ingeniería de anticuerpos
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Ingeniería de Anticuerpos Inmunogenética, tema 4.
Daniel Pérez-Witzke, MSc
Laboratorio de Patología celular y molecular,
Centro de Medicina Experimental, IVIC
Producción de anticuerpos: tecnología de hibridomas
von Behring y Kitasato antisueros, 1890Köhler y Milstein MoAb, 1975
Importante: calidad, integridad y plegamiento del Ag
Péptidos sintéticosProteínas purificadas
CélulasCélulas transfectadas
P3X63Ag8.653ATCC
PEG-1500
IGH locus 14q32.33 (1250kb)
82-88 (123-129) genes
7 subgrupos c/u 27 genes
6 genes
9 genes
Repertorio: 77-84 (170-176) genes
IGK locus 2p12 (1820 kb) IGL locus 22p11.2 (1050 kb)
35 (76) 29-32 (70-71) genes
5 4-5 (11) genes
1 4-5 ( 7-11) genes
Dis
tal c
lust
er4
00
kb 3
6 g
enes
Pro
xim
al c
lust
er6
00
kb 4
0 g
enes
IGK IGL
¿Cómo obtener proteínas?
1. Fuente orgánica original: células, tejidos, órganos
2. Técnicas del ADN recombinante
Células expresan proteínas
Extracción ARNm
RT-PCR= ADNc
PCRamplificación gen!
Clonación: Vectores – B. competentes
Expresión en sistemas biológicos
Producción a gran escala [Bioreactor]
Consumo Humano
Elaboración de Anticuerpos recombinantes y proteínas de fusión
Diseño
Construcción y transfección
Producción a escala de laboratorio
Purificación
Caracterización estructural
Caracterización funcional
Banco de datos en línea
• Protein Data Bank-RSCB http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do
RCSB PDB - Query Results.pdf
RCSB Protein Data Bank - RCSB PDB - 4L4J Structure Summary.pdf
• Uniprot www.uniprot.org
Ig gamma-2 chain C region - Homo sapiens (Human).pdf
• The European Bioinformatics Institute (EMBl-EBI) http://www.ebi.ac.uk/
Elaboración de Anticuerpos recombinantes y proteínas de fusión
Diseño
Construcción y transfección
Producción a escala de laboratorio
Purificación
Caracterización estructural
Caracterización funcional
Mutagénesis sitio dirigida
SOEing
Phage display
PCR (convencional)
Abatacept (CTLA4-Fcγ1): Artritis Reumatoide (pacientes refractarios)
Etanercept (TNFR-Fcγ1): Artritis Reumatoide, artritis psoriatica, psoriasis “plaque”, artritis reumatoide poliarticular juvenil.
Belatacept (CTLA4-Fcγ1): Lupus E.S. (pacientes refractarios)
Insulinas recombinantes:(Diabetes mellitus)
1. Insulin aspart2. Insulin glulisine3. Insulin lispro
Rituximab (αCD20 MoAb): Linfomas B
Herceptin (αHER2 MoAb): Cáncer de mama (adenocarcinoma)
Cetuximab (αEGFR MoAb): Cáncer colorectal, cáncer de cabeza y cuello
Humulin (insulina recombinante): diabetes
Aldesleukin (rIL-2): cáncer renal metastásico, melanoma
Eritropoyetina (rEPO): anemia crónica, mileodisplasia, anemia causada por falla renal o el uso de quimioterapia, preparación preoperatoria
Filgrastim (rG-CSF): neutropenia en SIDA, neutropenia en post-trasplante de médula ósea y post-quimioterapia, neutropenia crónica severa
Oprelvekin (rIL-11): prevención de trombocitopenia severa especialmente antes de recibir quimioterapia
Elaboración de Anticuerpos recombinantes y proteínas de fusión
Diseño
Construcción y transfección
Producción a escala de laboratorio
Purificación
Caracterización estructural
Caracterización funcional
Paso 1 Descongelación
T-25 T-75 T-150
Paso 2 cultivo
estacionario
Paso 3 Botella rodante
Producción
Paso 2 Spinner 250 ml
Paso 3 Expansión 500ml – 1lt
Paso 4:Cosechar Sobrenadante
Monitoreo Producción
ELISA
Elaboración de Anticuerpos recombinantes y proteínas de fusión
Diseño
Construcción y transfección
Producción a escala de laboratorio
Purificación
Caracterización estructural
Caracterización funcional
Paso 1. Cromatografía
Paso 3 Diálisis en PBS
Paso 2 recolección fracciones
Lecturas 260/280nm
Paso 4 Determinación concentración
Purificación
Fracción
(dilución)μg/ml Abs280nm
E1 2.14
(1:225) 30,776
E2 1.176
(1:200) 60,855
E3 0.155
(1:225) 27,176
E4 0.042
(1:25) 10,32
Elaboración de Anticuerpos recombinantes y proteínas de fusión
Diseño
Construcción y transfección
Producción a escala de laboratorio
Purificación
Caracterización estructural
Caracterización funcional
Literatura
• Fuenmayor J, Perez-Vazquez K, Perez-Witzke D, Penichet ML, Montano RF. (2010). Decreasedsurvival of human breast cancer cells expressing HER2/neu on in vitro incubation with an anti-HER2/neu antibody fused to C5a or C5a desArg. Mol Cancer Ther. 9(8): 2175
• Fields C, et. Al. (2013). Creation of recombinant antigen-binding molecules derived fromhybridomas secreting specific antibodies. Nature Protocols 8(6): 1125
• Presta L. (2008). Molecular engineering and design of therapeutic antibodies. Current Opinion inImmunology 20: 460
• Wu C, et. Atl. (2007). Simultaneous targeting of multiple disease mediators by a dual-variable-domain immunoglobulin. Nature Biotechnology 25(11): 1290
• Almagro J, Fransson J. (2008). Humanization of Antibodies. Frontiers in Bioscience 13: 1619• Kito M, et. At. (2002). Construction of engineered CHO strains for high-level production of
recombinant proteins. Appl Microbiol Biotechnol 60:442
• Hennie Hoogenboom (2005). Selecting and screening recombinant antibody libraries. NatureBiotechnology 23(9): 1105
• Gabriele Proetzel, Hilmar Ebersbach. Methods in Molecular Biology: Antibody Methods and Protocols. © Springer Science+Business Media (2012)
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