la duplicaciÓ del dna i la biosÍntesi de...

LA DUPLICACIÓ DEL DNA i LA BIOSÍNTESI DE PROTEÏNES

1er Batxillerat

La duplicació del DNA i la biosíntesi de les proteïnes

● La duplicació del DNA. Investigacions i propietats.

● Mecanismes de la duplicació.● La transcripció del DNA.● La traducció o biosíntesi de proteïnes

Introducció● L’ADN durant la vida de la cèl·lula té dues funcions:

– Transmetre la informació que conté a la descendència. (Replicació o duplicació)

– Expressar la informació que conté en forma de proteïnes. (Transcripció i traducció)

Dogma central de la biologia molecular

Flux de la informació genètica

Flux de la informació genètica en eucariotes

La duplicació o replicació del DNA

Procés mitjançant el qual a partir d'una molècula de DNA de doble hèlix se'n sintetitzen dues de idèntiques.

La molècula “progenitora” serveix de “motlle” per a la síntesi de la seva còpia.

La replicació té lloc necessàriament cada cop que es divideix una cèl·lula i constitueix una etapa del seu cicle de vida.

Hipòtesis sobre la duplicació del DNA

● Hipòtesi conservadora.● Hipòtesi semiconservadora

(Watson i Crick)● Hipòtesi dispersiva.

● Molècula DNA progenitora

Hipòtesi replicació conservadora

● Molècules DNA filles

Molècula amb els dos filaments parentals. La molècula parental es conserva.

Molècula amb els dos filaments de nova síntesi

Hipòtesi replicació semiconservadora

Cadascuna de les molècules filles conté un filament parental i un filament de nova sítesi.

● Molècula DNA progenitora

● Molècules DNA filles

● Molècula DNA progenitora

Hipòtesi replicació dispersiva

● Molècules de DNA després d'un cicle de replicació

Les molècules filles estan formades per dos filaments cadascun dels quals conté segments parentals i segments de nova síntesi.

DNA parental

Molècules filles després d'un cicle de replicació

Molècules filles després de dos cicle de replicació

Hipòtesi conservadora

Hipòtesi semiconservadora

Hipòtesi dispersiva

Experiments que van portar a coneixer el mecanisme de replicació del DNA

● 1957 Meselson i Stahl● 1956 Kornerg● 1963 Cairns● 1968 Okazaki

● Experiment que demostra la hipòtesi correcta sobre la duplicació del DNA:1957 Meselson i Stahl.

Clica damunt la foto per veure una animació de l'experiment i de les conclusions !!

● Cultiven bacteris d'Escherichia coli en un medi amb N15 (isòtop del nitrogen N14 amb un neutró més i per tant de major pes). Els bacteris incorporen el nitrogen pesat N15 en el seu DNA.

● Després passen aquests bacteris a un medi amb N14, (isòtop comú del nitrogen i més lleuger). Qualsevol DNA nou que sintetitzin els bacteris a partir d'ara serà més lleuger que el parental.

Experiment de Meselson i Stahl

● Cada 20 minuts, extreuen bacteris del medi que conté N14, i procedeixen a la separació del DNA per un procés de centrifugació pel gradient de densitat.

Meselson i Sthal van utilitzar la centrifugació en gradient de densitat per distingir entre el DNA pesat carregat amb N15 del DNA lleuger carregat amb N14.

Centrifugació per gradient de densitat

Resultats obtinguts per Meselson i Stahl després de 2 cicles de replicació

Meselson i Stahl arriben a la conclusió que la replicació del DNA segueix el model semiconservador al comparar el que els hi va sortir amb el que hauria d'haver sortit si les hipòtesis correctes fossin la conservadora o la dispersiva.

Clica damunt l'esquema per veure una explicació de l'experiment !!

● Resultat:

1956, Kornberg:

– Comença l’estudi sobre els mecanismes pels quals es produeix la duplicació del DNA.

– Aïlla l'enzim DNA-polimerasa de l’Escherichia coli.

● Aquest enzim és capaç de sintetitzar DNA in vitro.

El sentit de creixement dels nous filaments

DNA patró

DNA encebador

Com pot la DNA-polimerasa sintetitzar DNA?

● La DNA polimerasa és incapaç de sintetitzar una cadena de DNA de novo.

● L'enzim l'únic que pot fer és afegir nucleòtids a l'extrem 3' lliure d'una cadena preexistent (anomenada DNA encebador).

● A més l'enzim necessita una cadena patró (motlle) a la que copiar de forma complementària.

La DNA-polimerasa necessita:

● Desoxiribonucleòtids 5'-trifosfat lliures en el medi (dATP, dGTP, dCTP i dTTP)

● Un DNA encebador (”primer”).

● Una cadena de DNA patró o motlle.

Nucleòtids lliures

DNA polimerasa

DNA patró DNA encebador

Mg2+

Extrem 5' Extrem 3' Extrem 5' Extrem 3'

DNA polimerasa

Extrem 5'

Extrem 3'

Desoxinucleòtid trifosfat

Desoxiribosa

Fosfat

Extrem 3'

Extrem 5'

Com que la DNA-polimerasa només pot unir els nucleòtids al carboni 3’ lliure del “primer” la nova cadena sintetitzada només pot créixer en sentit 5’→3’, essent la cadena patró el filament 3’→5’.

Cadena nova Cadena motlle Cadena nova Cadena motlle

El nou filament sintetizat per la DNA polimerasa serà complementari i antiparal·lel al filament 3’→5’

Experiment de Cairns (1963)Objectiu: observar la duplicació del DNA in vivo

● Cairns deixa creixer, durant dues generacions, bacteris de Escherichia coli en un medi amb nucleòtids radiactius (timina tritiada, TH3), els quals emeten partícules β capaces d'impressionar una placa fotogràfica.

● Quan els bacteris es divideixen incorporen la timina marcada en el seu nou DNA, fet que permet localitzar les noves molècules de DNA sintetitzat.

Formes observades en les fotografies després d'un cicle de replicació:

● Cada 3 minuts es realitza una autoradiografia del DNA bacterià fins obtenir la seqüencia completa, primer d'una replicació del DNA, que dura aproximadament uns 30 minuts, i després d'una segona replicació.

● Les imatges inicials tenien forma de V; les posteriors, de mitja lluna, i les finals semblaven cercles aixafats.

– Les formes en V Cairns les va anomenar forquetes de replicació, formades pels dos nous filaments de DNA tritiat sintetitzats sobre la doble cadena antiga que s'havia escindit en dos per poder servir de motlle.

– Les formes de mitja lluna les va anomenar bombolles de replicació.

– Les formes circulars van fer possible deduir a Cairns que el DNA d'Escherichia coli era circular.

• Les autoradiografies obtingudes després de la 1a generació presenten imatges de punts formant un cercle.

• En les autoradiografies corresponents a la 2a generació s'observen imatges de punts en forma de lletra θ (theta) que mostraven una zona interior amb doble quantitat de punts.

Cairns interpreta que el DNA de Escherichia coli és circular, que es replica de forma semiconservativa i que existeix un únic origen de replicació.

• Posteriorment als experiments de Cairns es confirma que la replicació en E. coli té un unic origen de replicació i que a més és bidireccional: a partir de l'origen de replicació (OriC) avança en els dos sentits.

• En eucariotes la replicació del DNA també és bidireccional però a diferencia dels bacteris té lloc a partir de molts orígens de replicació.

Recapitulem!!!Propietats de la replicació

● És semiconservadora: les dues cadenes de DNA inicials se separen i cadascuna serveix de motlle per a la síntesi, segons la complementarietat de bases, d'una nova cadena antiparal·lela.

● Comença en uns llocs concrets anomenats orígens de replicació:

– En bacteris, hi ha un únic origen de replicació: es diu que la replicació és monofocal.

– En eucariotes, hi ha molts orígens de replicació: és diu que la replicació és multifocal.

● És bidireccional: és a dir, a partir de l'origen de replicació avança en els dos sentits.

Dilema 1:

Si la DNA-polimerasa necessita un “primer” o “DNA encebador”, de quina manera es sintetitza aquest “primer”?

Tots aquests descobriments fets van plantejar en el seu moment dos dilemes...

Dilema 2:Si la DNA polimerasa només pot unir nucleòtids a l'extrem 3' del “DNA primer”, de quina manera és pot sintetitzar la cadena 3’→5’ a partir de la cadena patró 5’→3’ ?

1968 Okazaki. Descobreix uns fragments (anomenats fragments d'Okazaki) constituïts per uns 50 nucleòtids de RNA i entre 1000 i 2000 nucleòtids de DNA que van donar solució als dilemes plantejats.

Els fragments d'Okazaki

RNA DNA

5' 3'

● Els fragments d'Okazaki són sintetitzats per una RNA-polimerasa (també anomenada primasa), que no necessita encebador, i per una DNA-polimerasa, en direcció 5’→3’ sobre diferents regions d'una cadena patró 3’→5’.

(cadena líder)

(Cadena retardada)

3' 5'DNA patró

Fragment d'Okazaki

Fragment d'Okazaki

DNA patró Inici síntesi RNA Síntesi RNA «primer»

Allargament del RNA «primer» per una DNA polimerasa

Bombolla de replicació (2 forquetes de replicació)

Bombolla de replicació (2 forquetes de replicació)

La síntesi de DNA es produeix en les dues cadenes simultàniament, però en direccions oposades. La replicació del DNA en una forqueta de replicació comença quan la molecula de DNA de cadena doble es desenrotlla per proporcionar dos motlles de cadena simple.

La síntesi de DNA es continua en una cadena motlle i discontínua en l'altra.

● Solució al dilema 1.“Primer” o encebador de RNA: és sintetitzat per la RNA-polimerasa (primasa) la qual no necessita cap encebador per poder sintetitzar fragments de RNA. Després el RNA serà eliminat i substituït per DNA.

● Solució al dilema 2. Els fragments d’Okazaki.

● Nou dilema:

Si el DNA d’una cèl·lula no té fragments de RNA en la seva estructura, què passa amb el RNA dels fragments d'Okazaki?

Enllaç animació forquetes de replicació

(molt recomanable !!!)

Activitat exonucleasa 5’→3’ de la DNA polimerasa. La DNA polimerasa elimina el «primer» en direcció 5’→3’ i omple el buit deixat amb nucleòtids nous complementaris mitjançant la seva activitat polimerasa 5’→3’

Activitat de la DNA lligasa. L'enzim estableix un enllaç covalent entre el 3'-OH de l'últim nucleòtid afegit per la DNA polimerasa i el 5'-P del fragment d'Okazaki següent. L'ATP aporta l'energia necessària per aquesta unió.

A T C G A A C C G T T G C A C C G T T G C A C

U A G C T T G G C A A C G T G

Síntesis continua de la cadena 5’→ 3’

Síntesis continua de la cadena en dirección 5'3'. La síntesis de esta cadena no plantea ningún problema. Así, una vez separadas ambas cadenas, se sintetiza el primer y la ADN pol. III (una de las enzimas que unen los nucleótidos) va a elongar la cadena en dirección 5'3'.

A T C G A A C C G T T G C A C C G T T G C

T A G C T U G G C A A C G T G

Síntesis discontinua de la cadena 3’ → 5’

AACCCGGT

Síntesis discontinua. La cadena complementaria no se va a replicar en sentido 3'5' sino que se replica discontinuamente en dirección 5'3'. Primero se sintetiza el primer (ARN) y posteriormente este se elonga con ADN. El ARN es posteriormente eliminado y los diferentes fragmentos sintetizados, llamados fragmentos de Okazaki, son unidos entre sí.

DNA replication

Enllaç d'interès: