wide field”) es un poco
mas grande que las de las imagenes de la derecha (correspondientes a “Light sheet”).
4.3. COMPARACION DE LAS RESOLUCIONES 39
Cuadro 4.5: Comparacion de la resolucion de los stacks obtenidos. Imagenes de la iz-quierda: “Wide Field”. Imagenes de la derecha: “Light sheet”
40 Resultados
4.4. DMD vs Galvos
Como en este proyecto se realizo la iluminacion con dos dispositivos diferentes, aquı
se quiere resumir las ventajas y desventajas de estos dos metodos de iluminacion para
futuros proyectos que requieran de un microscopio de hoja de luz.
4.4.1. Ventajas Galvos
La intensidad de luz no se reduce significativamente, de manera que incluso el
laser con la potencia mınima es suficiente para poder iluminar muestras y capturar
imagenes, aunque no sea ideal.
No genera difraccion
4.4.2. Desventajas Galvos
Los galvos requieren de mas elementos opticos para formar la hoja de luz, tales
como el lente cilındrico y el uso de un lente fθ, con la respectiva alineacion de
estos elementos.
En general las alineaciones de un haz de luz no son nada sencillas de realizar, pero
en los galvos en particular se vuelve un poco mas tediosa ya que se debe buscar el
voltaje necesario para que el haz del laser solo se eleve verticalmente y que luego
siga un camino totalmente horizontal.
La iluminacion estructurada es bastante difıcil de lograr con los galvos puesto
que, como se menciono anteriormente, las oscilaciones se programan y se llevan a
cabo, pero el laser se mantiene encendido todo el tiempo, de manera que dificulta
obtener realmente una iluminacion estructurada apropiada.
4.4.3. Ventajas DMD
No requiere de un lente cilındrico, lente fθ y de la respectiva alineacion de estos,
lo que simplifica un poco este proceso.
La iluminacion estructurada se realiza facilmente gracias a que el software que
controla los espejos permite prender los espejos que se deseen y solo la luz se
refleja en estos. Tambien facilita la iluminacion de campo completo.
4.5. PLANES A FUTURO 41
El software que controla el DMD es mas sencillo de utilizar una vez se tienen las
imagenes de franjas
4.4.4. Desventajas DMD
Genera difraccion y hay que tener cuidado con las numerosas reflexiones que se
ven por todo el laboratorio
La intensidad del haz del laser se reduce considerablemente
La alineacion diagonal desde arriba para cumplir los requisitos de iluminacion
no es tan sencilla de realizar, especialmente porque la mayorıa de los elementos
opticos estan disenados para alineaciones en vertical u horizontal, no diagonal.
Algo importante que agregar y que no es totalmente una desventaja para los DMD es
que las imagenes de franjas requirieron un programa adicional de Matlab para generarlas
facilmente, sin el cual las franjas se debıan haber dibujado. En realidad el programa
es muy sencillo, pero si no se cuenta con cierto conocimiento para poder generar estas
imagenes por codigo, todo habrıa sido con mucho mas tiempo demandado.
Como podemos ver, los metodos usados se pueden diferenciar en estas ventajas y
desventajas. Sin embargo, como opinion y preferencia personal, el DMD es el metodo
que escogerıa para construir un microscopio de hoja de luz. Considero que la precision
de la iluminacion que se obtiene con los DMD es una ventaja muy grande para preferirlo
sobre los galvos, y ademas los resultados de las imagenes que se obtienen son mejores con
el DMD. Las desventajas del DMD son de cuidado y de constante trabajo para lograr
la iluminacion en el lugar que se desea. Lo que sı serıa un problema es que el laser usado
no tuviera intensidad ajustable, y que la intensidad por defecto sea demasiado baja;
afortunadamente este no es el caso.
4.5. Planes a futuro
Se quisiera tener la posibilidad de analizar muestras biologicas mas complejas. Las
micro esferas fluorescentes sirven como una primera aproximacion a lo que la recons-
truccion tridimensional por software logra hacer. Sin embargo, esta da lugar a que no
solo se puedan analizar muestras modelo, sino tambien organismos vivos. Los peces
cebra, por ejemplo, son uno de los seres vivos mas usados en microscopıa en especial de
42 Resultados
fluorescencia ya que su textura es transparente y muy facil de que emita fluorescencia
con la iluminacion adecuada. Serıa interesante ver como el programa da para reconstruir
no solo el animal sino tambien algunos de sus organos como el corazon, y tambien de
como su corazon se podrıa visualizar sabiendo que sus latidos son del orden de 350ms
[1].
CAPITULO 5
Conclusiones
Se desarrollo un protocolo para alinear el sistema de DMD junto con los galvos.
La hoja de luz que se logra obtener con el uso de los galvos esta mejor definida e
ilumina mejor el plano de seccionamiento optico sobre las muestras. Los DMD logran
una hoja de luz un poco mas gruesa con una lınea vertical de 8 espejos.
La iluminacion estructurada se logra mejor con el DMD puesto que los espejos pren-
didos son los que hacen posible la iluminacion por franjas, contrario al uso de los galvos
que tienen que estar en constante movimiento para lograr este tipo de iluminacion.
Ambos sistemas, tanto galvos como DMD, requieren cierta calibracion previa para
saber como determinar la distancia de profundidad a la que se va a realizar la ilumi-
nacion, en los galvos conociendo la equivalencia entre 1◦ a micras, y en el DMD la
equivalencia entre una lınea o franja de espejos a micras.
Se ha logrado la reconstruccion tridimensional de las imagenes tomadas por campo
de luz gracias al software desarrollado por el estudiante Diego Castro quien enfoco su
tesis de maestrıa a escribir el codigo de programacion para hacer esto posible.
La resolucion en los stacks de las imagenes reconstruidas de la iluminacion estruc-
turada (LFLS) mejora respecto a la iluminacion de campo completo (WF).
44 Conclusiones
APENDICE A
Imagenes de reconstruccion
En este apendice se recompilan los frames de los stacks obtenidos a partir de la
reconstruccion realizada en el software desarrollado por Diego Castro en MATLAB.
46 Imagenes de reconstruccion
A.1. Galvos
A.1.1. LFWF 1
Cuadro A.1: Frames de la reconstruccion tridimensional por “Wide Field” utilizandoGalvos.
A.1. GALVOS 47
A.1.2. LFWF 2
Cuadro A.2: Frames de la reconstruccion tridimensional por “Wide Field” utilizandoGalvos.
48 Imagenes de reconstruccion
A.1.3. LFLS 1
Frame 1/24 Frame 2/24 Frame 3/24 Frame 4/24
Frame 5/24 Frame 6/24 Frame 7/24 Frame 8/24
Frame 9/24 Frame 10/24 Frame 11/24 Frame 12/24
Frame 13/24 Frame 14/24 Frame 15/24 Frame 16/24
Frame 17/24 Frame 18/24 Frame 19/24 Frame 20/24
Frame 21/24 Frame 22/24 Frame 23/24 Frame 24/24
Cuadro A.3: Frames de la reconstruccion tridimensional por iluminacion estructuradautilizando Galvos.
A.1. GALVOS 49
A.1.4. LFLS 2
Frame 1/24 Frame 2/24 Frame 3/24 Frame 4/24
Frame 5/24 Frame 6/24 Frame 7/24 Frame 8/24
Frame 9/24 Frame 10/24 Frame 11/24 Frame 12/24
Frame 13/24 Frame 14/24 Frame 15/24 Frame 16/24
Frame 17/24 Frame 18/24 Frame 19/24 Frame 20/24
Frame 21/24 Frame 22/24 Frame 23/24 Frame 24/24
Cuadro A.4: Frames de la reconstruccion tridimensional por iluminacion estructuradautilizando Galvos.
50 Imagenes de reconstruccion
A.2. DMD
A.2.1. LFWF 1
Cuadro A.5: Frames de la reconstruccion tridimensional por iluminacion “Wide field”utilizando DMD.
A.2. DMD 51
A.2.2. LFWF 2
Cuadro A.6: Frames de la reconstruccion tridimensional por iluminacion “Wide field”utilizando DMD.
52 Imagenes de reconstruccion
A.2.3. LFLS 1 - 8 espejos
Frame 1/21 Frame 2/21 Frame 3/21 Frame 4/21
Frame 5/21 Frame 6/21 Frame 7/21 Frame 8/21
Frame 9/21 Frame 10/21 Frame 11/21 Frame 12/21
Frame 13/21 Frame 14/21 Frame 15/21 Frame 16/21
Frame 17/21 Frame 18/21 Frame 19/21 Frame 20/21
Cuadro A.7: Frames de la reconstruccion tridimensional por iluminacion estructuradautilizando 8 espejos en los DMD.
A.2. DMD 53
A.2.4. LFLS 2 - 8 espejos
Frame 1/18 Frame 2/18 Frame 3/18 Frame 4/18
Frame 5/18 Frame 6/18 Frame 7/18 Frame 8/18
Frame 9/18 Frame 10/18 Frame 11/18 Frame 12/18
Frame 13/18 Frame 14/18 Frame 15/18 Frame 16/18
Frame 17/18 Frame 18/18
Cuadro A.8: Frames de la reconstruccion tridimensional por iluminacion estructuradautilizando 8 espejos en los DMD.
54 Imagenes de reconstruccion
A.2.5. LFLS 1 - 20 espejos
Frame 1/21 Frame 2/21 Frame 3/21 Frame 4/21
Frame 5/21 Frame 6/21 Frame 7/21 Frame 8/21
Frame 9/21 Frame 10/21 Frame 11/21 Frame 12/21
Frame 13/21 Frame 14/21 Frame 15/21 Frame 16/21
Frame 17/21 Frame 18/21 Frame 19/21 Frame 20/21
Cuadro A.9: Frames de la reconstruccion tridimensional por iluminacion estructuradautilizando 20 espejos en los DMD.
A.2. DMD 55
A.2.6. LFLS 2 - 20 espejos
Frame 1/18 Frame 2/18 Frame 3/18 Frame 4/18
Frame 5/18 Frame 6/18 Frame 7/18 Frame 8/18
Frame 9/18 Frame 10/18 Frame 11/18 Frame 12/18
Frame 13/18 Frame 14/18 Frame 15/18 Frame 16/18
Frame 17/18 Frame 18/18
Cuadro A.10: Frames de la reconstruccion tridimensional por iluminacion estructuradautilizando 20 espejos en los DMD.
56 Imagenes de reconstruccion
APENDICE B
Seguridad optica
El laser usado fue:
LBX-488-100-CSB: 488nm Laser Diode Module
Este laser tiene dos etiquetas de clase que son indicadores del grado de peligro al
que se expone al usarlo. Estas clases estan definidas a partir de la longitud de onda, el
tiempo de exposicion y la potencia.
Especıficamente, para este laser las etiquetas de clase son las siguientes:
Cuadro B.1: Imagenes tomadas del manual del laser [22]
Como se puede ver en las etiquetas, esto nos indica que la vision directa al haz del
laser es peligrosa, e incluso puede ser nociva para la piel. De manera que, a pesar de
que la mesa esta a una altura inferior de la vista de cualquier persona, puede haber
reflexiones que lleguen a la altura de los ojos de las personas. Es por esto que se deben
tener precauciones con el equipamiento adecuado como lo son las gafas de seguridad
de laser certificadas (Certified Laser Safety Glasses). Estas gafas tienen un porcentaje
de transmision del 48 % de la luz visible, ademas de que su densidad optica (Optical
Density OD) es de 7,0+, lo que indica que transmite unicamente el 0,00001 % de la luz
58 Seguridad optica
que llega en la longitud de onda en el intervalo 180nm hasta 532nm [23]
El uso de estas gafas fue esencial durante el desarrollo de este proyecto, en especial
porque si nos fijamos en la grafica 4.6 en el capıtulo 4, podemos ver que el laser al
ser apuntado al DMD reflejaba la luz en varias direcciones. Trabajar con los galvos era
relativamente mas seguro, pero aun ası las gafas son un elemento esencial para trabajar
con cualquier laser; ademas este tenıa indicaciones de precaucion que no debıan ser
ignoradas.
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