marcadores moleculares 1)marcadores genéticos 2)categorías de preguntas 3)desde aloenzimas a ngs

Marcadores Moleculares

1) Marcadores genéticos

2) Categorías de preguntas

3) Desde aloenzimas a NGS

Marcador Carácter o rasgo detectable, variable y diferenciable

Marcador genético Un carácter de un individuo que se transmite a su descendencia… por lo tanto, permite diferenciar entre individuos/población/taxa

- Difieren en la cantidad de variabilidad que ilustran. Ajustar el tipo de marcador a cada problema y su escala espacial.

- Tipos de marcadores: codominantes (patrones de bandas distinguibles en homocigotos y en heterocigotos), dominantes.

- Los marcadores difieren en el tipo de herencia: . ADN nuclear biparental. ADN citoplásmico (mtDNA; cpDNA) uniparental.

Categorías de preguntas

Entre especies: filogeografía/filogenia

Entre poblaciones: Conectividad, estructura, filogeografía

Individuos: parentesco, endogamia, consanguinidad

Dentro de poblaciones: Tamaño poblacional, demografía

AABB

C

DC

D

1

2

3

4

DNA

CromosomaIndividuo

Alelo a un locus

Población

Especie

Alozimas: Formas alternativas de una enzima que difieren en la secuencia de sus aminoácidos, Se reconoce por electroforesis o alguna propiedad

Marcador Codominante

. Permite indentificar distintos alelos de proteínas (enzimas) en base a su tasa de migración en un gel de almidón

. Cálculo de frecuencias génicas

. Utilizadas para comparar poblaciones

Marcadores Bioquímicos

Preparación y corrida del gel

Inoculación de las muestras previamente preparadas que contienen el universo total de proteínas presentes en un tejido

Corrida electroforética

Corte y tinción específica del gel

Análisis: Distintos paquetes computacionales

(Biosys, Genepop, Popgene, Arlequin, Genetix, etc)

Las distintas proteínas migran según:

. Su carga neta

. Su peso molecular

Locus: ESTERASA

DIVERSIDAD GENÉTICA:

Número de alelos

Frecuencia de cada alelo

Heterocigocidad

Locus: ESTERASA

DIVERSIDAD GENÉTICA:

Número de alelos 2

Frecuencia de cada alelo

A1: 24/50 A2: 26/50

Heterocigocidad 12/25

A1

A2

Proteína dimérica

Proteínas monoméricas conformada por dos loci

L1

L2

Categorías de preguntas

Entre poblaciones: Conectividad, estructura, filogeografía

Individuos: parentesco, endogamia, consanguinidad

Dentro de poblaciones: Tamaño poblacional, demografía

1

2

3

¿Una técnica del pasado?

Ventajas: • Relativamente sencilla e implementable

Desventajas: • Proteínas fácilmente se denaturan (mantenerlas a –70°C)

• Menor grado de variación que la secuencia de DNA

• A pesar de ser genes funcionales se asume su “Neutralidad”

• Muchas mutaciones pueden pasar inadvertidas (código genético degenerado o Aa con igual carga y tamaño)

¿Una técnica del pasado?

Marcadores Moleculares

Marcadores genéticos basados en la secuencia del ADN, permiten detectar varición genética.

Ventajas:

- Muestras fijadas en alcohol (Nitrógeno liquido, -80°C)

- Distintos tipos de muestras/muestreos

Marcadores Moleculares

COLECTAS DE ORGANISMOS ACUÁTICOS

BAHAMAS

Antarctica

COLECTAS DE ORGANISMOS NO ACUÁTICOS

TECNICAS DE MUESTREO

• MUY invasivo (= muerto)

• Invasivo (= sangre, biopsias, trocitos de tejidos)

• No invasivo

MUESTREO MUY INVASIVO

MUESTREO NO MUY INVASIVO

* Cotones de algodón comercial, esterilizadas mediante autoclave.MUESTREO CASI NO INVASIVO

TECNICAS DE MUESTREO NO INVASIVO

• Muestra de museo• Carcasas• Pelos• Plumas• Cáscara de huevo• Fecas

¡Confirmar especie!

Contaminación

COLECTAS BOTÁNICAS

Material para extracción de ADN

Sílica geloSecar rápido

Conservar en frío -N2 líquido

Material para extracción de ARN-Proteinas

http://lem.dm.cl

¡Por fin en el laboratorio!

Preparación de DNA

Las metodologías de extracción de DNA buscan:

• Maximizar la recuperación de DNA• Remover inhibidores• Remover e inhibir las nucleasas• Maximizar la calidad del DNA obtenido

Cuanto DNA se puede obtener:

• Célula diploide humana 6pg de DNA• Espermatozoides contienen 3pg de DNA

Lisis celular

Remoción de proteínas

Precipitación

• SDS, sarcosyl• CTAB

• Proteinasa K• Lisozimas

• Frío• Sonicación• Molienda

Química

Enzimática

Mecánica

Alcoholes • Ethanol• Iso-propanol

• Fenol• Cloroformo

• Cloruro de sodio• Acetato de Sodio

• Membrana

Solventes orgánicos

Salt

Unión al ADN

Preparación de ADN

ADN PCR

Métodos basados en PCR

Polymerase Chain Reaction

Problema: ¿como conseguir suficientes copias de un gen para

poder manipularlo y observarlo?

PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa.

Reacción de extención de partidores (cebadores, primers) utilizada para amplificar regiones específicas del ADN.

95ºC 95ºC 72ºC 72ºC

50-65ºC

4ºCx 35 (ciclos)

5’ 30’’

45’’

1’ 4’

8

G T C T T G G G C T A G C G CA C G C G C C G G G T C A G A A C C C G A T C G C G

5’3’

5’T G C G C G G C C C A

3’

. Polimerasa

. Nucleótidos (A, T, C, G)

. Primers

95ºC 95ºC 72ºC 72ºC

50-65ºC

4ºCx 35 (ciclos)

5’ 30’’

45’’

1’ 4’8

G T C T T G G G C T A G C G CA C G C G C C G G G T C A G A A C C C G A T C G C G

5’3’

5’T G C G C G G C C C A

3’

95ºC 95ºC 72ºC 72ºC

50-65ºC

4ºCx 35 (ciclos)

5’ 30’’

45’’

1’ 4’8

Denaturación

G T C T T G G G C T A G C G C

A C G C G C C G G G T C A G A A C C C G A T C G C G 5’3’

5’T G C G C G G C C C A

3’

95ºC 95ºC 72ºC 72ºC

50-65ºC

4ºCx 35 (ciclos)

5’ 30’’

45’’

1’ 4’8

Denaturación

G T C T T G G G C T A G C G C

A C G C G C C G G G T C A G A A C C C G A T C G C G 5’3’

5’T G C G C G G C C C A

Anealing

5’T G C G C G G C

Primer 3’

3’C G A T C G C G

Primer

3’

5’

95ºC 95ºC 72ºC 72ºC

50-65ºC

4ºCx 35 (ciclos)

5’ 30’’

45’’

1’ 4’8

Denaturación ExtensiónAnealing

G T C T T G G G C T A G C G CA C G C G C C G G G T C A G A A C C C G A T C G C G

5’3’

5’T G C G C G G C C C A

3’

G T C T T G G G C T A G C G CA C G C G C C G G G T C A G A A C C C G A T C G C G

5’3’

5’T G C G C G G C C C A

3’

PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa

Electroforesis

Microsatelites

Secuencias simples repetidas en tandem a nivel del ADN sin función conocida extremadamente variables

También conocidos como SSR (Simple Sequence Repeats)

SSR Mononucleotídica (A)11 ctgttgAAAAAAAAAAAtgagag

SSR Dinucleotídica (GT)6 ccaagtGTGTGTGTGTGTtgaat

SSR Trinucleotídica (CTG)4 cagagtCTGCTGCTGCTGgtaat

SSR Tetranucleotídica (ACTC)4 actgtACTCACTCACTCACTCtgaat

Microsatélites (SSR)

Secuencia de microsatélite (CA)5 Alelo A

Secuencia de microsatelite (CA)3 Alelo B

Dir

ecció

n d

e la

el e

ctr

ofo

resis

Especímen A

Especímen B

Homocigotos:…CGTAGCCTTGCATCCTTCTCTCTCTCTCTCTATCGGTACTACGTGG… (CT)7

…CGTAGCCTTGCATCCTTCTCTCTCTCTCTCTATCGGTACTACGTGG… (CT)7

Heterocigotos:…CGTAGCCTTGCATCCTTCTCTCTCTCTCTCTATCGGTACTACGTGG… (CT)7

…CGTAGCCTTGCATCCTTCTCTCTCTCTCTCTCTCTATCGGTACTACGTGG… (CT)9

TTCTCTCTCTCTCTCTAT (CT)7

TTCTCTCTCTCTCTCTAT (CT)7

TTCTCTCTCTCTCTCTAT (CT)7

TTCTCTCTCTCTCTCTCTCTAT (CT)9

TTCTCTCTCTCTCTCTCTCTAT (CT)9

TTCTCTCTCTCTCTCTCTCTAT (CT)9

TTCTCTCTCTCTCTCTAT (CT)7

TTCTCTCTCTCTCTCTAT (CT)7

TTCTCTCTCTCTCTCTAT (CT)7

TTCTCTCTCTCTCTCTCTCTAT (CT)9

TTCTCTCTCTCTCTCTCTCTAT (CT)9

TTCTCTCTCTCTCTCTCTCTAT (CT)9

(CT)7(CT)9

(CT)7

(CT)9

Ventajas• Marcador codominante

• Uso relativamente simple

• En general son “neutros” al efecto de la selección natural

• Alta precisión en la determinación de alelos

• Altamente variables Muchos alelos por locus (polimórficos)

Desventajas• Requieren diseño de partidores especie-específicos (seq masiva)

• Requieren de un secuenciador para el análisis de fragmentos

• Dinámica evolutiva desconocida

• Bandas stutter y alelos nulos complican su análisis

• Exhiben significativos niveles de Homoplasia

Categorías de preguntas

Entre poblaciones: Conectividad, estructura

Individuos: parentesco, endogamia, consanguinidad, analisis forense

Dentro de poblaciones: Tamaño poblacional, demografía

1

2

3

RAPD (Random Amplified Polimorphism DNA)

Polimorfismo de secuencia en el sitio del partidor

Especímen A Especímen B

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 01 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 11 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0

Matriz de datos es llevada a al programa TFPGA

. Amplificación al azar de partes del genoma (partidores universales cortos al azar, 8 a 10 pb). Se detecta polimorfismo sólo en donde no amplifica (no hay banda) Cambios en las zonas donde se pegan los partidores. Permite amplificar fragmentos entre 200-2000pb. Permite amplificar varios loci al mismo tiempo. Marcador dominante (presencia/ausencia)

Homocigoto Heterocigoto Homocigoto

X XX

Marcador Dominante

Ventajas• Fácil y barato• Aproximación multilocus• No requiere el diseño de partidores específicos• Permite analizar un gran número de loci a nivel genómico• Su variabilidad es neutra a los efectos de la selección natural

Desventajas

• Baja diversidad alélica (sólo 2 alelos)• No se pueden detectar heterocigotos Dominante• Alto nivel de Homoplasia:

. Dos bandas de igual tamaño pueden tener distintas secuencias

. Ausencia de banda puede ser producto de una o varias mutaciones

• Exhibe graves problemas de reproducibilidad y poco comparables• En muchos casos son imprecisos• Técnicas y analíticas

Categorías de preguntas

Entre poblaciones: Conectividad, estructura

Dentro de poblaciones: Tamaño poblacional, demografía

2

3

AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

. Técnica popular que permite detectar una gran cantidad de marcadores de ADN polimórficos rápidamente.

. Involucra una digestión con enzimas de restricción y dos rondas de PCR

. Permite detectar presencia-ausencia de fragmentos de restricción.

ADN

C G T A A C C G C A T T G G

C A A T T C C G T T A A G G

AATTC

G

T

AATTTAA

Adaptador EcoR I

TA

Adaptador Mse I

Ventajas

• Aproximación multilocus• No requiere el diseño de partidores específicos• Permite analizar un gran número de loci a nivel genómico• Su variabilidad es neutra a los efectos de la selección natural

Desventajas

• Baja diversidad alélica (sólo 2 alelos)• Marcador dominante No se pueden detectar heterocigotos• Alto nivel de Homoplasia

- Dos bandas de igual tamaño pueden tener distintas secuencias- Ausencia de banda puede ser producto de una o varias

mutaciones en la zona de corte de la enzima de restricción• Requiere de ADN de alta calidad y pureza

Categorías de preguntas

Entre poblaciones: Conectividad, estructura

Dentro de poblaciones: Tamaño poblacional, demografía

2

3

Marcadores asociados a la secuenciación del ADN

Reacción de secuenciación de Sanger

Es similar a una PCR:

• Utiliza un sólo primer y a la polimerasa para producir secuencias de hebra simple de DNA

• Incluye nucleótidos normales (A, C, G, T) para extensión y dideoxinucleótidos (terminación).

A

A

AA

A A

AG

A

T

CC

C

C

CC

CT

TT

T

TG

G

G

G

G

G

Regular Nucleotides Dideoxy Nucleotides

AA

AA AT

CC

CT

TT

TG

G

G

G

G

1. Marcados2. Terminadores

Sanger Sequencing

5’T G C G C G G C C C A

Primer

A C G C G C C G G G T ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?5’3’

Sanger Sequencing

A C G C G C C G G G T C A G A A C C C G A T C G C G 5’3’

5’T G C G C G G C C C A

Primer

G T C T T G G G C T

Sanger Sequencing

G T C T T G G G C T A G C G CA C G C G C C G G G T C A G A A C C C G A T C G C G

5’3’

5’T G C G C G G C C C A

Primer

G T C T T G G G C T5’T G C G C G G C C C A 21 bp

Sanger Sequencing

A C G C G C C G G G T C A G A A C C C G A T C G C G 5’3’

G T C T T G G G C T A G C G C5’T G C G C G G C C C A

G T C T T G G G C T5’T G C G C G G C C C A 21 bp

26 bp

5’T G C G C G G C C C A

Primer G T C T T G G G C T A

Sanger Sequencing

A C G C G C C G G G T C A G A A C C C G A T C G C G 5’3’

G T C T T G G G C T A G C G C5’T G C G C G G C C C A

G T C T T G G G C T5’T G C G C G G C C C A 21 bp

26 bp

5’T G C G C G G C C C A G T C T T G G G C T A 22 bp

5’T G C G C G G C C C A

Primer G

Sanger Sequencing

A C G C G C C G G G T C A G A A C C C G A T C G C G 5’3’

G T C T T G G G C T A G C G C5’T G C G C G G C C C A

G T C T T G G G C T5’T G C G C G G C C C A 21 bp

26 bp

5’T G C G C G G C C C A G T C T T G G G C T A 22 bp

5’T G C G C G G C C C A G 12 bp

5’T G C G C G G C C C A

Primer G T C T T G G G C

Sanger Sequencing

A C G C G C C G G G T C A G A A C C C G A T C G C G 5’3’

G T C T T G G G C T A G C G C5’T G C G C G G C C C A

G T C T T G G G C T5’T G C G C G G C C C A 21 bp

26 bp

5’T G C G C G G C C C A G T C T T G G G C T A 22 bp

5’T G C G C G G C C C A G 12 bp

5’T G C G C G G C C C A G T C T T G G G C 20 bp

5’T G C G C G G C C C A

Primer G T C T T

Sanger Sequencing

A C G C G C C G G G T C A G A A C C C G A T C G C G 5’3’

G T C T T G G G C T A G C G C5’T G C G C G G C C C A

G T C T T G G G C T5’T G C G C G G C C C A 21 bp

26 bp

5’T G C G C G G C C C A G T C T T G G G C T A 22 bp

5’T G C G C G G C C C A G 12 bp

5’T G C G C G G C C C A G T C T T G G G C 20 bp

5’T G C G C G G C C C A G T C T T 16 bp

A C G C G C C G G G T ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?5’3’

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? C5’T G C G C G G C C C A

? ? ? ? ? ? ? ? ? T5’T G C G C G G C C C A 21 bp

26 bp

5’T G C G C G G C C C A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? A 22 bp

5’T G C G C G G C C C A G 12 bp

5’T G C G C G G C C C A ? ? ? ? ? ? ? ? C 20 bp

5’T G C G C G G C C C A ? ? ? ? T 16 bp

Sanger Sequencing

5’T G C G C G G C C C A G T C T T G G G 19 bp

5’T G C G C G G C C C A G T C T T G G G C T A 22 bp

G T C T T G G G C T5’T G C G C G G C C C A 21 bp

5’T G C G C G G C C C A G T C T T G G G C 20 bp

5’T G C G C G G C C C A G 12 bp

5’T G C G C G G C C C A G T 13 bp

5’T G C G C G G C C C A G T C T T 16 bp

5’T G C G C G G C C C A G T C 14 bp

5’T G C G C G G C C C A G T C T 15 bp

5’T G C G C G G C C C A G T C T T G 17 bp

5’T G C G C G G C C C A G T C T T G G 18 bp

Lase

r R

eader

Sanger Sequencing

GTCTTGGGCTA

Método automático de secuenciación

ResultadoCada reacción de secuenciación nos entrega un cromatograma, ~600-1000 bp:

Variabilidad de la secuencia de ADN

ATTCGCTATCGAACGCTACGCTGCGAACGGG

ATTCGTTATCGAACGCTACGCTGCGAACGGG

ATTCGCTATCGAA- - -TACGCTGCGAACGGG

ATTCGCTATCGAACGCCGCTACGCTGCGAACGGG

ATTCG- - - -CGAACGCTACGCTGCTATCGAACGGG

Sustitución

Deleción

Repetición

Transposición

Además:

• Errores de apareamiento de cromosomas• Ruptura / fusión de cromosomas (o partes)

Mitosis y Meiosis Transmisión bi-parental(mutaciones (fusion de gametos)y recombinación)

Solo Mitosis Transmisión mono-parental(solo mutaciones) (maternal)

Dos grandes diferencias entre ADN nuclear y ADN cytoplasmatico

Tipo de herencia

Tasa de mutación Menor Mayor

Análisis ComplejoTransformación yClonación

Simple

DNA Nuclear (nucDNA) vs DNA Mitocondrial (mtDNA)

nucADN mtADN

Forma Linear Circular

Número de copias 2 por célula Miles por célula

Tamaño Variable (6x109) 16,5Kbp

Tipo de herencia Biparental‘H’ de machos y hembras. Ventaja en estudios (filopatria)

Uniparental‘H’ linajes maternos

Número de alelos Diploide *Más de un locus

1 haplotipoVentaja en coalescencia

Recombinación SiVarios locus

No1 Locus

Estabilidad Baja Alta

Categorías de preguntas

Entre especies: filogeografía/filogenia

Entre poblaciones: Conectividad, estructura, filogeografía

Dentro de poblaciones: Tamaño poblacional, demografía

AABB

C

DC

D

2

3

4

Usos potenciales de los distintos tipos de marcadores en ecología, filogeografía y filogenia

Nivel Jerárquico

Identidad genética

Parentesco

Poblaciones coespecíficas

Especies relacionadas

Niveles taxonómicos intermedios

Separaciones profundas

Electroforesis Secuencia Secuenciación DNA fingerprintde proteinas DNA/RNA mtDNA, scnDNA, intrones, RAPD, AFLP

Adecuado, altamente informativo

Marginalmente informativo

No apropiadoTomado de Sunnucks, 2000 TREE

Desarrollo de nuevas técnicas en Biología Molecular

• Avances en Bioinformática y de los tiempos requeridos para el análisis de una enorme cantidad de datos

Se asocia a la identificación-caracterización de genes transcritos y traducidos que responden a presiones de selección.

Han aumentado la capacidad de comprensión de los mecanismos de adaptación y especiación.

Aproximaciones “OMICAS”

NGS “Next generation sequencing”

Genómica: estudio de la función de los genomas.

Transcriptómica: estudia el conjunto de moléculas de ARNs (mARN, rARN, tARN y ARN no codificante), en una célula o un conjunto celular. Permite obtener un perfil de la expresión génica global bajo condiciones específicas.

Proteómica: se encarga de caracterizar el conjunto de proteínas, en especial sus estructuras y funciones.

Metabolómica: estudio sistemático de las huellas químicas o metabolitos que dejan los procesos celulares específicos.

Ventajas

• Permite la búsqueda y obtención de partidores para:- Microsatélites- Genes

• Aumentan la cantidad de loci para trabajar

• Permite ampliar las preguntas y grupos a estudiar

Desventajas• Precio

• Bioinformatica avanzada

• Capacidad de análisis numérico

Comparación de métodos de secuenciación NGS

Video!

Dos técnicas interesantes

• RAD sequencing

• RNA seq Transcriptoma

RAD sequencing

SNPs = Single Nucleotide Polimorphism

• Un SNP es un cambio en una base dentro de una secuencia

• Se estima 1 SNP por 1000 bases en un genoma

• Puede o no alterar la estructura de la proteina (posición codón)

• Base de datos SNP para humanos (http://www-genome.wi.mit.edu/snp/human/)

RNA seq

RNA seq

Dos aspectos pueden ser estudiados

• Variaciones en genes expresados

• Expresión diferencial entre individuos