mÉtodos cromatogrÁficos

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MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

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INTRODUCCIÓNLa Cromatografía es una técnica de análisis químico

utilizada para separar sustancias puras de mezclas complejas.

Esta técnica depende del principio de adsorción selectiva.

La cromatografía fue descubierta por el botánico ruso, de origen italiano, Mijaíl Tswett en 1906, pero su uso no se generalizó hasta la década de 1930.

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En general, se emplea una fase estacionaria y una fase móvil.

Las separaciones están basadas en las diferencias en la velocidad de migración, entre los componentes de la muestra.

La fase móvil puede ser líquida o gaseosa.

Tswett separó los pigmentos de las plantas (clorofila), vertiendo extracto de hojas verdes en éter de petróleo, sobre una columna de carbonato de calcio en polvo en el interior de una probeta.

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CLASIFICACIÓN

Cromatografía en columna

La fase estacionaria se mantiene dentro de un tubo angosto y la fase móvil es forzada a pasar a traves del tubo, bajo presión o por gravedad.

Cromatografía planar

La fase estacionaria está sostenida por una placa plana o en los poros de un papel, la fase móvil se mueve por capilaridad o gravedad.

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Clasificación general

Método específico

Fase estacionaria

Tipo de equilibrio

Cromatografía líquida (CL)

Líquido-líquido, o partición

Líquido-fase unida

Líquido sólido o adsorción

Intercambio de iones

Exclusión por tamaños

Líquido adsorbido sobre un sólido

Especies orgánicas unidas a una superficie sólida

Sólido

Resina de intercambio iónico

Liquido en intersticios de un sólido polimérico

Partición entre líquidos inmisciles

Partición entre líquido y superficie unida

Adsorción

Intercambio iónico

Partición/tamizado

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Clasificación general

Método específico

Fase estacionaria

Tipo de equilibrio

Cromatografía gaseosa (CG)

Cromatografía fluida supercrítica (CFS)

Gas-líquido

Gas-fase unida

Gas-sólido

Líquido adsorbido sobre un sólido

Especies orgánicas unidas a una superficie sólida

Sólido

Especies orgánicas unidas a una superficie sólida

Partición entre gas y líquido

Partición entre líquido y superficie unida

Adsorción

Partición entre fluido supercrítico y superficie unida

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tiempo

Señal en eldetector

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VELOCIDADES DE MIGRACIÓN DE LOS SOLUTOS

En la separación de solutos, la efectividad de la columna cromatográfica, depende en parte de las velocidades relativas a las cuales las especies son eluidas.

Estas velocidades son determinadas, a su vez, por las relaciones de partición de los solutos entre las dos fases.

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Relaciones de partición

La separación se basa en diferencias del grado de distribución, de los solutos, en la fase móvil y la estacionaria.

Para una especie A

La constante de equilibrio K para esta reacción se llama relación de partición o coeficiente de partición.

Amóvil Aestacionaria

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Coeficiente de partición

En donde:Cs =concentración molar analítica de un soluto en la

fase estacionaria Cm= Concentración analítiva en la fase móvil

Idealmente, la relacón de partición es constante en un intervalo amplio de concentraciones de soluto; Cs es directamente proporcional a Cm.

K = Cs / Cm

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Tiempo de retención

tM

tR

tM = tiempo muertotR = tiempo de retención

Velocidad lineal promedio de migración del soluto, vv = L / tR

L = longitud del empaque en la columna

Velocidad lineal promedio, u, de las moléculas de la fase móvilu = L / tM

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La velocidad de migración de un soluto es función de la relación de partición así como una función de los volumenes de las fases estacionaria y móvil.

v = u X_____1_____1+ KVS / VM

_____1_____1+ KVS / VM

= fracción de tiempo en el que el soluto transcurreen la fase móvil

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Factor de capacidad

Parámetro experimental, se emplea para describir las velocidades de migración de solutos en columnas.

En una especie a el factor de capacidad es k’A

k’A = KA VS

VM

v = u X 1 _ 1+ k’A

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v = u X 1 _ 1+ k’A

v = L / tR

u = L / tM

L / tR = L / tM X 1 _ 1+ k’A

tR – tM

k’A = tM

tR y tM se obtienen a partir de un cromatogramaCuando k’A es <1 la elución es rápida.Cuando k’A > 20-30 los tiempos de retención son largosCuando k’A esta entre 1 y 5, la separación es ideal.

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Los factores de capacidad (k’),en la cromatografía gaseosa se pueden variar cambiando las temperaturas y el empaque de la columna.

En la cromatografía líquida los factores de capacidad (k’) pueden manipularse, variando la composición de la fase móvil y de la fase estacionaria.

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Factor de selectividad (velocidades relativas de migración)

=KB / KA = k’B / k’A

KA es la relación de partición de la especie que es eluida más rápidamente.

k’B y k’A son los factores de capacidad para B y para A, cuya sostitución, con respecto a tiempos tenemos:

=

Esta expresión puede detrminarse a partir de un cromatograma experimental.

(tR)B – tM

(tR)A - tM

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Eficiencia de la columna

N= L/HH =altura de un plato N =numero de platos teóricosL =longitud del empaque de la columna

La eficiencia de las columnas se incrementa a medida que se hace mayor el N y a medida que H se hace menor.

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Altura de plato, H

La eficiencia de la columna se refleja en la anchura de los picos cromatográficos.

H = 2 / L

(L - 1) (L + 1)

L = desviación estandar2 = varianza

= LW / 4tR

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Numero de platos, N

A partir de un cromatograma se puede determinar N

tM

tR

tM = tiempo muertotR = tiempo de retención

Wtiempo

N = 16 tR 2

W

W= anchura del pico en su base, en unidades de tiempo

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Variables que afectan la eficiencia de la columna

Velocidad de flujo de la fase móvil.El grado de ensanchamiento de la banda depende del tiempo

en que la fase móvil está en contacto con la fase estacionaria. La eficiencia máxima de la cromatografía de liquidos, ocurre a velocidades inferiores que las requeridas para la cromatografía de gases.

Las columnas en CG pueden tener una longitud de 50m o más, mientras que las de CL no pueden ser más largas de 25-50cm, debido a la elevada presión de las gotas sobre ellas.

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Otras variables

Si se disminuye el tamaño de la particula del empaque se incrementa la eficiencia de la columna, empleando capas más delgadas de la fase estacionaria y abatiendo la viscisidad de la fase móvil.

El incremento de la temperatura también reduce el ensanchamiento de la banda en la mayoría de los casos.

0.6-0.8mm

0.1-0.15mm

5 Velocidad lineal cm/s 20

AlturaDe plato

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RESOLUCIÓN DE COLUMNAS

Medición cuantitativa, en una columna, de la capacidad para separar analitos.

Rs= =

La resolución para una fase estacionaria dada se puede mejorar alargando la columna, incrementando el numero de platos, sin embargo, se requira más tiempo para la resolución.

2ZWA + WB

2((tR)B – (tR)A) WA + WB

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Resolución

Rs= 0.75

Rs= 1

Rs= 1.5A

A

A

B

B

B

//

//

////

WA WB

tM

(tR)A Z

Tiempo

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APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFÍA

La cromatografía es una herramienta para la separación de especies quimicas estrechamente relacionadas.

Puede emplearse para la identificación cualitativa (presencia o ausencia de componentes) y la determinación cuantitativa (comparación con estandares) de especies separadas.

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Análisis cuantitativoAltura de pico.Debe controlarse la temperatura de la columna la velocidad del eluyente la velocidad de inyección Errores relativos del 5-10%

Area de pico. El area de pico es inependiente de los efectos de las variables anterioresEs más satisfactorio y las areas se determinan facilmente

Calibración con estandaresMétodo de estandar internoMayor presición, el pico del estandar debe estar separado pero cercano al pico del analito Error relativo 0.5-1%

h

h

Wa

Para picos simetricosA= h*a

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CROMATOGRAFÍA DE GASES

Registrador

ElectrómetroO

puente

Sistema de adquisición

de datos

Detector

Columna

Inyector

Jeringa

Suministro del gas acarreador

Regulador de presión

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Suministro de gas acarreador

El gas debe ser quimicamente inerte. He, Ar, N2 e H2.

Se contienen en tanques presurizados.Se requieren reguladores de presión,

calibradoresy medidores de flujo para controlar la velocidad.

Presiones de entrada: 0.7 – 3.5 Kg /cm2

Velocidad de flujo: 25-50 mL/min.

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Inyección de muestras

La inyección lenta o en cantidad exesiva causan el ensanchamiento de la banda y una resolución pobre.

Se utilizan microjeringas calibradas para inyectar muestras liquidas o gaseosas.

El inyector debe mantenerse a una temperatura alrededor de 50°C por arriba del punto de ebullición del componente menos volátil.

Para columnas empacadas normales el tamaño de muestra oscila desde decimos de L a 20 L.

Las columnas capilares requieren menor cantidad de muestra.

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Columnas tubulares abiertas, capilares

Son fabricadas de vidrio o sílice fundida, tienen diametros interiores de 0.25 a 0.50mm y longitudes de 25 a 50m. La fase estacionaria se encuetra fija en la superficie interna.

Los capilares de silicio tienen paredes más delgadas que los tubos metálicos, y estan recubiertos de poliimida lo que le da mayor resistencia. Por ser flexibles y fuertes, pueden enrrollarse en bobinas. La mayor ventaja de éstas columnas es su mínima tendencia a adsorber moléculas de analitos.

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Termoestática L atemperatura de la columna debe controlarse (hasta en

décimos de grado) para reproducir los tiempos de retención.

La columna embobinada se guarda en una estufa de temperatura ajustable.

La temperatura depende de los puntos de ebullición de los componentes de la mezcla.

Para mezclas con intervalos amplios de puntos de ebullición, es necesario un programa para el control de temperatura.

La resolución óptima se da a bajas temperaturas, pero resultan tiempos de elución largos.

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Efecto de la temperatura sobre los cromatogramas

2 4

31

7

86

5x4

12

45

6 78

93

|0 10| 20| 30| tiempo, min

|0° |60° |90° |120° |150° |180° temperatura, °C

Isoterma a 45°C

Isoterma a 145°C

Programa de 30 a 180°C

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Detectores 1. CARACTERÍSTICAS DEL DETECTOR IDEAL

El detector ideal en cromatografía de gas tiene las siguientes características:

Sensibilidad adecuada: Lo que constituye la sensibilidad adecuada no puede describirse en términos cuantitativos. En general, las sensibilidades de los detectores actuales están en el rango de 10-18 a 10-15 g de analito/s.

- Buena estabilidad y buena reproducibilidad.

- Una respuesta lineal al analito por encima de varios órdenes de magnitud.

- Un rango de temperatura del cuarto de por lo menos 400 °C.

- Un tiempo de la respuesta corto, independiente de proporción de flujo.

- Alta fiabilidad y facilidad de uso.

- Similitud en respuesta, muy predecible y selectiva hacia uno o más clases de analitos.

- No destructivo.

- El ruido de fondo bajo y facilidad de funcionamiento

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CLASIFICACIÓN DE DETECTORES

Hay muchos tipos de detectores que se usan en cromatografía de gases. La razón para esta variedad involucra la necesidad de los sistemas de detección de proporcionar respuestas selectivas a los grupos particulares de compuestos, simplificando los cromatogramas de las muestras complejas. Los diferentes detectores dan diferentes tipos de selectividad. El grado de selectividad puede clasificarse como sigue.

No-selectivo (o universal) los detectores responden a todos los compuestos que difieren del gas acarreador : TCD

Los detectores selectivos responden a un rango de compuestos que tienen algún químico común o una propiedad física: ECD, NPD, FPD,

Los detectores específicos responden a un solo compuesto químico.

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Detectores dependientes de la concentración: TCD, ECD, FID

Además la selectividad, los detectores pueden clasificarse según la forma en que responden a la cantidad de analito que atraviesa.

Los detectores producen una señal que se relaciona con el tiempo y la concentración de soluto presente en gas acarreador, en un punto.

Normalmente son no-destructivos y así que pueden usarse en serie con otros detectores.

Su respuesta se expresa en unidades de señal por la concentración del analito. Debido a su sensibilidad a la respuesta del analito, cualquier dilución del effluente de la columna con un gas bajará la respuesta.

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Detectores dependientes del flujo de masa: FID, NPD, FPD

Estos detectores producen una señal que se relaciona a la proporción a la que las moléculas del soluto entran en el detector.

Estos detectores normalmente generan una señal como resultado de algún proceso destructivo que ocurre en las moléculas del soluto.

Su respuesta se expresa en unidades de señal por el flujo de masa del analito.

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Detectores

Detector de Ionización de llama (FID) Detector Nitrógeno Fosforoso (NPD) Detector de Captura de electrón (ECD) Detector de Conductividad termal (TCD) Detector fotemetrico de Llama (FPD) Detector de Emisión atómica (AED) Detector de Fotoionization (PID) Detector de Conductividad eléctrica (ELCD) Detector de espectrometría de masas (MS)

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FIDEl FID es uno de los

detectores ampliamente usados, generalmente aplicables para cromatografía de gases. Es fácil de usar pero es destructivo de la muestra. FID’s consisten en una llama de hidrogeno/aire y un plato colector.

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FID

El efluente de la columna, se mezcla con hidrógeno y aire, y entonces es encendido eléctricamente. La mayoría de los compuestos orgánicos producen iones y electrones que pueden conducir electricidad a través de la llama.

Hay un electrodo sobre la llama que es colector de los iones formados a una llama de hidrogeno/aire. El número de iones que llegan al colector es moderado y se genera una señal.

La cantidad de iones producida es aproximadamente proporcional al número de átomos del carbono reducidos presente en la llama y del número de moléculas.

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FIDLos grupos funcionales, como carbonil, alcohol, halógeno, y amina,

rinden menos iones o ninguno en una llama. Además, el detector es insensible hacia gases incombustibles como H2O, CO2, SO2 y NOx.

Selectividad: Compuestos con enlaces C-H. Una respuesta pobre para compuestos organicos que contienen poco o nada de hidrógeno (ej., hexachlorobenzeno).

Sensibilidad: 0.1-10 ng Gases: Combustión - el hidrógeno y aire; Composición - helio o

nitrógeno Temperatura: 250-300 ÆC; 400-450 ÆC para los análisis de

temperatura altos.

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TCDUn TCD es un detector muy primitivo utilizado en cromatografía de

gases y todavía tiene amplias aplicaciones. Se basa en los cambios de la conductividad térmica de un flujo de

gas. Cambios en conductividad térmica por la presencia de analitos. Las

moléculas orgánicas causan un aumento de temperatura en el elemento, que se da como un cambio en resistencia.

El TCD no es tan sensible como otros detectores pero es no-específico y no-destructivo.

La ventaja del detector, es su simplicidad, su rango dinámico lineal grande, su respuesta general a las especies orgánicas e inorgánicas y su carácter no destructivo que permite la colección de solutos después de la detección.

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TCDUna célula del descubridor contiene un filamento

eléctricamente acalorado cuya la temperatura a poder eléctrico constante depende en la conductibilidad termal del gas circundante.

Las conductividades térmicas de helio y hidrógeno son seis a diez veces mayor que aquellas de la mayoría de los compuestos orgánicos.

Así, en la presencia de incluso cantidades pequeñas de materiales orgánicos, representa una disminución relativamente grande en la conductividad térmica del efluente de la columna; por consiguiente, el descubridor sufre un marcado aumento en su temperatura.

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El circuito del puente permite amplificación de

cambios de resistencia debido a analitos que pasa sobre el termoconducción

de la muestra y no amplifica cambios en resistencia que ambos

juegos de producto de los detectores debido a

fluctuaciones de

proporción de flujo

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TCDSelectividad: Todos componen salvo el gas

del portador

Sensibilidad: 5-20 ng

Gases: Composición – igual que el gas acarreador.

Temperatura: 150-250 °C

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ELCDLos compuestos son mezclados

con un gas de la reacción y atraviesan un tubo de reacción de alta temperatura. Se crean productos de la reacción específicos qué se mezcla con un solvente y atraviesan una celda de conductividad electrolítica. El cambio en la conductividad electrolítica del solvente es moderado y se genera una señal.

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ELCD

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ELCD

Selectividad: Los halógenos, azufre o nitrógeno que contienen compuestos. Único en un momento.

Sensibilidad: 5-10 pg (halógenos); 10-20 pg (S); 10-20 pg (N)

Gases: Hidrógeno (halógenos y nitrógeno); el aire (azufre)

Temperatura: 800-1000 °C (halógenos); 850-925 °C (N); 750-825 °C (S)

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ECDDetector de captura de electrónes (ECD) opera en

mucho de la misma manera como un medidor de radiación-X.

Aquí el efluente de la columna pasa por un -emisor, como 63Ni o tritium (absorbido en platino o lamina del titanio). Un electrón del emisor causa ionización del gas del portador (a menudo el nitrógeno) y la producción de un estallido de electrones.

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ECDEl detector de captura de electrónes fue el primer detector

selectivo inventado para el cromatografía de gas.

La cámara interior del detector se diseña tan pequeño como sea factible y está radiado con un beta-emisor radiactivo contenido es una lamina sellada. La fuente normalmente es 3H o 63Ni.

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ECD

• Selectividad: Halógenos, nitratos y carbonilos

• Sensibilidad: 0.1-10 pg (en compuestos halogenados); 1-100 pg (nitratos); 0.1-1 ng (carbonilos)

• Gases: Nitrógeno o argón / metano

• Temperatura: 300-400 °C